王 軍，劉紅羽，徐高青，呂文發(fā)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，吉林省反芻動物繁育生物技術(shù)與健康養(yǎng)殖工程實驗室，吉林長春 130118）

腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子（Kisspeptin）對牛卵巢顆粒細胞凋亡的影響

王 軍，劉紅羽，徐高青，呂文發(fā)*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，吉林省反芻動物繁育生物技術(shù)與健康養(yǎng)殖工程實驗室，吉林長春 130118）

腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子（Kisspeptin）在顆粒細胞上有表達，但其對顆粒細胞凋亡的作用尚不清楚，本試驗旨在利用流式細胞術(shù)和熒光定量PCR的技術(shù)研究Kisspeptin對牛卵巢顆粒細胞凋亡的影響。向DMEM-F12培養(yǎng)液中分別添加0、100 nmol/L的Kp-10培養(yǎng)牛顆粒細胞，24 h后收集細胞，用流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡和細胞周期，用熒光定量PCR技術(shù)檢測Caspase-3、Bcl-2、Fas和Fasl 的mRNA表達。結(jié)果表明：Kisspeptin可顯著促進牛顆粒細胞凋亡，且伴隨著Caspase-3、Fas和Fasl mRNA 表達上調(diào)及Bcl-2 mRNA表達下調(diào)（P＜0.01）；流式細胞分析表明，Kisspeptin可使牛顆粒細胞在G1期增加、S期下降（P＜0.05）。研究結(jié)果說明，Kisspeptin可促進牛顆粒細胞凋亡，這一作用可能通過上調(diào)促凋亡基因Caspase-3、Fas、Fasl和下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表達實現(xiàn)。

Kisspeptin；牛；顆粒細胞；凋亡

腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子（Kisspeptin）是由KiSS-1基因編碼的多肽類激素，前身為Metastin，水解產(chǎn)生 Kisspeptin-54、Kisspeptin-14、Kisspeptin-13和Kisspeptin-10（Kp-10），這些產(chǎn)物具有相似的生物學(xué)功能，并通過G蛋白耦聯(lián)受體GPR54發(fā)揮作用[1]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)Kisspeptin在雞、人、犬、牛和大鼠的卵巢顆粒細胞上有表達[2-3]，并呈現(xiàn)一定的階段特性，表明Kisspeptin在顆粒細胞上發(fā)揮重要作用。Huma等[4]研究發(fā)現(xiàn)，Kisspeptin在獼猴腫瘤細胞和胚胎干細胞中發(fā)揮抗增殖和促凋亡作用，但Kisspeptin對哺乳動物卵巢顆粒細胞凋亡的作用尚不清楚。本試驗利用流式細胞和熒光定量PCR等技術(shù)研究了Kisspeptin對牛顆粒細胞凋亡的影響，為揭示Kisspeptin對顆粒細胞凋亡的調(diào)控作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 從剛屠宰的母牛腹腔內(nèi)提取卵巢，放入含37℃生理鹽水保溫杯中，3 h內(nèi)運回實驗室。

1.2 主要試劑 DMEM-F12培養(yǎng)液（Hyclone），胎牛血清（BBI），Kp-10蛋白（Millipor），細胞周期試劑盒（BD Pharmingen），細胞凋亡試劑盒（BD Pharmingen），胰蛋白酶（Gibco），TRUzol Reagent（LIFE），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA），熒光定量試劑盒（TAKARA）。

1.3 牛卵巢顆粒細胞培養(yǎng) 用生理鹽水沖洗牛卵巢1～2遍，隨后用37℃的PBS洗3～4遍。選擇卵巢表面直徑為2～8 mm的卵泡抽吸卵泡液，吸取后液體經(jīng)200目過濾篩除去卵母細胞，按2×105個細胞／mL進行接種，在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁良好后向培養(yǎng)液中分別添加0（對照組）、100 nmol/L的Kp-10（Kp-10組），培養(yǎng)24 h后收集細胞，用于流式細胞和熒光定量PCR分析。

1.4 細胞周期檢測 取對數(shù)生長期細胞，胰酶適度消化細胞，500×g離心5 min棄上清。PBS吹勻，清洗2次。加入1 mL 70%（預(yù)冷）乙醇中，封口膜封口。4℃固定過夜。500×g 離心5 min，PBS洗2次。加PI/RNase約0.5 mL，37℃避光孵育15 min。用300目（孔徑40～50 μm）尼龍網(wǎng)過濾，上機檢測。

1.5 細胞凋亡檢測 取適量胰酶，將貼壁的顆粒細胞消化下來。用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次。加入1×的Binding Buffer調(diào)整細胞濃度為106～107個/mL。取100 μL細胞混合溶液，加入1.5 mL離心管中。加入5 μL的Annexin V溶液和5 μL PI染色液，再加入稀釋液，調(diào)整細胞濃度為106個/mL。漩渦震蕩1 min，使以上2種溶液充分混勻、溶解。在25℃暗室中孵育15 min。加入200 μL的1×的Binding Buffer，充分溶解。于1 h內(nèi)進行檢測。激發(fā)波長為545 nm，獲得熒光數(shù)值后直接用機器自帶BD Accuri C6軟件分析。

1.6 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 顆粒細胞培養(yǎng)于6孔板中，每孔加入1 mL Trizol提取總RNA，最后用20 μL DEPC處理水進行溶解，用超微量分光光度計測定細胞總RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄試劑及條件：水14 μL、RT Enzyme mix 1 μL、Primer mix 1 μL、5×RT Buffer 4 μL，共20 μL。37℃ 2 min，42℃15 min，85℃ 5 s。

1.7 實時熒光定量 PCR 利用Trizol法提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用軟件Primer Premier 6.0設(shè)計Bcl-2、Caspase-3、Fas和Fasl及β-actin（內(nèi)參）基因的熒光定量PCR引物，利用NCBI Primer Blast驗證合格后，送至上海生工合成，引物信息見 表 1。 通 過 Mx3000P（Agilent Technologies，USA）和TaKaRa SYBR Premix Ex Taq反應(yīng)體系進行熒光定量PCR反應(yīng)。20 μL 反應(yīng)體系中含 SYBR Primix Ex Taq10 μL、ROX reference dye 0.4 μL、上下游引物各0.8 μL、cDNA 2 μL和滅菌去離子水8 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 s，變性95℃5 s，退火溫度持續(xù)34 s，延伸95℃ 15 s，共40個循環(huán)。

1.8 統(tǒng)計分析 組間差異性比較用SPSS17.5 軟件進行t檢驗，數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，P＜0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Kisspeptin對牛顆粒細胞周期的影響 實驗選用100 nmol/L的Kp-10處理牛卵巢顆粒細胞24 h，利用流式細胞儀檢測顆粒細胞周期變化。從圖1可以看出，與對照組相比，實驗組G0/G1期（細胞靜止期和DNA合成前期）細胞比例顯著上升，S期（DNA合成期）細胞比例顯著下降（P＜0.05），G2/M期（有絲分裂期）細胞比例無顯著變化。

表1 靶基因熒光定量PCR引物信息

圖1 Kisspeptin對顆粒細胞周期的影響

2.2 Kisspeptin對顆粒細胞凋亡的影響 Annexine V/PI雙染結(jié)果如圖2所示，用100 nmol/L的Kp-10處理24 h可極顯著促進牛顆粒細胞的凋亡（P＜0.01）。凋亡基因表達量結(jié)果如圖3所示，與對照組相比，100 nmol/L的Kp-10處理24 h可顯著下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達量，顯著上調(diào)促凋亡基因Caspase-3、Fas和Fasl mRNA表達量（P＜0.01）。

3 討 論

自2003年以來，大量研究表明下丘腦表達的Kisspeptin對動物生殖調(diào)控發(fā)揮重要作用，而Kisspeptin在外周器官上的研究較少。已有研究表明，Kisspeptin在顆粒細胞上表達[2-3]，但其作用尚不清楚。本實驗首次發(fā)現(xiàn)，Kisspeptin可促進牛顆粒細胞凋亡，且伴隨有Caspase-3、Fas和Fasl mRNA 表達上調(diào)及Bcl-2 mRNA表達下調(diào)。

圖2 Kisspeptin對顆粒細胞凋亡的影響

圖3 Kisspeptin對顆粒細胞（A）Bcl-2、（B）Caspase-3、（C）Fasl和（D）Fas 相對表達量的影響

本實驗發(fā)現(xiàn)，100 nmol/L的Kisspeptin處理24 h，可顯著促進牛顆粒細胞凋亡，并在G1期細胞發(fā)生阻滯。以往在腫瘤細胞上的相關(guān)研究支持這一結(jié)果[5-7]。陳偉[5]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌HCT116細胞中，KiSS-1基因的過表達能抑制腫瘤細胞增生，促進腫瘤細胞凋亡。張劍[6]發(fā)現(xiàn)，KiSS-1蛋白表達的增高對胃癌細胞增殖具有抑制作用。林晉等[7]通過細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)發(fā)現(xiàn) KiSS-1基因轉(zhuǎn)染MG-63細胞后可抑制其增殖，其機制可能與細胞周期變化有關(guān)。上述研究表明，Kisspeptin可抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡，而本研究發(fā)現(xiàn)Kisspeptin可促進顆粒細胞凋亡，提示Kisspeptin這一功能的保守性。

Caspase-3是引起凋亡的始發(fā)因子，能誘導(dǎo)細胞發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的凋亡，屬于Bcl-2的下游調(diào)控蛋白，而Bcl-2是一種重要的抗細胞凋亡蛋白，在細胞周期中主要調(diào)控線粒體凋亡途徑[8-9]。本實驗研究表明，Kisspeptin能下調(diào)Bcl-2 的mRNA表達量，上調(diào)Caspase-3 的mRNA表達量，這與利用流式細胞技術(shù)的凋亡檢測結(jié)果相符，進一步說明Kisspeptin可促進牛顆粒細胞凋亡。此外，F(xiàn)as和Fasl介導(dǎo)的細胞凋亡途徑是卵巢顆粒細胞凋亡的發(fā)生機制之一，細胞凋亡受Fas和Fasl配體在牛卵巢顆粒細胞之間的相互作用調(diào)節(jié)，幫助平衡卵子發(fā)生，而細胞凋亡是卵泡閉鎖的重要誘因[10]。在牛顆粒細胞的發(fā)育過程中，F(xiàn)as/Fasl通路通過啟動凋亡信號誘導(dǎo)卵巢顆粒細胞凋亡，從而導(dǎo)致卵泡閉鎖[11-12]。本研究結(jié)果表明，Kisspeptin顯著上調(diào)Fas和Fasl的mRNA水平，且Fasl表達比Fas明顯升高，這可能由于Fas是從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞膜上，它與Fasl結(jié)合在一起。這些發(fā)現(xiàn)提示，Kisspeptin可能通過上調(diào)Fas/Fasl 的表達誘導(dǎo)牛顆粒細胞凋亡。

4 結(jié) 論

Kisspeptin可促進牛顆粒細胞凋亡，這一作用可能通過上調(diào)促凋亡基因Caspase-3、Fas、Fasl的mRNA表達和下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表達實現(xiàn)。

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Ef f ect of Kisspeptin on the Apoptosis of Bovine Granulosa Cells

WANG Jun, LIU Hong‐yu, XU Gao‐qing, LV Wen‐fa*

(Jilin Province Engineering Laboratory for Ruminant Reproductive Biotechnology and Healthy Production, College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Jilin Changchun 130118, China)

Previous studies showed that Kisspeptin expresses in granulosa cells, however, its ef f ect on apoptosis of bovine granulosa cells is still unknown. In the present study, fl ow cytometry analysis and q Real Time quantitative‐PCR were used to study ef f ect of Kisspeptin on apoptosis of bovine granulosa cells. Bovine granulosa cells were cultured with DMEM‐F12 solution added with 0 or 100 nmol/L of Kp‐10 for 24 h, then fl ow cytometry was used to study apoptosis and cell cycleof the bovine granulosa cells, and Real Time quantitative‐PCR was used to study mRNA expression of Caspase‐3, Bcl‐2, Fas and Fasl. The results showed that Kisspeptin could promote apoptosis of bovine granulosa cells, accompanied with the decreased mRNA levels of Bcl‐2 and the increased mRNA levels of Caspase‐3, Fas and Fasl (P＜0.01). Additionally, results of flow cytometry analysis showed that Kisspeptin could significantly increase accumulation of cells in the G1 phase, decrease accumulation of cells in the S phase, and promote apoptosis of bovine granulosa cells (P＜ 0.05). Thus, our fi ndings demonstrated for the fi rst time that Kisspeptin promoted apoptosis of bovine ovarian granulosa cells, which may be achieved through regulation of Caspase‐3, Fas, Fasl and Bcl‐2 mRNA expression.

Kisspeptin; Bovine; Granulosa cells; Apoptosis

S823.3

A

10.19556/j.0258-7033.2017-09-057

2017-07-18；

2017-08-01

中國博士后基金（2015M581408）；吉林省科技廳項目（20150519018JH、20160209001NY）

王軍（1979-），男，吉林敦化人，博士，副教授，主要從事動物繁殖調(diào)控研究，E-mail：junwang2004@126.com

* 通訊作者：呂文發(fā)，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：wenfa2004 @163.com