路立里，韓 冰，陳春華，劉宜勇，張 寧

（1.新疆畜牧科學院，烏魯木齊 830000；2.農業(yè)部草食家畜遺傳育種與繁殖重點實驗室，烏魯木齊 830000；3.新疆伊犁州畜禽改良站，伊寧 835000）

哈薩克羊GDF9、ESR、BMPR-IB基因的PCR-RFLP多態(tài)性研究

路立里1，韓 冰2，陳春華3，劉宜勇3，張 寧2

（1.新疆畜牧科學院，烏魯木齊 830000；2.農業(yè)部草食家畜遺傳育種與繁殖重點實驗室，烏魯木齊 830000；3.新疆伊犁州畜禽改良站，伊寧 835000）

為了探索綿羊多胎性的分子機理以及為綿羊繁殖力的標記輔助選擇和育種提供理論依據(jù)，特開展了哈薩克羊品種多胎主效基因篩選和標記輔助育種研究。實驗采用PCR-RFLP方法，對哈薩克羊GDF9、ESR、BMPR-IB基因進行PCR-RFLP多態(tài)性檢測。結果表明：在哈薩克羊群體中GDF9、ESR、BMPR-IB基因的酶切位點上均未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，說明GDF9、ESR、BMPR-IB基因的酶切位點均不能作為控制哈薩克羊繁殖力的潛在分子標記位點。

哈薩克羊；GDF9基因；ESR基因；BMPR-IB基因；多態(tài)性

綿羊的繁殖性能是一個重要的經濟性狀，在群體內表現(xiàn)連續(xù)變異，是由一系列主基因或數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）決定的［1］，且遺傳力只有0.1左右，很難用常規(guī)的技術來提高。目前，國內外提高綿羊繁殖性能最常見的方法是利用基因工程等技術進行分子育種，從根本上改變其繁殖性能，而找到與繁殖性能相關的分子標記位點是實現(xiàn)這個目標的基礎。

開展哈薩克羊品種多胎主效基因篩選和標記輔助育種研究，可為哈薩克羊品種的開發(fā)利用及遺傳資源的保護提供理論依據(jù)，也必將有力地推動和加速哈薩克羊多胎品系的選育步伐，因此，具有重要的理論意義和重大的應用價值。本實驗以哈薩克羊為實驗材料，采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）方法對GDF9、ESR、BMPR-IB基因進行多態(tài)性檢測與分析，查找哈薩克羊在該基因酶切位點中的多態(tài)性，并對具有多態(tài)性的DNA片段進行測序分析，以期在該基因中找到與哈薩克羊產羔性狀相關的遺傳標記位點，為開展標記輔助選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所需哈薩克羊（150只）由尼勒克縣提供。頸靜脈采血，ACD抗凝，供提取綿羊基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 參照《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》［2］以及常規(guī)酚-氯仿抽提法提取血液基因組DNA。

1.2.2 引物設計和PCR擴增 參照GenBank中綿羊GDF9基因（登錄號：NM_001142888.2）、ESR基因（登錄號：XM_015097472.1）、BMPR-IB基因（登錄號：NM_001009431.1），利用Olig 6.0和Primer 5.0設計引物如表1。

表1 檢測哈薩克羊多胎候選基因的引物

PCR擴增體系為25μL，包括：10×PCR緩沖液2.5 μL，10 pmol/L引物 0.5μL，dNTPs 2.0μL，2.5 U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，100 ng/μL的DNA模板1.0μL，其余用水補齊至25μL。

1.2.3 PCR擴增條件 94℃預變性3 min；94℃變性30 s，62～55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，72℃延伸10 min；4℃保存，產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 PFLP分析 5μL PCR擴增產物；1.5μL 10× Buffer；0.5μL限制性內切酶；3μL水。

反應條件：37℃水浴4 h左右；3%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，并在凝膠成像儀上成像觀察結果，并保存圖像。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

2.1.1 GDF9基因的PCR擴增結果 用GDF9基因引物對哈薩克羊基因組DNA進行PCR擴增，擴增產物片段與目的片段大小一致（139 bp）（圖1）。結果表明：特異性良好，可直接用于RFLP分析。

圖1 GDF9基因的PCR產物

2.1.2 ESR基因的PCR擴增結果 用ESR基因引物對哈薩克羊基因組DNA進行PCR擴增，擴增產物片段與目的片段大小一致（115 bp）（圖2）。結果表明：特異性良好，可直接用于RFLP分析。

2.1.3 BMPR-IB基因的PCR擴增結果 用BMPR-IB基因引物對哈薩克羊基因組DNA進行PCR擴增，擴增產物片段與目的片段大小一致（140 bp）（圖3）。結果表明：特異性良好，可直接用于RFLP分析。

圖2 ESR基因的擴增結果

圖3 BMPR-IB基因的酶切結果

2.2 PCR-RFLP結果

2.2.1 GDF9基因的PCR-RFLP結果 用Dde I內切酶對GDF9基因所擴的PCR產物進行酶切，用3%瓊脂糖電泳對酶消化產物進行檢測，得到108 bp條帶（圖4）。

圖4 GDF9基因的PCR產物酶切結果

2.2.2 ESR基因的PCR-RFLP結果 用BSP1 286 I內切酶對ESR基因所擴的PCR產物進行酶切，用3%瓊脂糖電泳對酶消化產物進行檢測，野生型完全被切開，產生92 bp大小的片段（圖5）。本實驗在哈薩克羊群體中發(fā)現(xiàn)ESR基因的PCR-RFLP的所有結果均為野生型，沒有多態(tài)性。

2.2.3 BMPR-IB基因的PCR-RFLP結果 用AvaⅡ內切酶對BMPR-IB基因所擴的PCR產物進行酶切，用3%瓊脂糖電泳對酶消化產物進行檢測，沒有發(fā)現(xiàn)被切開片段（圖6）。

圖5 ESR基因產物消化結果

圖6 BMPR-IB基因的酶切結果

3 討論

綿羊的繁殖性狀是其重要的經濟性狀之一，而繁殖性狀屬于低遺傳力性狀，是由主效基因以及微效多基因控制的，因此發(fā)現(xiàn)與鑒定多胎候選基因和主效基因對提高綿羊數(shù)量及建立多胎品系具有重要作用。哈薩克羊產羔數(shù)為1～4羔，提高哈薩克羊產羔率及產羔數(shù)具有重要的經濟意義。故研究哈薩克羊的多態(tài)機理有重大的科學價值，但至今仍未發(fā)現(xiàn)影響哈薩克羊多胎性狀的基因，本研究以GDF9、ESR和BMPR-IB為候選基因，以期找到影響哈薩克羊多胎性狀的SNP位點。

GDF9（growth diferentiation factor 9，GDF9）基因是TGF-β（transforming growth factor beta）超家族中的一員，是第一個被發(fā)現(xiàn)由卵母細胞分泌的生長因子，它通過旁分泌方式對卵泡的生長分化起著重要作用，因此對動物的繁殖也起著重要作用。Hayashi等［3］在體外培養(yǎng)體系中發(fā)現(xiàn)，重組GDF9能誘導大鼠的腔前卵泡生長，且與FSH一起使用時對卵泡生長起加性作用。Hanrahan等［4］擴增Cambridge綿羊和Belclare綿羊GDF9基因共發(fā)現(xiàn)了8個SNP，其中位于編碼區(qū)1 184 bp處的堿基突變C→T導致位于編碼區(qū)第395個氨基酸殘基由絲氨酸改變?yōu)楸奖彼?，氨基酸的改變導致了GDF9基因功能的改變。Hanrahan等［4］根據(jù)影響綿羊繁殖力基因的命名法則，將GDF9基因編碼區(qū)1 184 bp處的堿基突變命名為FecG。國內的學者在小尾寒羊、湖羊、陶賽特羊和薩?？搜蛑邪l(fā)現(xiàn)，GDF9基因第152堿基A突變?yōu)镚，導致天冬酰胺改變?yōu)樘於彼帷?/p>

ESR基因（estrogen receptor，ESR）是核受體超家族的一員，具有轉錄調控蛋白質的功能，影響雌激素基因在雌性脊椎動物組織的表達與調控，是依賴配體活化的轉錄因子，通過與靶基因上特異性效應元件結合，調節(jié)靶基因的表達。近年來，國內的學者們開始研究多胎綿羊的ESR基因。對高繁殖力綿羊品種小尾寒羊、湖羊的研究結果表明，ESR基因可能是控制小尾寒羊和湖羊多胎性能的一個主效基因或與之存在緊密的遺傳連鎖［5］。

BMPR-IB基因（bone morphogenetic protein receptor IB，BMPR-IB）是編碼一個轉移生長因子β亞基（TGF-β）受體家族的成員，存在于許多細胞類型中，在綿羊卵巢的卵母細胞和顆粒細胞中特異性表達，具有影響顆粒細胞分化和卵泡發(fā)育、促進排卵數(shù)增加的作用［6］。國內外學者對該基因做了大量的研究，并證實該基因是控制部分綿羊高繁殖性狀的主效基因［7］。楊華等［8］的研究表明，A746G突變對中國美利奴羊（軍墾型）高產羔數(shù)的影響達到極顯著程度（P<0.01），能夠作為其高繁殖力綿羊的選擇標記位點。BMPR-IB基因是控制Booroola綿羊等高繁殖力品種綿羊的主效基因［7，9］。

本實驗利用PCR-RFLP方法，對150個不同繁殖力的哈薩克羊群體的GDF9、ESR和BMPR-IB基因的酶切位點進行了多態(tài)性檢測。結果發(fā)現(xiàn)：在哈薩克羊群體中GDF9、ESR、BMPR-IB基因的酶切位點上均未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，表明GDF9、ESR、BMPR-IB基因的酶切位點均不能作為控制哈薩克羊繁殖力的潛在分子標記位點。這與國內外的大量研究有差異。說明由于地域差異，自然選擇或者人工選擇對哈薩克羊多胎基因分布的影響較大，這可能與育種中的個體選擇有關，需要擴大采樣范圍或者擴大樣品量進一步進行深入的研究。

4 結論

4.1 GDF9基因的FecGH位點多態(tài)性

通過PCR-RFLP檢測結果表明，在哈薩克羊群體中GDF9基因的FecGH位點不存在多態(tài)性，說明哈薩克羊多胎性狀與GDF9基因的FecGH位點無關。

4.2 ESR基因的多態(tài)性

通過PCR-RFLP檢測ESR基因，結果表明，該位點在哈薩克羊群體中出現(xiàn)的均是野生型基因型，不存在多態(tài)性，說明ESR基因不是哈薩克羊的多胎主效基因。

4.3 BMPR-IB基因的多態(tài)性

通過PCR-RFLP檢測結果表明，在哈薩克羊群體中該酶切位點不存在多態(tài)性，說明哈薩克羊多胎性狀與多胎基因BMPR-IB無關。

［1］ 田秀娥，孫紅霞，王永軍.3個綿羊群體BMPR-IB基因的遺傳多態(tài)性及其對產羔數(shù)的影響［J］.西北農林科技大學學報（自然科學版），2009，11（37）：31-36.

［2］ 薩姆布魯克，EF弗里奇，馬尼阿蒂斯EF.分子克隆實驗指南［M］.沈桂芳，毛江森，譯.2版.北京：科學出版社，1992.

［3］ Hayashi M，McGcc E A，Min G，et al.Reconitinant growth differentiation factor 9（GDF-9）enhances growth and differentiation of cultured early ovarian folliceles［J］.Endocrinology，1999，140（3）：1236-1675.

［4］ Hanrahan J P，Gregan S M，Mulsant P，et al.Mutations in the genes for oocyte-derived growth factors GDF9 and BMP15 are associated with both increased ovulation rate and sterility in Cambridge and Belcalaer sheep［J］.Biol Reprod，2004，70：900-909.

［5］ 畢曉丹，儲明星，金海國.小尾寒羊高繁殖力候選基因ESR的研究［J］.遺傳學報，2005，10（5）：46-48

［6］ Kumar D，Joshi A，Naqvi S MK，et al.Sperm motion characteristics of Garole× Malpura sheep evolved in a semi-arid tropical environment through introgression of BMPR-IB gene［J］.Anim Reprod Sci，2007，100（l-2）：51-60.

［7］ 王建起，曹文廣.綿羊多胎主效基因研究進展［J］.遺傳，2011，33（9）：953-961.

［8］ 楊華，楊永林，劉守仁，等.綿羊BMPR-IB基因單核苷酸多態(tài)性分析［J］.西北農業(yè)學報，2010，19（9）：7-11.

［9］ Wilson T，Wu X Y，Juengel J L，et al.Highly prolific Booroola sheep have a mutation in the intracellular kinase domain of bone morphogenetic protein IB receptor（ALK-6）thatis expressed in both oocytes and ranulose cells［J］.Biology of Reproduction，2001，64（4）：1225-1235.

PCR-RFLP Polymorphisms of GDF9，ESR，BMPR-IB Genes in Kazakh Sheep

Lu Lili1，Han Bing2，Chen Chunhua3，etal
（1.Xinjiang Academy ofAnimalSciences，Urumchi830000，China；2.KeyLaboratoryofGenetics，Breedingand ReproductionofGrassFeedingLivestock，MinistryofAgriculture，Urumchi830000，China；3.The Livestock ImprovementStation ofYiliState，Yining 835000，Xinjiang，China）

To explore the molecular mechanism of prolificacy and providing theoretical basis for marker-assisted selection and breeding offecundity in sheep，PCR-RFLP wasused to detectpolymorphismsof GDF9，ESR and BMPR-IB genesin Kazakh sheep. The resultsshowed thatthe gene polymorphismswere notfound on GDF9，ESR and BMPR-IB genes restriction enzyme sites and these sites could notbe considered as a potentiallocus tocontrolreproduction ofKazakh sheep.

Kazakh sheep；GDF9 gene；ESR gene；BMPR-IB gene；polymorphism

S826.2

A

2095-3887（2017）05-0006-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.05.002

2017-06-20

路立里（1975-），男，副研究員，碩士。研究方向：動物遺傳育種與改良。