朱質(zhì)斌 戴 煒王 東 張國(guó)良 聶 廣

深圳市第三人民醫(yī)院（廣東 深圳，518112）

慢性丙型肝炎患者IL-28B基因多態(tài)性與中醫(yī)證型及肝臟生化、APRI的相關(guān)性研究*

朱質(zhì)斌 戴 煒Δ王 東 張國(guó)良 聶 廣

深圳市第三人民醫(yī)院（廣東 深圳，518112）

目的：對(duì)慢性丙型病毒性肝炎的IL28B基因SNP進(jìn)行分型，了解慢性丙型肝炎患者中IL28B不同等位基因的中醫(yī)證候分布及其與肝臟生化、APRI評(píng)分的相關(guān)性。方法：采用焦磷酸測(cè)序方法對(duì)105例慢性丙型病毒性肝炎初治患者的IL28B基因rs12979860 SNP位點(diǎn)的基因型進(jìn)行檢測(cè)，完善其肝臟生化、血常規(guī)及B超檢查，并對(duì)其行中醫(yī)辨證分型，比較不同等位基因的中醫(yī)證型分布及不同證型的肝臟生化情況、APRI評(píng)分。結(jié)果：105例慢性丙型肝炎患者的IL28B基因分型中CC型占90例，此分型中中醫(yī)證型為肝腎陰虛者最多（37例，占41.1%），其AST及APRI評(píng)分比其他證型組明顯升高，且其發(fā)生肝硬化的比例最高（P＜0.05）。結(jié)論：IL28B等位基因?yàn)镃C的慢性丙肝患者中中醫(yī)證型為肝腎陰虛的患者較其他證型患者肝臟生化異常最明顯，APRI評(píng)分最高，提示肝腎陰虛組患者潛在發(fā)生肝硬化的風(fēng)險(xiǎn)更高。

慢性丙型肝炎；白細(xì)胞介素-28B；中醫(yī)證型；生化指標(biāo)

丙型肝炎主要經(jīng)血液傳播，其急性感染后慢性化率為55%～85%。宿主的一些遺傳背景可能影響慢性化，IL-28B基因、人類(lèi)白細(xì)胞抗原1類(lèi)分子HLA B57等的等位基因多態(tài)性可影響HCV清除［1－3］。而HCV感染慢性化中醫(yī)證型表現(xiàn)各異，均可導(dǎo)致肝纖維化及肝硬化，目前有關(guān)遺傳背景及中醫(yī)證型影響患者肝臟炎癥活動(dòng)的研究較少。我們前期研究發(fā)現(xiàn)宿主IL28B基因多態(tài)性（rs12979860：C/C、C/T、T/T）影響著HCV的自發(fā)清除和干擾素的治療應(yīng)答，本研究采用焦磷酸測(cè)序的方法對(duì)慢性丙型肝炎患者IL28B SNP-rs12979860位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測(cè)，探索慢性丙型肝炎患者IL-28B基因的多態(tài)性與中醫(yī)證型及肝臟生化特點(diǎn)的關(guān)系，有助于今后開(kāi)展針對(duì)慢性丙型肝炎的診治。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取105例慢性丙型肝炎病例，均為在深圳市第三人民醫(yī)院門(mén)診或住院部治療的患者，經(jīng)雅培試劑檢測(cè)HCVRNA病毒載量為陽(yáng)性，其中男性60例，女性45例，平均年齡（49.6±13.0）歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入組研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 儀器與試劑 全血DNA抽提試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，Ex Taq DNA聚合酶購(gòu)自日本TAKARA公司，等位基因分型試劑購(gòu)自美國(guó)ABI公司，紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品，PCR儀購(gòu)自為美國(guó)ABI公司，其它實(shí)驗(yàn)耗材購(gòu)自Axygen公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA的提取、以及IL28B SNP的基因型檢測(cè)

采集觀察組患者血細(xì)胞，采用離心柱方法提取基因組DNA，以全自動(dòng)凝膠成像分析儀檢測(cè)DNA含量；在SNP上找到rs12979860序列，利用焦磷酸測(cè)序法對(duì)IL28B SNP-rs12979860位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測(cè)，以確定HCV患者的等位基因分型。

1.3.2 建立觀察組患者證型演化的模型 觀察組患者采用多元統(tǒng)計(jì)分析中的因子和聚類(lèi)分析方法建立證型演化的模型。①制定慢性丙型肝炎患者中醫(yī)四診調(diào)查表：依據(jù)國(guó)家/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范教材、專(zhuān)著、論文、古籍等文獻(xiàn)中對(duì)慢性丙型肝炎患者肝纖維化的證候信息進(jìn)行采集、整理、歸納，根據(jù)研究目的構(gòu)建慢性丙型肝炎患者肝纖維化中醫(yī)四診調(diào)查表；經(jīng)臨床預(yù)調(diào)查，進(jìn)一步修訂完善后，形成正式四診調(diào)查表，調(diào)查方式采用訪談式。②建立慢性丙型肝炎患者肝纖維化中醫(yī)證候的模型，共分為5個(gè)中醫(yī)證型，分別為肝腎陰虛證、肝郁脾虛證、脾腎陽(yáng)虛證、濕熱內(nèi)阻證、淤血阻絡(luò)證。

1.3.3 觀察組患者血清HCV RNA載量、HCV基因型、肝臟生化指標(biāo)如白蛋白（Alb）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）及血小板（PLT）的檢測(cè)。對(duì)慢性丙肝患者，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行HCV RNA定量檢測(cè)；采用聚合酶鏈反應(yīng)－微板核酸雜交－酶聯(lián)免疫測(cè)定法進(jìn)行HCV RNA基因分型檢測(cè)；用全自動(dòng)快速干式生化儀及專(zhuān)用試劑條（德國(guó)羅氏公司）進(jìn)行肝臟生化指標(biāo)檢測(cè)，并計(jì)算患者APRI值。

1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定 應(yīng)用SPSS17.0處理數(shù)據(jù)，將患者的一般信息、中醫(yī)四診信息、檢測(cè)指標(biāo)等信息錄入數(shù)據(jù)庫(kù)。定量資料用均數(shù)表達(dá)，定性資料的頻率用%表達(dá)。定量資料比較用t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)，定性資料比較用Pearsonχ2檢驗(yàn)。中醫(yī)證候與肝臟生化功能異常嚴(yán)重程度之間的關(guān)系用Correspondence analysis模塊進(jìn)行對(duì)應(yīng)分析。用Pearsonχ2檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行基因型及等位基因頻率進(jìn)行單因素分析；用非條件Logistic回歸進(jìn)行多因素分析，調(diào)整各因素，計(jì)算相對(duì)危險(xiǎn)度（Relative Risk，RR）及其95%可信區(qū)間（confidential interval，CI）。檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性丙型肝炎患者等位基因分型的分布及肝硬化的發(fā)生率情況，見(jiàn)表1。

慢性丙型肝炎患者不同IL28B等位基因分型的肝硬化病例數(shù)所占的比例有所不同。其中CC型患者的肝硬化發(fā)生率為53.3%（48/90），而CT型患者的肝硬化發(fā)生率為20%（3/15），由此可見(jiàn)，CC型患者發(fā)生肝硬化的比例比CT型明顯要高（P＜0.05）。

表1 慢性丙型肝炎患者等位基因分型的分布及肝硬化的發(fā)生率比較 ［n（%）］

2.1 等位基因?yàn)镃C型患者中不同中醫(yī)證型的肝臟生化特點(diǎn)情況 見(jiàn)表2。

在IL28B等位基因分型的為CC型的患者中，根據(jù)慢性丙型肝炎中醫(yī)四診調(diào)查表，主要分5個(gè)中醫(yī)證候型，其中肝腎陰虛組患者占比例最多，且其AST較其他4組升高，APRI值明顯高于較其他4組，差異具統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）。如表所示，肝腎陰虛組患者肝硬化比例最高，與其APRI值比其他證型明顯升高結(jié)果一致，考慮與該證型患者長(zhǎng)期肝功能異常、肝臟炎癥反應(yīng)明顯，導(dǎo)致患者肝纖維化、肝硬化相關(guān)。

表2 等位基因?yàn)镃C型患者中不同中醫(yī)證型的肝臟生化特點(diǎn)（±s）

表2 等位基因?yàn)镃C型患者中不同中醫(yī)證型的肝臟生化特點(diǎn)（±s）

與其他四組比較，*P＜0.05

中醫(yī)證型總例數(shù)（n，%）ALB（g/L）ALT（U/L）AST（U/L）（E＋9/L）APRI肝硬化發(fā)生數(shù)（例，%）PLT肝腎陰虛37（41.11）*40.69± 5.89*80.63± 50.61*82.50± 60.86**104.47± 47.01*3.01± 3.51**27（72.97）*肝郁脾虛17（58.60）脾腎陽(yáng)虛29（32.2）42.56± 3.76 60.17± 22.04 71.48± 31.73 139± 50.26 2.01± 1.62 5（5.66）45.76± 1.09 71± 44.4 51± 9.2 140± 13.2 0.9± 0.08 0（0）濕熱內(nèi)阻16（17.78）43.82± 3.42 88.56± 75.70 77± 59.90 178.69± 44.6 1.52± 1.38 4（25%）淤血阻絡(luò)3（3.33）38± 1 80± 1 40± 1 180± 1 0.56± 0.01 0（0）

3 討論

在常用的SNP檢測(cè)方法中，焦磷酸測(cè)序技術(shù)（pyrosequencing）是一種新型的酶聯(lián)級(jí)聯(lián)測(cè)序技術(shù)，其精確性及可重復(fù)性能與SangerDNA測(cè)序法相媲美，但速度明顯的提高。焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)樣品的快速測(cè)序分析能力，為大通量、低成本、快速地進(jìn)行SNP研究和臨床檢驗(yàn)提供了非常理想的技術(shù)操作平臺(tái)［4，5］。中國(guó)慢性丙型肝炎患者人群數(shù)量巨大，本研究應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)慢丙肝患者的IL28B基因SNP進(jìn)行分型，大大提高了檢測(cè)速度及研究結(jié)果的可靠性。

HCV感染進(jìn)展多緩慢，感染后20年，兒童和年輕女性肝硬化發(fā)生率為2%～4%［6］。HCV相關(guān)HCC發(fā)生率在感染30年后為1%～3%，主要見(jiàn)于肝硬化和進(jìn)展期肝纖維化患者，一旦發(fā)展成為肝硬化，HCC的年發(fā)生率為2%～4%［7］。肝硬化和HCC是慢性丙型肝炎患者的主要死因。肝硬化發(fā)生失代償年發(fā)生率為3%～4%。一旦發(fā)生肝硬化，10年生存率約為80%，如出現(xiàn)失代償，10年的生存率僅為25%。HCC在診斷后的第1年，死亡的可能性為33%［8］。

丙型肝炎肝損害的主要原因是HCV感染后引起的免疫學(xué)反應(yīng)，其中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）起重要作用［9］。丙型肝類(lèi)患者的持續(xù)性的慢性炎癥，是導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化的重要基礎(chǔ)，如能控制患者的肝臟慢性炎癥，就可以減少患者的肝硬化、肝癌發(fā)生率。丙型肝炎慢性化機(jī)制還尚未完全闡明，有考慮與宿主免疫、遺傳易感性和病毒等共同作用的相關(guān)。

我們通過(guò)對(duì)大量慢性丙型肝炎患者的長(zhǎng)期隨訪，發(fā)現(xiàn)宿主感染HCV后個(gè)體差異很大，發(fā)病與否以及病情輕重程度均有差異，即使相同種族、性別及年齡相似的個(gè)體經(jīng)同一種方式感染相同的病毒亞型，也可產(chǎn)生不同的后果，由此表明宿主遺傳因素對(duì)疾病的發(fā)生、預(yù)后具有重要影響。本研究通過(guò)對(duì)慢性丙型肝炎患者IL-28B等位基因及其中醫(yī)證型的分析，得出CC型患者中肝腎陰虛型患者所占比例最高，此證型患者的肝臟生化如AST異常最明顯，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，此證型患者的APRI值最高，平均值達(dá)3.01，成人中如APRI評(píng)分大于2，預(yù)示患者已發(fā)生肝硬化［10］，與本研究中此證型患者的肝硬化發(fā)生率最高相符。由此研究得出，CC型慢性丙型肝炎患者中的肝腎陰虛型患者最多，而此證型患者的肝功能異常最明顯，炎癥反應(yīng)顯著，發(fā)生肝硬化的比例也最高，因此，且我們應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)此證型患者的監(jiān)控，除抗病毒治療外，可根據(jù)具體病情酌情行抗肝纖維化治療，通過(guò)積極治療，肝纖維化及早期肝硬化是可逆的。

由于本研究中慢性丙型肝炎患者的樣本不多，尤其因種族特異性CT型患者樣本量少，研究對(duì)象主要是中國(guó)的漢族南方人群，不能代表廣泛性的丙肝疾病譜的特征。所以還存在一定的局限。在基因易感性方面還需加大樣本量，采集不同地域的人群、不同年齡段、不同種族的人群進(jìn)一步研究。我們將進(jìn)一步收集更多的慢性丙型肝炎患者樣本，對(duì)肝纖維化、早期肝硬化的慢性丙肝患者進(jìn)行更深層次的探討。

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Study on the correlation between the IL-28B gene polymorphism and Traditional Chinese M edicine syndrome，liver biochem ical characteristics and APRI in patients w ith chronic hepatitis C

ZHU Zhi－bin，DAIWeiΔ，WANG Dong，etal.The third people＇s Hospital of Shenzhen（Shenzhen Guangdong，518112）China

Objective：To study the correlation between the IL-28B gene polymorphism and Traditional Chinese Medicine syndrome，liver biochemical characteristics and APRI in patients with chronic hepatitis C.Methods：Pyrosequencingmethod was used to test genotype IL28B gene rs12979860 SNP and completed the liver biochemistry test，blood routine test，ultrasound examinatio in 105 cases of naive chronic HCVpatients visited our hospital.Then the TCM syndrome types were classified and the distribution of TCM Syndromes and their correlation with biochemical characteristics and APRI score were compared.Results：There were 90 cases CC type of IL28B gene in 105 chronic HCV patients visited our hospital.，the liver and kidney yin deficiency was themost common TCM syndrome in these patients（37 cases，41.1%），AST and APRIscore in this TCM syndrome were significantly higher than other syndromes，and the percentage of liver cirrhosiswas the highest in this syndrome.（P＜0.05）.Conclusion：The liver biochemical abnormalities and APRIscore aremostobvious in the liver and kidney Yin deficiency syndrome of IL28B allele for CC in patientswith chroinc HCV，so the patients in liver and kidney Yin deficiency syndrome has the higher potential risk to cirrhosis.

HCV；interleukin 28B；TCM syndrome；biochemical index

2017－03－16 編輯：肖明中）

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.03.008

深圳市科技創(chuàng)新項(xiàng)目（No.JCY20130401164750000）；Δ通信作者，Email：szdaiwei＠126.com