周海軍，崔 霞，王玉霞，穆 軍

（浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022）

菲律賓蛤仔黏附污泥絮凝機(jī)制研究

周海軍，崔 霞，王玉霞，穆 軍

（浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022）

菲律賓蛤仔粘附污泥作為天然絮凝劑具有良好的天然絮凝活性，為研究其絮凝活性產(chǎn)生機(jī)制，本文針對(duì)粘附污泥中的生物因素（細(xì)菌、真菌、無(wú)菌蛤仔）和非生物因素（泥沙）等生態(tài)組成，建立5組蛤仔暫養(yǎng)系統(tǒng)，分別投加細(xì)菌雙抗生素、真菌雙抗生素、細(xì)菌雙抗生素和真菌雙抗生素聯(lián)用、不加棲息地泥沙、以及正常暫養(yǎng)對(duì)照（加棲息地泥沙），比較各生態(tài)因素對(duì)菲律賓蛤仔所產(chǎn)粘附污泥的絮凝沉淀性能的影響。結(jié)果表明，細(xì)菌是菲律賓蛤仔粘附污泥具備絮凝性能的關(guān)鍵生物因素，棲息地泥沙是促進(jìn)粘附污泥絮凝的重要非生物因素；耐藥絮凝活性細(xì)菌使得細(xì)菌雙抗生素組的粘附污泥仍具備一定的絮凝活性；多糖是菲律賓蛤仔粘附污泥產(chǎn)生絮凝作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

菲律賓蛤仔黏附污泥；絮凝機(jī)制；微生物

絮凝劑在給水處理、污水凈化、食品和發(fā)酵工程等領(lǐng)域有著極為廣泛而關(guān)鍵的應(yīng)用[1-2]。絮凝劑按分子組成可分為無(wú)機(jī)絮凝劑、有機(jī)合成高分子絮凝劑和天然高分子絮凝劑三大類(lèi)[3-4]。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)，菲律賓蛤仔粘附污泥作為一種新型的天然絮凝劑，具備絮凝、脫色、重金屬去除等優(yōu)良特性[5-7]。

菲律賓蛤仔粘附污泥是具有復(fù)雜生態(tài)關(guān)系的活性生物污泥，本研究目的在于闡明其絮凝活性產(chǎn)生機(jī)制。通過(guò)對(duì)菲律賓蛤仔暫養(yǎng)，采用抗生素投加選擇性抑制細(xì)菌、真菌，以及在系統(tǒng)中投加和不加棲息地泥沙的方式，逐一確定其中的各個(gè)生態(tài)因素對(duì)菲律賓蛤仔所產(chǎn)粘附污泥是否產(chǎn)生絮凝活性所起的作用，從而揭示菲律賓蛤仔粘附污泥的絮凝活性的真正產(chǎn)生原因。迄今為止，這是首個(gè)關(guān)于菲律賓蛤仔粘附污泥絮凝活性機(jī)制的報(bào)道。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

菲律賓蛤仔采集于浙江省舟山市普陀區(qū)朱家尖一處海水養(yǎng)殖場(chǎng)；方形養(yǎng)殖箱為200 L塑料水產(chǎn)養(yǎng)殖箱，74 cm×54 cm×58 cm，為方便換水，在每一個(gè)養(yǎng)殖箱距箱的底部以上10 cm處安裝了球形閥放水開(kāi)關(guān)；海泥采集于浙江舟山長(zhǎng)峙島灘涂，細(xì)粒海砂采集于浙江舟山朱家尖海濱浴場(chǎng)；食用級(jí)螺旋藻粉購(gòu)于山東濱州尚嘉水族館；灰黃霉素、青霉素鉀、硫酸鏈霉素、5-氟胞嘧啶購(gòu)于南京晶瑪生物科技有限公司；高嶺土、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇、濃硫酸、磷酸、苯酚和葡萄糖等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭痪躳H試紙購(gòu)于上海三愛(ài)思試劑有限公司。

使用的主要儀器：紫外可見(jiàn)分光光光度計(jì)（Agilent Cary 60，美國(guó)安捷倫公司）；渦旋振蕩器（VG3S025型，IKA）；電子天平（LE204E型，上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；恒溫定時(shí)攪拌器（JB-3A型，上海雷磁儀器儀表有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

1.2.1 菲律賓蛤仔暫養(yǎng)系統(tǒng)的建立

本實(shí)驗(yàn)的養(yǎng)殖系統(tǒng)設(shè)立于浙江省舟山市水產(chǎn)研究所的朱家尖養(yǎng)殖基地，采用專(zhuān)用氣路曝氣，專(zhuān)用過(guò)濾海水補(bǔ)換養(yǎng)殖水體。養(yǎng)殖箱設(shè)5組，編號(hào)A、B、C、D、E，每組做平行實(shí)驗(yàn)3個(gè)，共15個(gè)。A組為含有泥沙的原始對(duì)照組；B組為抑制細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)組（加入終濃度為60 μg/mL青霉素和80 μg/mL鏈霉素）；C組為抑制真菌的實(shí)驗(yàn)組（加入終濃度15 μg/mL灰黃霉素和120 μg/mL的5-氟胞嘧啶）；D組為同時(shí)抑制細(xì)菌和真菌的實(shí)驗(yàn)組（加入終濃度 60 μg/mL 青霉素、80 μg/mL 鏈霉素、15 μg/mL 灰黃霉素、120 μg/mL 的 5-氟胞嘧啶）；E組為不含泥沙的對(duì)照組。

海泥和海砂取回后在太陽(yáng)下暴曬一天除去泥中的有害病原微生物。曬好的海泥和海砂充分碾碎后按體積比3:7混合，攪拌均勻，將泥沙鋪在A、B、C、D四組共12個(gè)養(yǎng)殖箱內(nèi)，泥沙層厚度在3～4 cm，注入海水至箱的高度一半左右。E組不放泥沙作為空白組養(yǎng)殖。

精心挑選后蛤仔規(guī)格一般在（3±0.5）cm×（1.5±0.5）cm范圍內(nèi)，均勻散放到水箱內(nèi)，每個(gè)水箱約放700～800 g蛤仔（90±5枚）。對(duì)于有泥沙的水箱，一般放入蛤仔后靜置4～6 h后，蛤仔都鉆入泥沙底質(zhì)層，水質(zhì)都會(huì)由渾濁狀態(tài)變成清澈見(jiàn)底的狀態(tài)。

日常管理維護(hù)包括每日早晚各喂食一次，每次每個(gè)水箱加入3～5 g的螺旋藻粉。每天換水1次，從水箱底部球閥放水，然后從上面緩緩加入20 L新鮮海水。換水時(shí)需注意檢查水箱內(nèi)的蛤仔是否有死亡情況，若有要及時(shí)挑揀出來(lái)以防敗壞水質(zhì)。

1.2.2 粘附污泥的采集

各暫養(yǎng)組別在養(yǎng)殖場(chǎng)暫養(yǎng)45 d后，取回鮮活菲律賓蛤仔分別置于500 mL燒杯中，加入自然海水暫養(yǎng)過(guò)夜。第二日撈出蛤仔，靜置10 min后傾倒上層海水，仔細(xì)收集杯底的蛤仔粘附污泥，置于稱(chēng)量瓶中60℃恒溫干燥。

1.2.3 絮凝活性測(cè)定

絮凝實(shí)驗(yàn)的測(cè)定參照文獻(xiàn)[5，8]的方法并做適當(dāng)改進(jìn)：在93 mL的4 g/L高嶺土懸濁液中加入2 mL樣品溶液和5 mL CaCl2（1%，m/v），調(diào)節(jié)混合液pH值到7.5；160 r/min攪拌1 min，40 r/min攪拌2 min；靜置10 min后，吸取液面以下1 cm處懸濁液，可見(jiàn)分光光度計(jì)于550 nm處測(cè)吸光度A；相同條件下用2 mL去離子水代替樣品溶液測(cè)得吸光度A0；絮凝率（FR）的計(jì)算公式：

A0和A分別是對(duì)照組和樣品溶液在550 nm處的吸光度。

1.2.4 多糖的測(cè)定

參照牛江濤等[9]、DUBOIS等[10]報(bào)道的苯酚-硫酸法并稍作修正：（1）配置40 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取 0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液并用蒸餾水補(bǔ)至 2.0 mL，加入 6%苯酚 1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，迅速搖勻，冷卻后于490 nm測(cè)吸光度。以多糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，制作多糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）將樣品配制成2 mL樣品溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法相應(yīng)步驟測(cè)量樣品的總糖含量。

1.2.5 蛋白質(zhì)的測(cè)定

參照BRADFORD[11]報(bào)道的蛋白質(zhì)含量的測(cè)量方法并稍作修改：（1）取具塞比色管6支，分別加入100 μg/mL 牛血清蛋白 BSA 標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，補(bǔ)加蒸餾水至 1.0 mL，得到含 BSA 0、20、40、60、80、100 μg的標(biāo)準(zhǔn)系列，分別加入5 mL考馬斯亮藍(lán)試液，振蕩均勻，室溫靜置10 min后于595 nm處測(cè)吸光度。以BSA濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，制作蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）將樣品配置成1 mL樣品溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)量樣品的蛋白含量。

1.2.6 耐藥細(xì)菌的分離與絮凝活性測(cè)定

移取B組蛤仔粘附污泥樣品1 mL到盛有9 mL無(wú)菌水試管中，制成10-1稀釋度的粘附污泥懸濁液，依序進(jìn)行10-2、10-3、10-4梯度稀釋?zhuān)瑢⒏魈荻认♂屢涸诩佑锌股氐墓腆w培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布分離，所用抗生素固體培養(yǎng)基成分為：葡萄糖20 g、硫酸銨0.2 g、尿素0.5 g、酵母膏0.5 g、硫酸鎂0.2 g、磷酸二氫鉀2.0 g、磷酸氫二鉀5.0 g、青霉素 60 mg、鏈霉素80 mg、瓊脂20 g、陳化海水1 L，pH為7.2～7.4。涂布分離培養(yǎng)平板于25°C培養(yǎng)7 d后，隨機(jī)挑選單菌落在抗生素固體培養(yǎng)基上劃線分離，25°C條件下培養(yǎng)7 d。

將分離純化得到的耐藥菌株分別接種到液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基成分為：葡萄糖20 g、硫酸銨0.2 g、尿素0.5 g、酵母膏0.5 g、硫酸鎂0.2 g、磷酸二氫鉀2.0 g、磷酸氫二鉀5.0 g、陳化海水1 L，pH調(diào)節(jié)7.2～7.4，25 °C、180 r/min 條件下培養(yǎng) 5 d，培養(yǎng)后發(fā)酵液于 9 000×g、4 ℃離心 20 min 去除菌體，收集上清液，參照“1.2.3”進(jìn)行絮凝活性測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理后各組蛤仔粘附污泥絮凝活性

5組蛤仔粘附污泥絮凝活性結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)表2，各個(gè)生態(tài)因素的作用機(jī)制分析如下：

蛤仔的作用分析：D組聯(lián)合使用細(xì)菌雙抗和真菌雙抗，對(duì)暫養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)菌和真菌進(jìn)行了全面抑制，此時(shí)蛤仔正常存活但絮凝活性極低，說(shuō)明蛤仔自身產(chǎn)生不了起絮凝作用的物質(zhì)，其體內(nèi)的細(xì)菌和真菌是使蛤仔粘附污泥形成絮凝活性的原因。

真菌的作用分析：C組使用真菌雙抗抑制了系統(tǒng)中的真菌，粘附污泥中僅存活大量細(xì)菌的作用，其絮凝活性占原始對(duì)照組A組絮凝活性的85%，說(shuō)明蛤仔粘附污泥中真菌對(duì)其形成絮凝活性作用貢獻(xiàn)不大，細(xì)菌可能是最主要的活性產(chǎn)生者。

細(xì)菌的作用分析：B組使用細(xì)菌雙抗抑制了細(xì)菌，理論上起絮凝作用的產(chǎn)絮微生物沒(méi)有了，其絮凝活性應(yīng)該幾近喪失，但B組仍然保持著相對(duì)正常對(duì)照組A組64.86%的絮凝活性，推測(cè)是因?yàn)槟退幖?xì)菌承擔(dān)了部分絮凝作用，遂進(jìn)行了耐藥絮凝細(xì)菌的分離和活性分析予以證實(shí)，結(jié)果分析見(jiàn)“2.3”。

泥沙的作用分析：A、B、C、D四組均添加了棲息地泥沙，其粘附污泥絮凝活性明顯強(qiáng)于未添加棲息地泥沙的E組的粘附污泥絮凝活性，說(shuō)明泥沙是菲律賓蛤仔粘附污泥發(fā)揮良好絮凝活性的不可缺少的重要因素。泥沙是蛤仔粘附污泥的重要組成部分，與各種微生物及其產(chǎn)生的絮凝物資粘接在一起形成粘附污泥絮體，大大增加了粘附污泥絮體的密度，便于快速沉降。

表1 抗生素處理后的各組菲律賓蛤仔吐泥的絮凝活性測(cè)定Tab.1 Flocculation activity of R.philippinarum conglutination mud after treatments

2.2 不同處理組蛤仔粘附污泥的絮凝活性成分分析

不同處理組蛤仔粘附污泥的多糖和蛋白質(zhì)含量見(jiàn)表2。

表2 抗生素處理后的各組菲律賓蛤仔吐泥的化學(xué)成分測(cè)定Tab.2 Sugar and protein contents of R.philippinarum conglutination mud after treatments

從各組的化學(xué)組成來(lái)看，每組的主要物質(zhì)是多糖，蛋白質(zhì)的含量極低，僅有A、C兩組含有蛋白質(zhì)，其占比分別為7.56%和5.93%。整體來(lái)看，各組的多糖含量和絮凝率之間呈正相關(guān)關(guān)系。由此可見(jiàn)多糖是粘附污泥產(chǎn)生絮凝作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.3 耐藥絮凝細(xì)菌的分離和活性分析

對(duì)B組（抑制細(xì)菌實(shí)驗(yàn)組）的蛤仔黏附污泥樣品中能耐受細(xì)菌雙抗的絮凝劑產(chǎn)生細(xì)菌進(jìn)行分離純化，共獲得50株同時(shí)對(duì)青霉素和鏈霉素具有抗性作用的耐藥細(xì)菌。通過(guò)對(duì)菌株的發(fā)酵液分別進(jìn)行的高嶺土懸濁液絮凝試驗(yàn)，50株耐藥細(xì)菌發(fā)酵液絮凝活性為30%以上。

B組產(chǎn)生耐藥菌的事實(shí)帶來(lái)了對(duì)D組未通過(guò)獲得細(xì)菌耐藥性而提升絮凝活性的再思考，在未有進(jìn)一步的證據(jù)前暫且分析認(rèn)為，這可能是在細(xì)菌和真菌的共同抑制作用下，尚且產(chǎn)生的耐藥菌株胞外多糖的合成代謝路徑發(fā)生了改變，具有絮凝活性的多糖產(chǎn)量的減少（表2）從而D組蛤仔粘附污泥的絮凝活性大大降低。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)菲律賓蛤仔人工養(yǎng)殖系統(tǒng)添加抗生素（抑制細(xì)菌或真菌）和改變蛤仔棲息地因素（添加泥沙與否）與原始生態(tài)環(huán)境下的蛤仔暫養(yǎng)進(jìn)行對(duì)照，研究其粘附污泥絮凝活性及活性成分組成得到如下結(jié)論：

（1）細(xì)菌是菲律賓蛤仔粘附污泥具備絮凝性能的關(guān)鍵生物因素，棲息地泥沙是促進(jìn)粘附污泥絮凝的重要非生物因素，菲律賓蛤仔自身對(duì)粘附污泥絮凝活性無(wú)貢獻(xiàn)，真菌作用亦不大。

（2）多糖是菲律賓蛤仔粘附污泥產(chǎn)生絮凝作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)含量相對(duì)多糖較少較難起到作用。

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Study on the Flocculation Mechanism of Ruditapes philippinarum Conglutination Mud

ZHOU Hai-jun,CUI Xia,WANG Yu-xia,et al
(School of Marine Science and Technology of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

Ruditapes philippinarum conglutination mud had good flocculation capacity as a natural bioflocculant.To investigate the flocculation mechanism of conglutination mud,biological factors(including bacteria,fungi and clam itself)and abiotic factor(habitat sediment)were selected to determine their respective contribution to the flocculation performance of conglutination mud.Five aquaculture systems for R.philippinarum were established by selectively inhibiting bacteria,fungi and both of them using respective antibiotics combination,and habitat sandy mud was also taken as an addition choice.R.philippinarum conglutination mud were collected for flocculation activity analysis,drug Resistant Bacteria isolation and flocculation ingredients elucidation.Results showed that bacterium was the key biological factor that triggered the flocculation activity formation of R.philippinarum conglutination mud and habitat sediment was the important abiotic factor to fasten the precipitation of R.philippinarum conglutination mud flocs.Polysaccharide is the basic material for flocculation capacity of R.philippinarum conglutination mud.

Ruditapes philippinarum conglutination mud;flocculation mechanism;microorganism

X703.5

A

1008－830X(2017)03－0248－05

2017-01-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31470540）；舟山科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014C41018）

周海軍（1989-），男，湖北蘄春人，研究方向：海洋環(huán)境污染防治.

穆軍，教授.E-mail:mujun@zjou.edu.cn