,, , ,, ,*,志偉,*

(1.山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東淄博 255000;2.山東理工大學(xué)分析測試中心,山東淄博 255000)

基于近紅外光譜定量分析牛奶中摻假的動物水解蛋白含量

范睿1,孫曉凱1,楊晨1,陳杰1,劉東武2,孔玲1,*,陳志偉1,*

(1.山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東淄博 255000;2.山東理工大學(xué)分析測試中心,山東淄博 255000)

動物水解蛋白含有大量重金屬離子,攝入人體危害人體健康,因其蛋白質(zhì)含量高,被不法商販作為廉價蛋白質(zhì)添加在牛奶中以提高蛋白質(zhì)含量。本研究自行配制不同濃度的動物水解蛋白摻假牛奶,應(yīng)用近紅外光譜儀浸入式光纖掃描樣品,考察建模方法、預(yù)處理方法、建模范圍、主成分?jǐn)?shù)及樣品的異常點分析對定量分析模型的影響。結(jié)果表明:使用SG平滑處理、主成分?jǐn)?shù)4、在10000～5000 cm-1使用PLS法建立了最優(yōu)動物水解蛋白定量分析模型。該模型的校正均方差(RMSEC)、預(yù)測均方差(RMSEP)、相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.115、0.305、0.983,平均回收率為104.44%。該分析模型可以用于牛奶中動物水解蛋白的快速定量分析,為牛奶的品質(zhì)控制和快速定量提供參考。

牛奶摻假,動物水解蛋白,定量分析,近紅外光譜

乳與人類自身的歷史一樣悠久,不管是人類還是其他哺乳動物,乳都是用于哺育動物嬰兒的重要食物,因其富含多種蛋白和氨基酸被譽為“白色血液”。牛奶作為一種理想的營養(yǎng)品,隨著人們生活水平的不斷提升,奶制品的需求量不斷增加,牛奶及其制品已經(jīng)成為餐桌不可缺少的食物。但在利益的驅(qū)使下乳品摻假、摻雜屢見不鮮嚴(yán)重影響公共健康[1];2008年的三鹿集團毒奶粉事件及2009、2011年“皮革奶事件”引起輿論熱議[2-3]。蛋白質(zhì)含量作為牛奶品質(zhì)的重要指標(biāo),不法商家在利益的驅(qū)使下向奶制品中非法添加含氮的物質(zhì)以提高牛奶的含氮量。動物水解蛋白(hydrolysate animal protein,HAP)蛋白質(zhì)含量高達(dá)90%,是一種廉價的蛋白原料。動物水解蛋白多由皮革、豬皮水解而成,該物質(zhì)含有大量的重金屬,攝入對人體危害極大[4]。

蛋白含氮摻假物對乳蛋白質(zhì)測定有較大干擾。對于真蛋白的摻假物質(zhì)的檢測目前主要利用的是蛋白質(zhì)的特異性及非蛋白含氮的摻假物質(zhì)研究比較完善,Mauer等[4]利用近紅外和中紅外光譜技術(shù)測量了混入奶粉中的三聚氰胺;劉瑩等[5]使用三氯乙酸-雙縮脲法以排除非蛋白氮物質(zhì)的干擾進行的檢測,Song等[6]使用酶聯(lián)免疫法、Kotowicz等[7]采用雙重PCR法對羊奶中的牛奶進行檢測。針對動物水解蛋白中含有特殊的L-羥脯氨酸(L-Hydroxyproline),由丹青[8]建立一種測定純牛奶中L-羥脯氨酸的紫外分光光度法,劉婷等[9]利用高效液相離子交換色譜建立了乳粉中摻假水解動物蛋白的半定量檢測方法?；诎被崮Ｊ劫囉矜玫萚10]利用柱前衍生化-高效液相色譜法建立牛奶及奶粉的氨基酸簡潔模式可有效判別出牛奶及奶粉的蛋白摻假。

近紅外光譜(near infrared spectroscopy,NIRS)技術(shù)是一種高效、無損、快速多組分的定性和定量分析技術(shù),已被成功地應(yīng)用于石油[12]、食品[13-14]、醫(yī)藥[15]、農(nóng)業(yè)[15]等各個領(lǐng)域。本實驗配制不同梯度的動物水解蛋白摻入牛奶樣品,使用近紅外光譜儀浸入式光纖對不同梯度的摻假樣本采集近紅外光譜,然后結(jié)合TQ軟件進行光譜的處理、建模工作。探索動物水解蛋白近紅外定量分析模型,以期為牛奶的品質(zhì)控制和快速定量提供參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

蒙牛純牛奶(批號:1P20160720AQ0321:52) 購于淄博大潤發(fā)超市;動物水解蛋白(批號:20160315) 由河南巧手食品添加劑有限公司提供;實驗用水 為實驗室自制去離子水。

Nicolet-6700傅里葉變換近紅外光譜分析儀 (配有Antaris透射分析和光纖分析系統(tǒng)) 美國Thermo Scientific公司;ST 16R低溫冷凍離心機 美國Thermo Scientific公司;BSM 220.4電子天平(0.0001 g) 上海卓精電子科技有限公司;SY-5200臺式超聲波清洗機 上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市鑫鑫實驗儀器有限公司;78-1磁力加熱攪拌器 上海上登實驗設(shè)備有限公司;Ominic8.2.0.387光譜處理軟件、TQ Analyst8.0.0.245建模軟件 美國Thermo Scientific公司。

1.2實驗方法

1.2.1 制備動物源水解蛋白摻假牛奶樣品 為了建立動物源水解蛋白摻假牛奶近紅外定量分析模型,同時為了擴大樣本的適用性和代表性,精確稱量動物水解蛋白粉末于樣品瓶中,制備含量0.01～2.00 g/mL的動物源水解蛋白摻假牛奶樣品。實驗設(shè)計41個梯度1個空白樣品共計42個摻假樣品。加入37 ℃水浴10 min后的牛奶100 mL,超聲振蕩2 min待用。為了保留標(biāo)準(zhǔn)牛奶的各項原始濃度,本實驗對合格牛奶樣品和摻假牛奶樣品均未做稀釋處理。具體配制比例見表1。

表1 牛奶中動物水解蛋白含量配比Table 1 List of the addition of hydrolysate animal protein in milk

1.2.2 近紅外光譜采集 摻假樣品在測試前37 ℃水浴10 min,儀器開機預(yù)熱30 min,使用近紅外光譜儀SabIR漫反射光纖采集近紅外光譜,設(shè)置掃描范圍為10000～4000 cm-1,Attenuator選擇Empty,Gain選擇1×,采樣間隔8 cm-1,采樣次數(shù)32次,采用扣除內(nèi)置參考背景。

1.2.3 近紅外定量分析模型建立 Ominic對樣品近紅外光譜處理后使用TQ Analyst進行模型建立和分析。對模型的驗證集和校正集進分布、不同建模方法、不同預(yù)處理方法、建模波段范圍、主成分?jǐn)?shù)進行優(yōu)化分析,使用馬氏距離法(Mahalanobis Distance Method,MD)進行異常點判別。

2 結(jié)果與分析

2.1動物水解蛋白摻假牛奶近紅外光譜圖

采用扣除內(nèi)置參考背景,選擇Attenuator選擇Empty,Gain選擇1×,采樣分辨率8 cm-1,采樣次數(shù)32次,在10000～4000 cm-1范圍內(nèi)使用SabIR漫反射光纖采樣品的近紅外光譜。為了減少儀器的漂移每一次采集紅外光譜都采集扣除內(nèi)置背景,動物水解蛋白摻假牛奶近紅光譜圖如圖1所示。

圖1 動物水解蛋白摻假樣品的透射采集近紅外光譜疊加圖Fig.1 NIRS spectra of 60 hydrolysate animal protein adulteration in milk

2.2校正集和驗證集的選擇

應(yīng)用TQAnalyst軟件自動從41份摻假樣品中挑選出33份具有代表性的樣品作為校正集,其余8份樣品作為驗證集,用于動物水解蛋白含量定量分析模型建立,結(jié)果如表2所示。驗證集中動物水解蛋白含量在校正集含量范圍內(nèi),此校正集和驗證集可用于定量分析模型的建立[14]。

表2 動物水解蛋白含量定量分析模型校正集和驗證集分布Table 2 Sample distribution of calibration set and validation set of quantitative analysis model of hydrolysate animal protein in milk

2.3不同建模方法及預(yù)處理的比較

近紅外光譜定量分析模型的建立屬于化學(xué)計量范疇,本研究使用經(jīng)典最小二乘法(Classical Least Squares,CLS)、逐步多元線性回歸(Step-wise Multi Linear Rgression,SMLR)、主成分回歸(Principal Component Regression,PCR)和偏最小二乘回歸(Partial Least Squares,PLS)作為建模方法建立定量分析模型;為了改善光譜特征和補償基線偏移,不同預(yù)處理的光譜預(yù)處理樣品物理性質(zhì)的差異會引起光譜基線和斜率等的變化,本研究通過一階導(dǎo)數(shù)(Frist Derivative)、二階導(dǎo)數(shù)(Second Derivative)、SG平滑(Savitzky-Golay Filter)、Norris平滑(Norris Derivative Filter)對模型進行預(yù)處理,以校正均方差(root-mean-square error of calibration RMSEC)、預(yù)測均方差(root-mean-square error of predication,RMSEP)、相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient,r)為指標(biāo)篩選建模方法。

由表3可知使用PLS為建模方法、SG平滑處理后的定量分析模型指標(biāo)較好,RMSEC、r、RMSEP分別為0.161、0.967、0.560。牛奶樣品屬于一種膠體乳濁液其成分復(fù)雜,PLS建模方法可以有效的對光的散射及樣品成分之間的干擾做出補償,適合用于牛奶這種復(fù)雜樣本的分析[15]。光譜通過SG平滑預(yù)處理,提高了性噪比,減小了隨機噪音使得模型指標(biāo)比較理想[16]。

表3 不同建模方法和預(yù)處理方法對漫反射采集植物水解蛋白牛奶定量分析模型的影響Table 3 Influence of different modeling methods and pretreatment methods on quantitative analysis model

2.4建模波段數(shù)影響

在建立模型時需要選擇建模波段以調(diào)整模型的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。根據(jù)文獻報道[17-18],蛋白質(zhì)中含有大量的C-H、O-H、N-H基團,在4000～5300 cm-1的合頻區(qū)有強烈的吸收;在5300～7000 cm-1的一倍頻區(qū)也有著較強烈的吸收;在7000～10000 cm-1的高倍頻區(qū)也有著相對較弱的吸收區(qū)。結(jié)合圖1的動物水解蛋白近紅外圖譜,綜合表4中r、RMSEC、RMSEP模型性能評價指標(biāo)動物水解蛋白含量定量分析模型的最佳建模波段為10000～5000 cm-1。

表4 不同光譜范圍對動物水解蛋白含量定量分析模型的影響Table 4 Influence of different spectral ranges on quantitative analysis model

2.5模型主成分?jǐn)?shù)的選擇

在建立近紅外模型時,主成分?jǐn)?shù)對模型實際預(yù)測能力有很大的影響,若主成分?jǐn)?shù)選擇過少,就不能充分反映被測組分所產(chǎn)生的光譜信息,從而導(dǎo)致模型預(yù)測準(zhǔn)確度下降;若主成分?jǐn)?shù)選擇過多,會導(dǎo)致過擬合現(xiàn)象,從而導(dǎo)致模型預(yù)測能力下降[19]。本研究以交叉驗證均方根(Root Mean Square Error of Cross Validation,RMSECV)為指標(biāo),選取最佳的建模成分?jǐn)?shù)。最終,確定用于漫反射采集動物水解蛋白含量定量分析建模選擇主成分?jǐn)?shù)是4。

圖2 動物水解蛋白含量定量分析模型RMSECV隨主成分?jǐn)?shù)的變化Fig.2 RMSECV changed with change of principal component in quantitative analysis model

2.6異常點剔除

剔除模型中的異常值樣品也是優(yōu)化數(shù)學(xué)模型的一項技術(shù)。本研究采用傳統(tǒng)的馬氏距離法(Mahalanobis Distance Method),比較剔除異常點前后模型參數(shù),最終漫反射采集動物水解蛋白含量定量分析模型無異常點,如圖3所示。

圖3 馬氏距離法(MD)對動物水解蛋白含量定量分析模型中異常點分析Fig.3 Removing abnormal points of quantitative analysis model by MD

2.7定量模型的建立

通過Ominic 8.2.0.387和Origin Pro 9.0軟件對近紅外光譜圖進行處理、TQ Analyst 8.0.0.245軟件進行模型建立及IBM SPSS Statistics 20.0.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,最終采用PLS建立了漫反射采集動物水解蛋白含量定量分析模型,該模型采用SG平滑預(yù)處理降噪,建模光譜范圍為10000～5000 cm-1,主成分?jǐn)?shù)為4。動物水解蛋白蛋白定量分析模型RMSEC、RMSEP、r的指標(biāo)分別為0.115、0.305、0.983,將8份動物水解蛋摻假樣品驗證集近紅外圖譜代入動物水解蛋白含量定量分析模型預(yù)測動物水解蛋白含量,以預(yù)測值與參考值的比值為預(yù)測回收率,該模型平均回收率為104.44%

圖4 漫反射動物水解蛋白含量定量分析模型參數(shù)圖Fig.4 The parameter diagram of quantitative analysis mode of peanut注:(a)RMSEC、RMSEP及相關(guān)系數(shù)圖,(b)模型殘差分布圖。

3 結(jié)論

PLS建模方法適合動物水解蛋白摻假牛奶定量分析模型的建立,PLS可以有效的對光的散射和牛奶中復(fù)雜成分的干擾做出補償,適合用于牛奶這樣復(fù)雜的定量分析體系。

實驗配制的動物水解蛋白摻假牛奶未經(jīng)任何前處理,通過近紅外光譜儀掃描,紅外光譜通過SG平滑焦躁處理在10000～5000 cm-1光譜范圍建模,選擇主成分?jǐn)?shù)4,使用PLS建立動物水解蛋白定量分析模型,RMSEC、RMSEP、r分別為0.115、0.305、0.983,平均回收率為104.44%相較于傳統(tǒng)的化學(xué)檢測及生物檢測(酶聯(lián)、氨基酸測序)具有快速、簡單、無損、環(huán)保的優(yōu)點。該模型精度仍然有待進一步提高,后續(xù)實驗將圍繞加大樣品數(shù)量以提高模型精度。

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Quantitativeanalysisofhydrolysateanimalprotein(HAP)adulterationinmilkbynearinfraredspectroscopy

FANRui1,SUNXiao-kai1,YANGChen1,CHENJie1,LIUDong-wu2,KONGLing1,*,CHENZhi-wei1,*

(1.School of Life and Science,Shandong University of Technology,Zibo 255000,China;2.Analysis and Test Center,Shandong University of Technology,Zibo 255000,China)

Hydrolysate animal protein(HAP)contains a lot of heavy metal ions which are harmful to human health. Due to its high contents of protein,HAP is used to improve the protein content in milk as an inexpensive source of protein. In this study,milk samples adulterated with different gradients of HAP were prepared. Then,the samples were scanned using near-infrared spectrometer with Fiber Optic Module and the factors influencing quantitative analysis models such as modeling methods,pretreatment methods,principal components and abnormal points were investigated with TQ software. The results indicated that the root mean square error of cross(RMSEC),the root mean square error of prediction(RMSEP)and the correlation coefficient(r)of the established model was 0.115,0.305 and 0.983 respectively,the recovery was 104.44%. The model could be used in rapid quantitative analysis of HAP in milk.

adulterated milk;hydrolysate animal protein(HAP);quantitative analysis;near infrared spectroscopy

2017-01-09

范睿(1992-)，男，碩士研究生，研究方向：生物分析化學(xué),E-mail：fan_rui@126.com。

*通訊作者:孔玲(1974-)，女，博士，副教授，研究方向：生物分析、生物化工,E-mail:klucy@sdut.edu.cn。 陳志偉(1972-)，男，博士，教授，研究方向：生物分析化學(xué)、生物統(tǒng)計學(xué),E-mail:chen@sdut.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金面上項目(31071538)；山東省自然科學(xué)基金重點項目(ZR2013FB001)；山東省大型科學(xué)儀器升級改造項目(2011SJGZ10)。

TS207.3

:A

:1002-0306(2017)16-0253-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.048