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(揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225127)

細(xì)胞外膜蛋白酶編碼基因prtP對(duì)干酪乳桿菌粘附性的影響

黃宏軼,黃玲艷,彭景,劉冀婕,孫霽寒,許慧卿*

(揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225127)

目的:探究prtP基因與干酪乳桿菌(21858)粘附的相關(guān)性。方法:利用λ-Red同源重組方法,構(gòu)建21858prtP基因缺失突變株,并測(cè)定親本株和突變株的生長(zhǎng)曲線、疏水性、自凝聚率、對(duì)小腸粘液粘附率及細(xì)胞粘附性。結(jié)果:親本株與突變株生長(zhǎng)速度相似,突變株疏水率為44.1%,大于親本株的23.9%;突變株自凝聚率和對(duì)腸粘液的粘附率在各時(shí)間點(diǎn)均小于親本株,對(duì)細(xì)胞的粘附性也小于親本株。結(jié)論:prtP基因與干酪乳桿菌21858粘附性相關(guān),是決定干酪乳桿菌粘附性的重要因子。

干酪乳桿菌,prtP基因,突變株,粘附性

干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)屬于乳桿菌屬(Lactobacillus),對(duì)人體無(wú)毒副作用,廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵工業(yè)和功能性食品開(kāi)發(fā),特別是功能性乳制品[1-2]。干酪乳桿菌作為益生菌之一,被用作牛奶、酸乳、豆奶、奶油和干酪等乳制品的發(fā)酵劑及輔助發(fā)酵劑,尤其在干酪中應(yīng)用較多,是衛(wèi)生部公布的可用于保健食品的益生菌之一。干酪乳桿菌能夠耐受有機(jī)體的防御機(jī)制,包括唾液、胃酸、膽酸汁等[3],能在腸道內(nèi)大量定殖,發(fā)揮特定的生物學(xué)作用,包括降血壓、膽固醇,提高人體免疫力,預(yù)防癌癥和抑制腫瘤生長(zhǎng)另外還具有緩解乳糖不耐癥、過(guò)敏等益生保健作用[4-5]。由于其對(duì)人體的有益功能,成為人們關(guān)注和研究的焦點(diǎn)。

乳酸菌通過(guò)粘附于腸道黏膜形成穩(wěn)定的生物屏障,從而具有抑制病原菌地入侵和增殖等重要生理功能,因此乳酸菌的粘附性是評(píng)價(jià)其益生功能的重要指標(biāo)之一。動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)都證明只有粘附性好的益生菌才能在腸道內(nèi)定殖及繁殖,才能發(fā)揮特定的益生作用[6]。最新研究發(fā)現(xiàn),在乳酸乳球菌中,細(xì)胞外膜的絲氨酸蛋白酶lactocepin能介導(dǎo)乳酸菌的黏附作用[7]。而且在某些益生乳酸菌中,lactocepin對(duì)腸道炎性具有良好的抑制作用,能夠降解部分炎性細(xì)胞因子[8]。因此對(duì)這種細(xì)胞表面蛋白的深入研究不但可以提高益生菌的益生功能,且可為開(kāi)發(fā)腸道免疫調(diào)節(jié)制劑提供理論基礎(chǔ)。作為乳酸菌重要的胞外水解蛋白酶,lactocepin的蛋白質(zhì)水解功能已得到較為廣泛而深入的研究[6]。根據(jù)GenBank信息,lactocepin由位于質(zhì)粒的基因prtP編碼。本文通過(guò)λ-Red重組技術(shù),替換干酪乳桿菌的prtP基因,構(gòu)建干酪乳桿菌prtP基因突變株,通過(guò)測(cè)定親本株和突變株的疏水性,自凝聚率及對(duì)小腸粘液和細(xì)胞的粘附,研究prtP基因?qū)Ω衫胰闂U菌粘附性的影響。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

干酪乳桿菌(21858)、質(zhì)粒pKD3、質(zhì)粒pKD46、氯霉素抗性基因載體、小鼠脾臟細(xì)胞、小鼠巨噬細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)室保存;PCR引物、瓊脂糖 南京生興生物技術(shù)有限公司;Agrarose Gel DNA純化試劑盒 北京市科學(xué)器材公司;ICR小鼠 揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(蘇)2012-0004;MRS液體培養(yǎng)基 上海中科昆蟲(chóng)生物開(kāi)發(fā)有限公司;氨芐青霉素、氯霉素、Taq酶、marker、6×loading buffer、阿拉伯糖 上海生工生物工程有限公司;DMEM、DMEM/F-12(改良杜氏伊戈?duì)柵囵B(yǎng)基) 美國(guó)Hyclone公司;牛血清(FBS) 南京森貝伽生物科技有限公司;抗生素 上海生物工程有限公司。

AllegrX-22R臺(tái)式冷凍離心機(jī) BECKMAN COULTER;XB50小型制冰機(jī) 南京先歐儀器制造有限公司;Biophotometer plus核酸蛋白測(cè)定儀 德國(guó)艾本德公司;AllegraX-22R冷凍離心機(jī) 美國(guó)BECKMAN COULTER公司;Multiporator多功能細(xì)胞電穿孔儀 德國(guó)Eppendorf公司;數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng) 上海天能科技有限公司;GeneAmp9700 PCR儀 美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PCR引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)Genbank公布的序列,設(shè)計(jì)擴(kuò)增prtP基因的特異性引物見(jiàn)表1,用全菌裂解法進(jìn)行細(xì)菌DNA模板的制備。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 PCR引物Table 1 PCR primers

1.2.2 引物片段的擴(kuò)增 參考方法[9]通過(guò)λ-Red重組系統(tǒng)產(chǎn)生了基因缺失突變株。以質(zhì)粒pKD3為模板,用長(zhǎng)引物P1/P2通過(guò)PCR方法擴(kuò)增氯霉素片段,產(chǎn)物經(jīng)0.7%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后,用Agarose Gel DNA純化試劑盒純化回收DNA片段,-20 ℃保存。

PCR擴(kuò)增體系:總量為50 μL的反應(yīng)體系中加入2×Taq master mix,25 μL;上、下游引物各1 μL;pKD3 10 μL;補(bǔ)無(wú)菌超純水至50 μL,混勻。

PCR擴(kuò)增參數(shù):94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性1 min,58 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min 30 s,共30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

1.2.3 21858株prtP基因缺失突變株的構(gòu)建 將質(zhì)粒pKD46電轉(zhuǎn)入干酪乳桿菌21858以表達(dá)重組酶。將PCR擴(kuò)增的引物片段和含有pKD46的21858感受態(tài)細(xì)胞混勻,并將混合物加入到預(yù)冷的電擊杯中,調(diào)節(jié)電轉(zhuǎn)化儀至電壓為2500 V,啟動(dòng)電脈沖進(jìn)行電轉(zhuǎn)化,電擊后迅速加入1 mL預(yù)熱的MRS培養(yǎng)基,混勻,100 r/min,37 ℃復(fù)蘇4 h,分別取200 μL涂于含氨芐青霉素和氯霉素的雙抗MRS平板上,30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜,次日挑取含氨芐青霉素和氯霉素雙重抗性的菌落,將所得的雙抗菌落接種于新鮮的含氨芐青霉素和氯霉素的雙抗液體MRS培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜,設(shè)計(jì)引物P3/P4用PCR進(jìn)行鑒定,擴(kuò)增片段大小符合預(yù)期結(jié)果的即為正確的含氯霉素抗性的prtP基因缺失突變株21858Δ。將上述突變株接種于新鮮液體MRS培養(yǎng)基中,42 ℃培養(yǎng)2 h后,在37 ℃條件下于含氯霉素的抗性MRS平板上劃線分離培養(yǎng),次日對(duì)每個(gè)單菌落進(jìn)行氨芐青霉素及氯霉素抗性檢測(cè),挑選對(duì)氨芐青霉素敏感而具有氯霉素抗性的克隆,得到消除質(zhì)粒pKD46的重組菌株,稱為21858Δ。

1.2.4 21858親本株和突變株生物學(xué)特性

1.2.4.1 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[10]方法,并略作改動(dòng),將待測(cè)菌株加入100 mL的新鮮MRS液體培養(yǎng)基中(調(diào)節(jié)OD600=0.050),在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),期間每隔1 h取一次樣測(cè)OD600值,連續(xù)測(cè)30 h,MRS培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

1.2.4.2 MATH法測(cè)定菌株的疏水率 參照文獻(xiàn)[11]方法。無(wú)菌吸取200 μL 21858和21858Δ菌液于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)20 h。取一環(huán)培養(yǎng)物劃線于MRS固體平板,37 ℃厭氧培養(yǎng)20 h,挑取單菌落接種MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃厭氧培養(yǎng)20 h。將21858和21858Δ培養(yǎng)物4000 r/min離心10 min收集菌體,生理鹽水洗滌2次,每次10 mL,5000 r/min離心10 min。以生理鹽水為空白對(duì)照調(diào)整受試菌液濃度使A600=1.000,取2 mL調(diào)整好濃度的菌懸液,與2 mL二甲苯混合,渦旋2 min,室溫靜置30 min。取1 mL水相以生理鹽水為空白對(duì)照組,在600 nm下測(cè)定A值并記錄,按下式計(jì)算細(xì)菌表面疏水率(CSH,%)。

CHS(%)=[(A0-At)/A0]×100

其中，A0和At分別是與二甲苯混勻前和各時(shí)間點(diǎn)水相在600 nm下測(cè)得的A值。

1.2.4.3 菌株自凝聚能力的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[12]方法,將37 ℃厭氧乳酸菌培養(yǎng)物4000 r/min離心10 min收集菌體,用生理鹽水洗滌2次,每次10 mL,5000 r/min,離心10 min,以生理鹽水為空白對(duì)照調(diào)整受試菌液濃度使A600=1.000,取4 mL調(diào)整好的菌懸液于型號(hào)一致的試管中,室溫靜置,分別在靜置1、2、3、4、5 h后吸取1 mL的上層溶液測(cè)定600 nm吸光值,記作A1h、A2h、A3h、A4h,A5h,計(jì)算乳酸菌自凝聚的百分比。

其中:A0 h和At h分別為自凝聚前和各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上層溶液在600 nm下測(cè)得的A值。

1.2.4.4 腸粘附實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[13-14]方法,略作改動(dòng),將不同濃度21858和21858Δ PBS菌懸液各取1 mL于離心管中,8000 r/min離心10 min,棄上清,加1 mL 0.1%結(jié)晶紫水溶液,染色50 min,離心收集菌體,PBS洗滌5次,加1 mL檸檬酸鹽緩沖溶液重懸,室溫靜置60 min,測(cè)OD600值,建立OD600值與乳酸菌細(xì)胞數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取6～7周齡ICR小鼠,用小鼠固定器固定24 h后解剖,取小腸置于冰面,用無(wú)菌PBS緩沖液洗滌小腸三次后,將小腸縱向剪開(kāi),用載玻片刮取小腸內(nèi)表面粘液,加入2倍體積的PBS緩沖液,混勻,12000 r/min,4 ℃離心10 min,棄上清,-20 ℃保存。

取96孔板,每孔加入100 μL小鼠腸黏膜提取液,4 ℃過(guò)夜固定。去除未固定的粘液,每孔加入100 μL 1×108CFU/mL的乳酸菌懸液,4 ℃孵育2 h,用250 μL的PBS緩沖液洗滌4次,除去未粘附的乳酸菌,將96孔板置于60 ℃烘箱中30 min,每孔加入100 μL 0.1%結(jié)晶紫染色50 min,PBS洗滌5次,加入100 μL的檸檬酸緩沖溶液,室溫靜置60 min,測(cè)OD600值,根據(jù)所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多孔板中粘附的乳酸菌的數(shù)量,以粘附的乳酸菌數(shù)量與加入乳酸菌數(shù)的百分比表示菌株的粘附能力。

1.2.4.5 細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[15]并略作改動(dòng),將巨噬細(xì)胞和脾臟細(xì)胞以每孔1 mL(1×106個(gè)/mL)細(xì)胞懸液加入24孔板中,37 ℃含5% CO2-95%空氣培養(yǎng)箱中孵育48 h。待細(xì)胞貼壁完全,以無(wú)菌PBS洗滌2次,每孔加入1 mL濃度為1×108個(gè)CFU/mL的乳酸菌懸液,37 ℃含5% CO2-95%空氣培養(yǎng)箱中孵育1 h。用無(wú)菌PBS漂洗3次,然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲酸固定30 min,烘干后用結(jié)晶紫染色,在倒置顯微鏡下(10×40倍)觀察,最后用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍攝。

1.3數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1突變株21858Δ的鑒定

如圖1所示,根據(jù)GenBank公布的干酪乳桿菌的基因序列,分析啟動(dòng)子和開(kāi)放性閱讀框,結(jié)果顯示基因prtP擁有獨(dú)立的單個(gè)開(kāi)放閱讀框,含有7820 bp個(gè)堿基對(duì)。插入氯霉素突變后,以突變干酪乳桿菌為模板,用引物P3/P4進(jìn)行PCR鑒定,得到了1175 bp,與預(yù)期結(jié)果一致,且突變株可以在含氯霉素的抗性板上生長(zhǎng)而親本株不能生長(zhǎng),與預(yù)期結(jié)果一致。證實(shí)得到的菌株為干酪乳桿菌prtP基因敲除突變株21858Δ。

圖1 21858Δ的prtP基因PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of prtP fragment in Δ21858注:1:21858Δ prtP基因片段PCR擴(kuò)增條帶;M:200 bp的Marker。

2.2生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

由圖2可見(jiàn),突變株21858Δ的生長(zhǎng)速度與親本株21858相似,在衰亡期突變株略快,但沒(méi)有明顯差異(p>0.05),說(shuō)明敲除prtP基因并不影響菌株的生長(zhǎng)。

圖2 突變株和親本株的生長(zhǎng)曲線Fig.2 The growth curve for 21858 and 21858Δ

2.3疏水率

將菌液與二甲苯等體積混合后,經(jīng)過(guò)振蕩、靜置。通過(guò)計(jì)算測(cè)得21858Δ的疏水率為44.1%±1.5%,大于21858疏水率23.9%±0.62%,且兩者具有顯著差異(p<0.05)。疏水率被認(rèn)為是決定細(xì)菌非特異性粘附到生物表面的重要?jiǎng)恿?主要是由于其表面具有疏水性質(zhì)的蛋白質(zhì)、糖類及其他化合物所賦予的一種表面特性[16]。有研究顯示乳酸菌表層蛋白中的疏水性氨基酸使整個(gè)菌體表面具有一定的疏水性[17]。一般認(rèn)為疏水率較高的乳酸菌有著較高的粘附性,疏水率是評(píng)價(jià)乳酸菌粘附性的重要指標(biāo)[18]。但由于乳酸菌粘附機(jī)制的復(fù)雜性,除了疏水作用外還與表面多種成分和結(jié)構(gòu)有關(guān),使得數(shù)據(jù)間相關(guān)性較弱,這可能導(dǎo)致干酪乳桿菌粘附過(guò)程中疏水作用并不占主導(dǎo)地位。另外可能由于疏水率的測(cè)定方法有多種,方法不同得到的結(jié)果也有不同,甚至自相矛盾[19]。本實(shí)驗(yàn)提示敲除prtP基因會(huì)提高干酪乳桿菌的疏水率,可能由于prtP編碼的蛋白酶lactocepin含有親水基團(tuán)較多,在這種蛋白酶缺失后反而提升了干酪乳桿菌的疏水率,也可能是因?yàn)閜rtP基因敲除后使得菌株表面更多的疏水基團(tuán)打開(kāi),從而提高了干酪乳桿菌的疏水性。

2.4自凝聚實(shí)驗(yàn)

如圖3所示,自凝聚實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果顯示，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)親本株的自凝聚率均大于突變株,且時(shí)間越長(zhǎng)差距越明顯。自凝聚率與時(shí)間有較好的線性關(guān)系,21858自凝聚率和時(shí)間的線性方程為y=20.075x-11.601,相關(guān)系數(shù)為0.9957;21858Δ自凝聚和時(shí)間的線性方程為y=10.73x-2.53,相關(guān)系數(shù)為0.9941。且隨著時(shí)間延長(zhǎng),兩種菌株的自凝聚率都逐漸變大,從第2 h后具有顯著差異(p<0.05)。說(shuō)明敲除prtP基因會(huì)降低干酪乳桿菌的自凝聚率。有研究發(fā)現(xiàn)菌株的自凝聚能力與其粘附能力密切相關(guān),高凝聚力的菌株一般具有較高的粘附能力,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[20]。

圖3 乳酸菌21858和21858Δ的自凝聚率與時(shí)間關(guān)系Fig.3 The relationship between self-aggregation rate and time of 21858 and 21858Δ

2.5腸黏膜粘附實(shí)驗(yàn)

21858濃度與OD600 nm值線性相關(guān)(R2=0.9964),線性方程為y=0.0998x-0.0868,其中x為細(xì)菌數(shù)(×108CFU/mL),y為OD600 nm值。21858Δ濃度與OD600 nm值線性相關(guān)(R2=0.9931)線性方程為y=0.1123x-0.0648,其中x為細(xì)菌數(shù)(×108CFU/mL),y為OD600 nm值。通過(guò)以上方程計(jì)算乳酸菌小腸粘液粘附率,21858小腸粘液粘附率為4.638%±0.23%,21858Δ小腸粘液粘附率3.665%±0.45%。突變株的粘附性明顯低于親本株(p<0.05)。說(shuō)明敲除prtP基因明顯降低了干酪乳桿菌對(duì)小腸粘液的粘附性。

2.6細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)

如圖4所示為21858(a)和21858Δ(b)對(duì)巨噬細(xì)胞的黏附作用,圖4(a)中菌株對(duì)細(xì)胞的粘附性明顯大于圖4(b)。圖5為21858(a)和21858Δ(b)對(duì)脾臟細(xì)胞的粘附作用,21858對(duì)脾臟細(xì)胞的粘附性明顯大于21858Δ。細(xì)胞表面的粘附素受體是乳酸菌特異性粘附的主要機(jī)制,不同細(xì)胞的粘附素受體具有特異性[21],敲除prtP基因明顯降低了干酪乳桿菌對(duì)巨噬細(xì)胞和脾臟細(xì)胞的粘附性。這可能是因?yàn)閜rtP基因編碼的絲氨酸蛋白酶lactocepin能夠與細(xì)胞表面的特異性受體相結(jié)合,影響干酪乳桿菌的粘附性。這與小腸粘液粘附實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果一致,提示21858Δ與21858相比對(duì)腸粘液和巨噬細(xì)胞以及脾臟細(xì)胞的粘附性都降低了。

圖4 21858(a)和21858Δ(b)對(duì)巨噬細(xì)胞粘附性Fig.4 The adhesion of 21858(a) and Δ21858(b)on macrophage

圖5 21858(a)和21858Δ(b)對(duì)脾臟細(xì)胞的粘附性Fig.5 The adhesion of 21858(a) and 21858Δ(b)on spleen cells

3 結(jié)論

乳酸菌進(jìn)入宿主腸道后,最先接觸的是腸粘液層,然后才會(huì)進(jìn)入黏液層結(jié)合腸上皮細(xì)胞。由于乳酸菌粘附機(jī)制的復(fù)雜性,因此在使用體外模型時(shí)要綜合考慮對(duì)細(xì)胞和消化道表面粘液的粘附能力才能反映菌株在宿主內(nèi)的粘附情況。

本研究通過(guò)構(gòu)建prtP基因缺失的突變株21858Δ,測(cè)定其基本生物學(xué)特性,發(fā)現(xiàn)突變株和親本株生長(zhǎng)曲線類似,說(shuō)明prtP基因編碼的細(xì)胞膜蛋白酶lactocepin并不影響菌株的生長(zhǎng)。突變株自凝聚率在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都低于親本株,且時(shí)間越長(zhǎng)差距越明顯。但本實(shí)驗(yàn)中低粘附率的突變株卻顯示出較高的疏水率,21858Δ的疏水率為44.1%±1.5%,大于21858疏水率23.9%±0.62%。通過(guò)小腸粘液粘附實(shí)驗(yàn)21858的小腸粘液粘附率4.638%±0.23%,21858Δ的小腸粘液粘附率3.665%±0.45%。且21858Δ對(duì)腸粘液的粘附性明顯低于21858(p<0.05)。細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)也能直觀看到在敲除prtP基因后,對(duì)巨噬細(xì)胞和脾臟細(xì)胞的粘附力下降,提示prtP基因編碼細(xì)胞膜蛋白酶lactocepin對(duì)干酪乳桿菌的粘附能力有重要作用。乳酸菌的粘附能力是篩選益生菌的重要標(biāo)準(zhǔn)。接下來(lái),將通過(guò)體內(nèi)粘附實(shí)驗(yàn)及免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定prtP基因與干酪乳桿菌粘附性的關(guān)系并探討相關(guān)免疫機(jī)制。

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EffectofextracellularmembraneproteasegeneprtPontheadhesionofLactobacilluscasei

HUANGHong-yi,HUANGLing-yan,PENGJing,LIUJi-jie,SUNJi-han,XUHui-qing*

(School of Food Science and Engineering,Yangzhou University,Yangzhou 225127,China)

Objective:To explore the role of theprtPgene ofLactobacilluscasei(21858)in it’s adhesion. Methods:Using red homologous recombination method to build 21858prtPgene deletion mutant was built. And the growth curve,hydrophobic,auto-aggregation,the rate of intestinal mucus adhesion and the adhesion of cells were measured. Results:The growth curve was similar to the mutant strains. The hydrophobic rate of mutant strains was 44.1% greater than 23.9% of the parent strains. The auto-aggregation rate of mutant strains at each time points were less than the parent plants,and intestinal mucus adhesion rate of mutant strains was less than the parent plants. The adhesion of mutant strains to both cells were less than the parent plants. Conclusion:TheprtPgenes associated withLactobacilluscasei21858 adhesive,is an important factor in determining the adhesion of lactic acid bacteria.

Lactobacilluscasei;prtPgene;mutant strains;adhesion

2017-02-28

黃宏軼(1992-)，男，碩士研究生，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)，E-mail：503116150@qq.com。

*通訊作者:許慧卿(1972-)，女，博士，副教授，研究方向：食品加工及微生物生物技術(shù)，E-mail:yzuxhq@126.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31101305)；揚(yáng)州大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(x20160929)。

TS252

:A

:1002-0306(2017)16-0083-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.017