郭顏艷

1安徽理工大學(xué) 安徽淮南 232001；2滁州市疾病預(yù)防控制中心 安徽滁州 239001

2013年滁州市艾滋病病人亞型和耐藥結(jié)果分析

郭顏艷1，2

1安徽理工大學(xué) 安徽淮南 232001；2滁州市疾病預(yù)防控制中心 安徽滁州 239001

自從1996年提出的HAART（高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療）一方面顯著降低了艾滋病的死亡率和發(fā)病率，提高了艾滋病患者的生存質(zhì)量，延長(zhǎng)了艾滋病患者的生命，并且降低了傳染性，但是另一方面HIV-1具有高度的變異性和抗病毒藥物的選擇性壓力，且部分艾滋病病人的依從性差，導(dǎo)致HIV病毒產(chǎn)生耐藥突變。此次將滁州市2013年滁州市在治療大于一年的艾滋病病人的耐藥結(jié)果和亞型進(jìn)行分析，為艾滋病病人的治療做出療效評(píng)估和監(jiān)測(cè)。

滁州市；艾滋??；耐藥

1 材料與方法

1.1 樣品：采集滁州市2012年12月31日前所有在治療艾滋病病人血漿共 174份進(jìn)行病毒載量檢測(cè)，選取病毒載量檢測(cè)值＞1000CPS/ml的12位病人血漿繼續(xù)進(jìn)行HIV-1耐藥基因型檢測(cè)。

1.2 RNA提取 提取試劑采用法國(guó)梅里埃 NucliSENS miniMAG（1.0）核酸提取試劑手工提取。將 200ml病人血漿樣本加到裂解液管后充分混勻，并將試管在室溫中靜置裂解孵育10分鐘以上，將二氧化硅和內(nèi)標(biāo)的混合液100ul加入裂解液中靜置孵育10分鐘以上，嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行手工清洗，最后用洗脫緩沖液把吸附的核酸洗脫下來(lái)。洗脫下來(lái)的核酸及時(shí)轉(zhuǎn)移到無(wú)DNase和RNase的樣品保存管中。

1.3 NASBA反應(yīng) 加入引物在65度1分鐘，41度1分鐘預(yù)擴(kuò)增，加酶在41度等溫?cái)U(kuò)增1個(gè)小時(shí)。

1.4 巢式聚合酶聯(lián)鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 使用反擴(kuò)轉(zhuǎn)錄巢式 PCR擴(kuò)增HIV-1POL基因區(qū)片段。RNA逆轉(zhuǎn)錄和巢式第一輪PCR反應(yīng)體系使用的是Takara公司的一步法試劑盒AMV（Takara one step RNA PCR kit）試劑盒.第二輪擴(kuò)增使用TIANGEN 2×Taq PCR Master Mix試劑對(duì)第一輪的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第二輪 PCR。兩輪擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段約為1200bp.

1.5 RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增反應(yīng)和第二輪擴(kuò)增反應(yīng) 第一輪擴(kuò)增：引物 MAW26、HBX2、RT21、HBX2 各 0.5ul，酶 1ul，buffer12.5ul，無(wú)酶水5.5ul，RNA模板5ul，終體積為25ul。第二輪擴(kuò)增：引物PRO-1、HBX2、RT20各1ul，MIX25ul，無(wú)酶水18ul，RNA模板5ul，終體積為50度。

1.6 電泳 二輪PCR后的擴(kuò)增產(chǎn)物用EB作核酸染料跑1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.7 測(cè)序 PCR產(chǎn)物送由博邁德公司純化和測(cè)序。

1.8 把所得到的fasta格式的程序文件提交斯坦福大學(xué)HIV耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)（SHDB）得到耐藥結(jié)果。

2.結(jié)果

2.1 此次收集標(biāo)本均為2012年12月31日前所以在治療艾滋病病人血漿共174份。

其中病毒載量檢測(cè)檢測(cè)值＞1000的共12人。并對(duì)12人進(jìn)行耐藥檢測(cè).其中異性傳播10例，同性傳播2例，男性8人，女性4人。

2.2 亞型結(jié)果分析 在POL區(qū)的亞型結(jié)果分析中，12例標(biāo)本中有CRF01-AE重組亞型8例為最多，占66.7%（8/12），且兩例同性傳播亞型均為CRF01-AE重組亞型，其余四例均為B亞型。

2.3 耐藥基因情況分析

在12名抗病毒治療的病人標(biāo)本中有7例24個(gè)突變位點(diǎn)，沒(méi)有出現(xiàn)蛋白酶抑制劑主要耐藥相關(guān)突變，其中5例出現(xiàn)NRTIs和NNRTIs雙突變。其中M184V和K103N位點(diǎn)突變次數(shù)最多，分別為4例。K65R位點(diǎn)突變頻率為2次。見(jiàn)表1.

表1 ：滁州市在治療HIV-1病人相關(guān)耐藥突變

3.討論

隨著高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療在我國(guó)廣泛應(yīng)用，以及不斷增長(zhǎng)的HIV-1感染者人數(shù)。單一或者多重艾滋病病毒耐藥株也隨之產(chǎn)生并傳播。同時(shí)隨著耐藥株越來(lái)越多的出現(xiàn)，導(dǎo)致耐藥株的流行，以至于原發(fā)性耐藥感染者初次接受抗病毒治療后可能失敗或者無(wú)法持續(xù)控制HIV-1病毒復(fù)制。截止2012年12底我市在治療病人共 個(gè)，有12名病人病毒載量檢測(cè)值＞1000cps/ml，且只有7人出現(xiàn)不同程度耐藥突變，但是都沒(méi)有PI主要突變和次要突變，說(shuō)明目前使用的一線藥物對(duì)我市絕大部分HIV-1病人有效。在這12個(gè)病人的治療方案全部使用3TC，所以針對(duì)3TC的M184V位點(diǎn)頻率最高，引起3TC、FTC的高度耐藥同時(shí)引起 ABC的潛在耐藥。在一些調(diào)查研究中表明，K103N是所有NNRTIS治療的所有病人里最普遍和重要的突變，可能會(huì)對(duì)所有的非核苷類(lèi)反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑產(chǎn)生20到50貝的耐藥性。我市的12名病人突變次數(shù)最多K103N，和研究結(jié)果一致。12名病人中，治療時(shí)間最長(zhǎng)的病人只出現(xiàn)V106R突變，沒(méi)有產(chǎn)生耐藥，而出現(xiàn)多重藥物重度耐藥的病人治療時(shí)間才兩年。隨訪表明病人的服藥依從性差。在我市病人中，外出務(wù)工病人占了一部分，回來(lái)不便等各種原因?qū)е路幰缽男圆?，還有長(zhǎng)期使用同一種治療方案都有可能導(dǎo)致耐藥相關(guān)突變。要盡量可能提高這部分人群的服藥依從性，否則即使使用二線藥，也有可能產(chǎn)生耐藥或者治療失敗。且現(xiàn)在我市新發(fā)病人中MSM成了主力軍，據(jù)研究報(bào)道我國(guó)的男男新發(fā)感染人群里的原發(fā)性耐藥率竟然高達(dá) 14.4%，所以有必要對(duì)此人群進(jìn)行治療前耐藥檢測(cè)。在我實(shí)驗(yàn)室，耐藥檢測(cè)工作還未能開(kāi)展，為了指導(dǎo)臨床用藥，為了艾滋病防控提供技術(shù)支持，

[1]吳建軍，刑輝，沈月蘭，等.2008年安徽省原發(fā)HIV-1感染者耐藥毒株變異情況研究[J].中華疾病控制雜志，2011，15（1）：33-35

[2]劉建芳，嚴(yán)延生，林勛，等.福建省 HIV-1流行毒株基因分型與流行特征分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2006，22（7）：601-605，608.

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R512.91

A

1672-5018（2017）01-256-01

郭顏艷（1980.10-），女，漢族，籍貫：安徽省滁州市，學(xué)歷：研究生在讀，安徽理工大學(xué)。職稱(chēng)：主管檢驗(yàn)師。主要研究方向醫(yī)學(xué)免疫學(xué)。