張忠平,楊旭

(1.哈爾濱市食品質量安全檢測中心，哈爾濱 150036；2.哈爾濱市食品工業(yè)研究所，哈爾濱 150025；3.哈爾濱市食品工業(yè)研究所有限公司，哈爾濱 150025)

黑曲霉WS003固態(tài)發(fā)酵制備果膠酶條件的優(yōu)化

張忠平1,楊旭2,3*

(1.哈爾濱市食品質量安全檢測中心，哈爾濱 150036；2.哈爾濱市食品工業(yè)研究所，哈爾濱 150025；3.哈爾濱市食品工業(yè)研究所有限公司，哈爾濱 150025)

以豆粕和麩皮為主要培養(yǎng)基、黑曲霉WS003為發(fā)酵菌株，利用固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)果膠酶。通過單因素試驗確定了碳氮比為40∶1、菠蘿皮為誘導物、磷酸氫二鉀為無機營養(yǎng)鹽；采用正交試驗對培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。結果表明：菠蘿皮的添加量為0.15 g/10 g干基、發(fā)酵pH為6.0、磷酸氫二鉀濃度為0.2%時，果膠酶產(chǎn)酶活力最高，達到81.06 U/mL。

黑曲霉；固態(tài)發(fā)酵；果膠酶

黑曲霉是食品工業(yè)中重要的發(fā)酵菌種，可產(chǎn)生果膠酶、糖化酶、淀粉酶等多種酶，主要用于檸檬酸發(fā)酵、食醋和白酒制曲等方面。果膠質廣泛存在于植物中，有“粘合細胞組織”的作用，是植物細胞壁和胞間層的重要組分[1]。果膠酶是指分解果膠質復合酶的總稱[2]，應用于釀造果酒果醋、飼料、木材防腐、植物病防治和環(huán)境保護等方面。尤其是在食品行業(yè)中，果膠酶可以降低果汁、果酒以及果醋的粘度，提高出汁率，起著增加澄清度的作用。黑曲霉是國際上公認的安全發(fā)酵微生物[3]，用其生產(chǎn)果膠酶，發(fā)酵周期短、安全可靠、優(yōu)勢明顯。固態(tài)發(fā)酵法應用廣泛、歷史悠久，尤其是在酶制劑的生產(chǎn)中得到了普遍應用[4]。本試驗通過對黑曲霉高產(chǎn)果膠酶誘變菌株WS003固體發(fā)酵，采用單因素試驗和正交試驗確定其最佳產(chǎn)酶條件，旨在為果膠酶的生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉(Aspergillusniger)WS003：本實驗室提供；麩皮、豆粕：市售。

1.2 斜面培養(yǎng)基(PDA)

馬鈴薯200 g去皮，切塊煮沸30 min，紗布過濾，葡萄糖20 g及瓊脂20 g，補水至1000 mL，pH自然。

1.3 基礎培養(yǎng)基

麩皮10 g，豆粕0.25 g，裝入250 mL三角瓶中，料水比1∶1.5 (W/V)。

1.4固體發(fā)酵[5]

無菌水洗下斜面上的孢子，用裝有玻璃珠的三角瓶震蕩制成孢子懸液。將一定量的孢子懸液接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，36 ℃培養(yǎng)72 h。

1.5 果膠酶活力的測定方法

采用DNS法(3，5-二硝基水楊酸法)[6]，底物為pH 4.0的0.4%果膠溶液。取0.5 mL適當稀釋的發(fā)酵上清液，加入2 mL底物溶液，于45 ℃水浴30 min，加入DNS試劑混勻，煮沸5 min，立即冷卻定容至25 mL，540 nm處測吸光值?；盍Χx：上述條件下每1 min分解果膠產(chǎn)生1 μmol半乳糖醛酸所需的酶量定義為1個活力單位(U)。

2 結果與分析

2.1 不同誘導物對黑曲霉產(chǎn)果膠酶活力的影響

2.1.1 菠蘿皮對果膠酶活力的影響

分別將0.1,0.2,0.3,0.4 g的菠蘿皮粉作為誘導物添加到培養(yǎng)基中，接種一定量的黑曲霉懸液，置于36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，定期搖動，72 h后浸提，測定果膠酶活力，試驗結果見圖1。

在發(fā)酵過程中，菠蘿皮既可以作為碳源又可以作為誘導物。由圖1可知，其用量對產(chǎn)酶影響較大，在培養(yǎng)基中添加0.2 g菠蘿皮產(chǎn)果膠酶能力最強，達到66.12 U/mL，但隨著添加量的增加，菠蘿皮中的抑制產(chǎn)果膠酶成分會逐漸增加，造成果膠酶活力的下降。

2.1.2 西瓜皮對果膠酶活力的影響

分別將0.25，0.5，1，1.5，2.5，3 g的西瓜皮粉作為誘導物添加到培養(yǎng)基中，接種一定量的黑曲霉懸液，置于36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，定期搖動，72 h后浸提，測定果膠酶活力，試驗結果見圖2。

由圖2可知，在培養(yǎng)基中添加2.5 g的西瓜皮產(chǎn)果膠酶能力最大，達到了60.84 U/mL，但明顯不如以菠蘿皮為誘導物的果膠酶活力高，故選擇菠蘿皮作為適宜的誘導物，添加量為0.2 g/10 g干基。

2.2 不同發(fā)酵pH值對黑曲霉產(chǎn)果膠酶活力的影響

調(diào)整培養(yǎng)基用水的pH值分別為3.5，4.0，4.5，5.0，6.0，接種一定量的黑曲霉懸液，置于36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，定期搖動，72 h后浸提、測定果膠酶活力，試驗結果見圖3。

圖3 發(fā)酵pH對果膠酶活力的影響

由圖3可知，pH在5.0～6.0果膠酶活力較高，在64 U/mL左右，故選擇5.0～6.0為最適發(fā)酵pH值。

2.3 不同無機鹽對黑曲霉產(chǎn)果膠酶活力的影響

2.3.1 磷酸氫二鉀對果膠酶活力的影響

磷酸鹽非常適合微生物的生產(chǎn)，既可以起到一定的緩沖作用，又可以防止微生物代謝造成的培養(yǎng)基過酸或者過堿。在培養(yǎng)基中按照0.1%，0.2%，0.3%加入磷酸氫二鉀，接種一定量的黑曲霉懸液，置于36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，定期搖動，72 h后浸提，測定果膠酶活力，試驗結果見圖4。

圖4 磷酸氫二鉀對果膠酶活力的影響

由圖4可知，磷酸鹽在0.2%的濃度時，果膠酶活力最大，為65.87 U/mL，但更高濃度的磷酸鹽反而會對產(chǎn)酶有抑制作用，故選擇0.2%為最適的磷酸氫二鉀濃度。

2.3.2 硫酸鎂對果膠酶活力的影響

在培養(yǎng)基中按照0.1%，0.2%，0.3%加入MgSO4溶液，接種一定量的黑曲霉懸液，置于36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，定期搖動，72 h后浸提，測定果膠酶活力，試驗結果見圖5。

圖5 硫酸鎂對果膠酶活力的影響

由圖5可知，硫酸鎂的濃度為0.2%時，果膠酶活力最大，為61.79 U/mL。比較磷酸氫二鉀和硫酸鎂對果膠酶活力的影響，磷酸氫二鉀要大一些，故選擇磷酸氫二鉀作為最適的無機鹽。

2.4 不同碳氮比對黑曲霉產(chǎn)果膠酶活力的影響

菌體生長需要合適的碳源和氮源，不同的碳氮比例對果膠酶的發(fā)酵生產(chǎn)影響很大。選擇麩皮和豆粕為碳源和氮源，按比例20∶1，30∶1，40∶1，50∶1進行培養(yǎng)基配比，接種一定量的黑曲霉懸液，置于36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，定期搖動，72 h后浸提，測定果膠酶活力，試驗結果見圖6。

圖6 碳氮比對果膠酶活力的影響

由圖6可知，碳氮比為40∶1時，果膠酶活力最高，故選擇最適的碳氮比例為40∶1。

2.5 正交試驗對果膠酶活力的影響

選擇菠蘿皮添加量、磷酸氫二鉀濃度和發(fā)酵pH 3個因素為影響黑曲霉產(chǎn)酶條件的主要因素進行試驗，因素水平表見表1，正交試驗結果見表2。

表1 因素水平表

表2 正交試驗結果

由表2可知，對黑曲霉WS003產(chǎn)果膠酶影響因素從大到小的順序依次為：菠蘿皮添加量、pH和磷酸氫二鉀。分析結果表明A2B3C1為最佳組合，即菠蘿皮添加量為0.15 g/10 g干基、pH為6.0、磷酸氫二鉀濃度為0.2%，在此條件下，果膠酶活力可達81.06 U/mL。

3 結論

利用單因素試驗確定了黑曲霉WS003的培養(yǎng)條件：碳氮比為40∶1、菠蘿皮為誘導物、磷酸氫二鉀為無機營養(yǎng)鹽；通過正交試驗進一步優(yōu)化了培養(yǎng)條件。結果表明：菠蘿皮的添加量為0.15 g/10 g干基、發(fā)酵為pH 6.0、磷酸氫二鉀濃度為0.2%時，果膠酶活力最高，達到81.06 U/mL。

[1]蔣紅菊，楊加志，宋加妹，等.高產(chǎn)果膠酶菌株選育及發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化的研究進展[J].中國釀造，2010,224(11)：1.

[2]程紅，杜國軍，劉曉蘭，等.黑曲霉HY-M27產(chǎn)果膠酶固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].中國調(diào)味品，2012,37(12)：24.

[3]白愛枝，閆祖威，梁運章，等.黑曲霉產(chǎn)纖維素酶液體發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].食品科技，2008,32(3)：12.

[4]賀瑩，高麗芳，焦紅英.黑曲霉產(chǎn)糖化酶固態(tài)發(fā)酵營養(yǎng)條件優(yōu)化研究[J].中國釀造，2013,32(9)：88.

[5]王麗麗，劉曉蘭，鄭喜群，等.黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生果膠酶條件的優(yōu)化[J].食品科技，2008,32(5)：14.

[6]楊欣偉，林偉鈴，田寶玉，等.果膠酶高產(chǎn)菌株EIM-6的篩選鑒定及其液體發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].福建師范大學學報，2009，25(2)：69.

Optimization ofAspergillusnigerWS003 Producing Pectinase Conditions by Solid-state Fermentation Method

ZHANG Zhong-ping1, YANG Xu2,3*

(1.Harbin Testing Center for Food Quality and Safety,Harbin 150036,China; 2.Harbin Food Industry Institute,Harbin 150025,China;3.Harbin Food Industry Institute Co.,Ltd.,Harbin 150025,China)

Use soybean meal and wheat bran as main culture medium andAspergillusnigerWS003 as the fermentation strain,adopt solid-state fermentation method to produce pectinase.The single factor experiments are used to improve the fermentation conditions:the ratio of carbon and nitrogen is 40∶1, use pineapple peel as inducer and K2HPO4as inorganic salt.The orthogonal experiments are adopted to optimize the culture conditions.The results show that the optimal conditions of culture medium are as follows: additive amount of pineapple peel is 0.15 g/10 g dry basis,fermentation pH is 6.0, the concentration of K2HPO4is 0.2%.Under these conditions, the enzyme activity of pectinase is the highest,which can reach 81.06 U/mL.

Aspergillusniger；solid-state fermentation；pectinase

2017-03-10 *通訊作者

楊旭(1970-)，男，山東萊州人，高級工程師，研究方向：食品工程。

TS264.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.09.013

1000-9973(2017)09-0058-03