吳曉鵬，陳強(qiáng)，劉勤，喬濱，張衛(wèi)國(guó)

（河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤外科二病區(qū)，河南 洛陽(yáng) 471003）

MicroRNA-196a 對(duì)食管癌預(yù)后的評(píng)估價(jià)值及其生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制

吳曉鵬，陳強(qiáng)，劉勤，喬濱，張衛(wèi)國(guó)

（河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤外科二病區(qū)，河南 洛陽(yáng) 471003）

目的探討microRNA-196a（miR-196a）對(duì)食管癌預(yù)后的評(píng)估價(jià)值及其生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制。方法收集120例行食管癌根治性手術(shù)切除的食管癌組織及癌旁組織，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)組織miR-196a表達(dá)水平，分析miR-196a表達(dá)與食管癌患者臨床資料的關(guān)系。對(duì)食管癌患者進(jìn)行隨訪，記錄患者總生存期（OS）和無(wú)病生存期（DFS）；以O(shè)S和DFS作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單變量和多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)價(jià)患者預(yù)后的影響因素。分別采用miR-196a mimic、NC-mimic、miR-196a inhibitor、NC-inhibitor轉(zhuǎn)染食管癌TE1細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，Western blot檢測(cè)細(xì)胞ANXA1、NTN4、HMGA2、HOXB8蛋白表達(dá)。結(jié)果miR-196a在食管癌組織中表達(dá)水平高于癌旁組織（P＜0.05）；在TE1細(xì)胞中，miR-196a mimic組miR-196a表達(dá)水平高于NC-mimic組，miR-196a inhibitor組miR-196a表達(dá)水平低于NC-inhibitor組（P＜0.05），證實(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功。將食管癌患者按照miR-196a表達(dá)分為miR-196a高表達(dá)組51例和低表達(dá)組69例，miR-196a表達(dá)與年齡、性別、分化程度、N分期、腫瘤位置等無(wú)關(guān)（P＞0.05），隨著T分期、TNM分期和腫瘤直徑增加，miR-196a高表達(dá)率升高（P＜0.05）。生存分析顯示，miR-196a高表達(dá)患者總生存期（P=0.015）和無(wú)病生存期（P=0.017）低于miR-196a低表達(dá)者；單因素和多因素分析顯示，T分期、miR-196a表達(dá)是影響患者總生存期和無(wú)病生存期的的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0.05）。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第48～120 h，miR-196a mimic組吸光度值高于NC-mimic組，miR-196a inhibitor組吸光度值低于 NC-inhibitor組（P＜0.05）；Transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示，miR-196a mimic組穿膜細(xì)胞數(shù)量高于NC-mimic組，miR-196a inhibitor組穿膜細(xì)胞數(shù)量低于NC-inhibitor組（P＜ 0.05）；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，miR-196a mimic組細(xì)胞遷移距離高于NC-mimic組，miR-196a inhibitor組細(xì)胞遷移距離低于NC-inhibitor組（P＜0.05）。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-196a mimic組、NC-mimic組、miR-196a inhibitor組、NC-inhibitor組HMGA2、HOXB8蛋白表達(dá)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），miR-196a mimic組 ANXA1、NTN4蛋白表達(dá)低于 NC-mimic組，miR-196a inhibitor組 ANXA1、NTN4 蛋白表達(dá)高于NC-inhibitor組（P＜0.05）。結(jié)論miR-196a能夠作為食管癌預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)之一；miR-196a可能通過(guò)抑制ANXA1、NTN4基因的表達(dá)參與調(diào)控食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)行為。

微小RNA；食管癌；預(yù)后；增殖；侵襲；遷移

早期食管癌臨床癥狀不明顯[1]，其5年生存率僅為 15%～25%[2]。MicroRNAs（miRNAs）是一種非編碼的小分子RNA，含有20～22核苷酸，主要參與調(diào)控基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄。在惡性腫瘤中，miRNAs能夠抑制某些特殊的基因表達(dá)而發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用[3-4]。MicroRNA-196a（miR-196a）在不同類型腫瘤中表達(dá)差異較大，其所介導(dǎo)的生物學(xué)行為也不同[5-7]。本研究采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)食管癌癌組織和癌旁組織miR-196a表達(dá)水平，并進(jìn)一步通過(guò)體外培養(yǎng)食管癌細(xì)胞株，觀察miR-196a對(duì)食管癌遷移、侵襲、增殖等生物學(xué)行為的影響及可能作用機(jī)制，旨在探討miR-196a對(duì)食管癌的潛在臨床價(jià)值，現(xiàn)將研究成果總結(jié)報(bào)道如下。

1 資料與方法

收集河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院2009年4月至2011年4月行食管癌根治性手術(shù)切除的標(biāo)本組織120例，所有患者均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，患者術(shù)前未接受放療、化療等抗腫瘤治療。每例患者術(shù)中采集癌組織及癌旁組織（距癌組織邊緣≥5 cm），手術(shù)剪將樣本組織剪成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的塊狀，并立即置于液氮中保存。同時(shí)收集患者臨床資料，包括姓名、性別、年齡、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度（T分期）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N分期）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M分期）、分化程度，臨床病理分期參考美國(guó)癌癥國(guó)際聯(lián)盟抗癌分期手冊(cè)[8]（American joint c ommittee on cancer-international union against cancer staging manual）TNM 分 類 系統(tǒng)。本研究經(jīng)本院醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。對(duì)患者術(shù)后進(jìn)行隨訪，術(shù)后第1年每3個(gè)月隨訪1次，之后6個(gè)月隨訪1次。

1.2 細(xì)胞來(lái)源及處理

食管癌細(xì)胞株TE1細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心（American type culture collection，ATCC），TE1 細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素），恒溫培養(yǎng)箱中以37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前24 h用0.25%胰蛋白酶消化，以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度≥80%時(shí)開始轉(zhuǎn)染。TE1細(xì)胞分為4組：miR-196a mimic組、NC-mimic組、miR-196a inhibitor組和 NC-inhibitor組。取37.5 ng miR-196a mimic、NC-mimic、miR-196a inhibito或NC-inhibitor，溶于100μl無(wú)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（A液）靜置10 min，再取4μl Lipofectamine 2000TM，溶于100μl無(wú)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（B液）靜置5 min；A液和B液混勻后室溫靜置10 min。將混合液加入至培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h。棄去轉(zhuǎn)染液，加入2 ml DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)完全融合時(shí)收集上清液，按1∶3比例傳代培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，RIPA裂解液、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、胎牛血清、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自廣州碧云天生物技術(shù)研究所，Trizol試劑、RT-PCR反應(yīng)試劑盒、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000TM購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，miR-196a mimic/inhibitor特異性寡核苷酸序列委托上海生工生物工程股份有限公司合成設(shè)計(jì)，miR-196a mimic序列：5'-UAGGUAGUUUCAUGUUGUUGGG-3'，陰性對(duì)照（NC-mimic）序列：5'-UUUGUACUACACAAAAG UACUG-3'；miR-196a inhibitor序列：5'-UAGGUAG UUUCAUGUUGUUGGG-3'，陰性對(duì)照（NC-inhibitor）：5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAAA-3'，RNA 提取試劑、SYBR Premix ExTaqⅡ試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，Transwell小室、Matrigel人工基底膜購(gòu)自美國(guó)BD公司，兔抗人ANXA1多克隆抗體、兔抗人NTN4多克隆抗體、兔抗人HMGA2多克隆抗體、兔抗人HOXB8多克隆抗體、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購(gòu)自Santa Cruz公司，聚烯酰胺、PVDF膜、十二烷基硫酸鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 MTT增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用不含胎牛血清的培養(yǎng)基調(diào)整濃度為1×105/ml，接種于96孔板，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，分別于細(xì)胞接種0、24、48、72、96和 120 h時(shí)加入 MTT試劑（20μl/孔），孵育4 h后再向每孔中加入150μl DMSO，室溫下振蕩15 min，置于酶標(biāo)儀上檢測(cè)570 nm處吸光度值（A值），以評(píng)價(jià)細(xì)胞生長(zhǎng)能力。

1.4.2 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 用不含血清的培養(yǎng)基將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞濃度調(diào)整為1.0×105個(gè) /ml，Transwell上室每孔接種 150μl細(xì)胞，下室加入600μl含有20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基作為趨化劑，37℃培養(yǎng)48 h，輕輕拭去表面非侵襲性細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，蘇木精染色10 min，200倍熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)穿透濾膜的細(xì)胞數(shù)。

根據(jù)《山西省運(yùn)城市第二次水資源調(diào)查評(píng)價(jià)報(bào)告》中伍姓湖與地下水互補(bǔ)關(guān)系微弱的結(jié)論，加之歷時(shí)較短故不統(tǒng)計(jì)湖周邊浸潤(rùn)帶的散發(fā)量、湖面降水量和湖水滲漏補(bǔ)給量。

1.4.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合度≥70%時(shí)進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)。用記號(hào)筆在培養(yǎng)板后均勻劃間距為0.5 cm的橫線（確保每孔至少有4條線穿過(guò)），每孔中鋪1×105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞融合度≥80%時(shí)用無(wú)菌用移液槍槍頭在單層細(xì)胞沿底部劃出“一”字劃痕，PBS沖洗3次后，分別于培養(yǎng)12、24和48 h在顯微鏡下測(cè)量劃痕的寬度，并計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=（初始劃痕寬度-不同時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4.4 miR-196a靶基因預(yù)測(cè) 采用TargetScan軟件預(yù)測(cè)miR-196a靶基因，通過(guò)查詢基因數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank），對(duì)靶基因進(jìn)行篩選，靶基因滿足以下2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：①被基因數(shù)據(jù)庫(kù)收錄；②在既往的研究中顯示與食管癌進(jìn)展密切相關(guān)。按照上述標(biāo)準(zhǔn)，共有4個(gè)靶基因：ANXA1、NTN4、HMGA2、HOXB8 納入研究。

1.4.5 RT-PCR檢測(cè)組織和細(xì)胞miR-196a表達(dá)水平 組織總RNA提?。簭囊旱腥〕?0 mg組織樣本，充分研磨，加入1 ml Trizol裂解液，冰浴上靜置10 min。細(xì)胞總RNA提?。篜BS沖洗生長(zhǎng)狀態(tài)良好的TE1細(xì)胞，加入1 ml Trizol裂解液，冰浴上靜置10 min。紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm和280 nm處吸光度值，當(dāng)A260/A280＞2.0，說(shuō)明RNA純度合格。取2μl總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：2μl總RNA中加入 8μl無(wú)核酸酶水和2μl RT Primer，85℃反應(yīng)5 min后置于冰浴3 min。再向上述12μl混合物中加入 RT buffer 3μl、dNTP 0.5μl、RNase 1μl、ddH2O 8μl，反應(yīng)條件：37℃ 60 min，85℃ 5 min。取 5μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，利用SYBR Premix ExTaqⅡ試劑盒進(jìn)行RT-PCR，U6作為內(nèi)參，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 30 s，95℃變性 10 s，60℃延伸 40 s，35 個(gè)循環(huán)后 74℃延伸 5 min；設(shè)置熔解曲線：Melt curve：65～95℃，increment 0.5℃ 0.05min+plate read。miR-196a引物委托上海博尚生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，miR-196a引物，正向：5'-GAGAAGCAGCATGAGTA TTGGA-3'，反向：5'-GGATGTAGTTGAGGCACGTCT G-3'；U6 引物，正向：5'-CCAGCAAGAGCACAAGAG GAAGAG-3'，反向：5'-GGTCTACATGGCAACTGTGA GGAG-3'。miR-196a 表達(dá)量采用 2-△△ct表示，每個(gè)樣本均檢測(cè)3次。

1.4.6 Western blot檢測(cè) ANXA1、NTN4、HMGA2、HOXB8蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗，加入離心管中，再加入1 ml RIPA裂解液置于冰浴上裂解30min，4℃條件下離心15 min，BCA蛋白濃度試劑盒檢測(cè)蛋白純度。采用Western blot檢測(cè) E-cadherin、N-cadherin 蛋白水平，將20μg蛋白提取液置于10%SDS-PAGE電泳分離，常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜，加入5%脫脂牛奶孵育封閉2 h。加入 1∶500 ANXA1抗體、1∶500 NTN4抗體、1∶500 HMGA2抗體、1∶200 HOXB8抗體，4℃孵育24 h。再滴加二抗37℃孵育2 h。PBS沖洗3次，按照ECL化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒顯影，以GAPDH作為內(nèi)參照，分析目的條帶相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用one-way ANOVA分析，兩組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用百分率表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fishers確切概率法；生存分析采用Kaplan Meier法及Log-rank法檢驗(yàn)；采用單變量和多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)價(jià)患者預(yù)后的影響因素，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組織及細(xì)胞miR-196a表達(dá)

miR-196a在食管癌組織中表達(dá)水平高于癌旁組織（t=34.025，P=0.000，圖 1A）；在 TE1 細(xì)胞中，miR-196a mimic組miR-196a表達(dá)水平高于NC-mimic 組 （t=13.019，P=0.000），miR-196a inhibitor組miR-196a表達(dá)水平低于NC-inhibitor組（t=11.024，P=0.000，圖 1B），證實(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功。

2.2 miR-196a表達(dá)與食管癌患者臨床病理資料的關(guān)系

以食管癌miR-196a表達(dá)中位值（10.47±1.5）作為分界點(diǎn)，將食管癌分為兩組：miR-196a高表達(dá)組51例和低表達(dá)組69例，結(jié)果顯示miR-196a表達(dá)與年齡、性別、分化程度、N分期、腫瘤位置等無(wú)關(guān)（P＞0.05），隨著T分期、TNM分期和腫瘤直徑增加，miR-196a高表達(dá)率升高（P ＜0.05），見(jiàn)表 1。

2.3 miR-196a表達(dá)與食管癌患者生存預(yù)后的關(guān)系

生存分析顯示，miR-196a高表達(dá)患者總生存期（P=0.015，圖 2A）和無(wú)病生存期（P=0.017，圖 2B）低于miR-196a低表達(dá)者；單因素和多因素分析顯示，T分期、miR-196a表達(dá)是影響患者總生存期和無(wú)病生存期的的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.4 食管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第48～120 h，miR-196amimic組吸光度值高于NC-mimic組（P=0.021，圖3A），miR-196a inhibitor組吸光度值低于 NC-inhibitor組（t=2.913，P=0.013，圖3B）；Transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示，miR-196a mimic組穿膜細(xì)胞數(shù)高于NC-mimic 組（t=1.793，P=0.033，圖3C），miR-196a inhibitor組穿膜細(xì)胞數(shù)低于NC-inhibitor組（t=2.002，P=0.031，圖3C）；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，miR-196a mimic組細(xì)胞遷移距離高于NC-mimic組（t=7.045，P=0.000，圖3D），miR-196a inhibitor組細(xì)胞遷移距離低于 NC-inhibitor組（t=2.547，P=0.019，圖 3D）。

表1 miR-196a表達(dá)與食管癌患者臨床病理資料的關(guān)系

圖1 食管癌組織及細(xì)胞miR-196a表達(dá)

圖2 miR-196a高表達(dá)和低表達(dá)食管癌患者總生存期和無(wú)病生存期的Kapl an-M ei er曲線

表2 單因素和多因素分析影響食管癌O S和D FS的臨床病理因素

2.5 食管癌細(xì)胞 AN XA1、N TN 4、H M G A2、H O XB8蛋白表達(dá)

圖3 食管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力

圖4 食管癌細(xì)胞AN XA1、N TN 4、H M G A2、H O XB8蛋白表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-196a mimic組 、NC-mimic 組 、miR-196a inhibitor組 、NC-inhibitor組HMGA2、HOXB8蛋白表達(dá)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），miR-196a mimic組 ANXA1、NTN4蛋白表達(dá)低于NC-mimic組（t=13.009和15.094，均 P=0.000），miR-196a inhibitor組 ANXA1、NTN4蛋白表達(dá)高于NC-inhibitor組（t=22.174和 19.382，均 P=0.000），見(jiàn)圖 4。

3 討論

MicroRNAs是廣泛存在于真核生物和人類的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在腫瘤方面，miRNAs可以作為抑癌基因和癌基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。miR-196a是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與惡性腫瘤密切相關(guān)的miRNA，其包括miR-196a-1和miR-196a-2兩個(gè)編碼基因[9-11]。有報(bào)道稱[12]miR-196a-2基因T/C多態(tài)性能夠影響miR-196a對(duì)靶點(diǎn)的識(shí)別，攜帶GG基因型的miR-196a胃癌患者預(yù)后較差，提示miR-196a與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)。不同起源的惡性腫瘤miR-196a表達(dá)存在一定差異，并且由miR-196a介導(dǎo)的生物學(xué)行為也不同。TSAI等[13]報(bào)道稱食管癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤等癌組織中miR-196a表達(dá)升高，而在乳腺癌、黑色素瘤等組織中表達(dá)下調(diào)。

本研究顯示食管癌組織miR-196a表達(dá)水平高于癌旁組織，提示miR-196a可能作為癌基因參與食管癌的進(jìn)展。分析miR-196a與食管癌患者臨床病理資料的關(guān)系，結(jié)果顯示miR-196a表達(dá)與T分期、TNM分期和腫瘤直徑有關(guān)，即隨著T分期、TNM分期和腫瘤直徑增加，miR-196a高表達(dá)率升高。本研究提示miR-196a或許可以作為食管癌預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)。為了證實(shí)上述猜測(cè)，本研究統(tǒng)計(jì)了食管癌患者術(shù)后隨訪資料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-196a高表達(dá)患者總生存期和無(wú)病生存期低于miR-196a低表達(dá)者，說(shuō)明miR-196a高表達(dá)與食管癌不良預(yù)后有關(guān)。單因素和多因素分析也證實(shí)，T分期、miR-196a表達(dá)是影響患者總生存期和無(wú)病生存期的的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。GOCZE等[14]報(bào)道稱miR-196a rs11614913多態(tài)性是預(yù)測(cè)胃癌預(yù)后的敏感指標(biāo)，并能夠?yàn)轭A(yù)測(cè)胃癌化療敏感型提供參考。但是在不同來(lái)源腫瘤中miR-196a的預(yù)測(cè)價(jià)值不完全一樣，比如GUO等[15]報(bào)道稱miR-196a高表達(dá)的宮頸癌患者5年生存率高于低表達(dá)者，miR-196a過(guò)表達(dá)與宮頸癌細(xì)胞增殖抑制有關(guān)。

miRNAs參與調(diào)控腫瘤的機(jī)制較為復(fù)雜，包括受到轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、與靶基因之間的調(diào)控以及受到競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA的調(diào)控等。RICHARDS等[16]報(bào)道稱miR-196a能夠與靶基因3'-UTR的區(qū)域microRNA反應(yīng)元件競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，阻斷miRNA對(duì)靶基因的抑制作用而參與腫瘤的調(diào)控。本研究分別采用miR-196a mimic和miR-196a inhibitor轉(zhuǎn)染食管癌TE1細(xì)胞，結(jié)果顯示miR-196a mimic組吸光度值、穿膜細(xì)胞數(shù)量、胞遷移距離高于NC-mimic組，miR-196a inhibitor組吸光度值、穿膜細(xì)胞數(shù)量、胞遷移距離低于NC-inhibitor組，說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-196a能夠促進(jìn)TE1細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，而抑制miR-196a則能阻斷上述生物學(xué)行為。

進(jìn)一步分析miR-196a潛在的調(diào)控靶基因，結(jié)果顯示miR-196amimic組、NC-mimic組、miR-196ainhibitor組 、NC-inhibitor 組 HMGA2、HOXB8蛋白表達(dá)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，miR-196a mimic組 ANXA1、NTN4蛋白表達(dá)低于NC-mimic 組，miR-196a inhibitor組 ANXA1、NTN4蛋白表達(dá)高于NC-inhibitor組，說(shuō)明miR-196a過(guò)表達(dá)能夠抑制 ANXA1、NTN4 基因，ANXA1、NTN4 可能是miR-196a調(diào)控的靶基因之一。ANXA1以抑癌基因參與腫瘤的調(diào)控，既往研究[17]證實(shí)ANXA1能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞的凋亡；ZHANG等[18]證實(shí)在食管癌中，ANXA1能夠激活MAPKs和JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞由增殖轉(zhuǎn)向凋亡。NTN4是神經(jīng)生長(zhǎng)因子（netrin）家族成員之一，具有促進(jìn)軸突生長(zhǎng)、分支形成的作用。結(jié)合本研究結(jié)果，說(shuō)明miR-196a可能通過(guò)抑制ANXA1、NTN4基因的表達(dá)發(fā)揮細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的誘導(dǎo)作用。但是限于本研究的局限性在于，未對(duì)miR-196a調(diào)控ANXA1、NTN4的信號(hào)通路進(jìn)行分析，這也是接下來(lái)研究工作的重點(diǎn)。

綜上所述，miR-196a能夠作為食管癌預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)之一；miR-196a可能通過(guò)抑制 ANXA1、NTN4基因的表達(dá)參與調(diào)控食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)行為。

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（張蕾 編輯）

Prognostic value of miR-196a in esophageal carcinoma and its regulatory mechanism of biological behavior

Xiao-peng Wu,Qiang Chen,Qin Liu,Bin Qiao,Wei-guo Zhang
(Department of Cancer Surgery,the First Affiliated Hospital,Henan University of Science and Technology,Luoyang,Henan 471003,China)

ObjectiveTo explore the prognostic value of miR-196a in esophageal carcinoma and its regulatory mechanism of biological behavior.MethodsEsophageal carcinoma tissues and paracancerous tissues were collected from 120 patients.miR-196a expression level was detected by RT-PCR.The relationships between miR-196a expression and clinical data were analyzed.The esophageal carcinoma patients were followed up.The overallsurvival (OS)and disease-free survival (DFS)were recorded.Taking OS and DFS as evaluation indexes,the prognostic factors were evaluated by univariate and multivariate Cox proportional hazards models.The TE1 cells were transfected with miR-196a mimic,NC-mimic,miR-196a inhibitor and NC-inhibitor.Cell proliferative ability was detected by MTT assay,invasive ability was detected by Transwell assay,migratory ability was detected by cell scratch assay.ANXA1,NTN4,HMGA2 and HOXB8 protein expressions in the cells were detected by Western blot.ResultsThe expression of miR-196a in the esophageal carcinoma tissues was significantly higher than that in the paracancerous tissues(P＜0.05).In the TE1 cells,the expression of miR-196a in the miR-196a mimic group was significantly higher than that in the NC-mimic group,the expression of miR-196a in the miR-196a inhibitor group was significantly lower than that in the NC-inhibitor group (P＜0.05),which confirmed the cell transfection experiment was successful.The esophageal carcinoma patients were divided into miR-196a high-expression group(51 cases)and miR-196a low-expression group (69 cases)according to the miR-196a expression.miR-196a expression was not related to age,sex,differentiation,N stage or tumor location (P＞0.05).With the increase of T staging,TNM stage and tumor diameter,the high-expression rate of miR-196a was significantly increased(P＜0.05).Survival analysis showed that OS and DFS in the miR-196a high-expression group were significantly lower than those in the miR-196a low-expression group (P＜0.05).Univariate and multivariate analyses showed that T stage and miR-196a expression were the independent risk factors for OS and DFS(P＜0.05).MTT experimental showed that in the 48th-120th h,the absorbance value of the miR-196a mimic group was significantly higher than that of the NC-mimic group,while the absorbance value of the miR-196a inhibitor group was significantly lower than that of the NC-inhibitor group(P＜0.05).Transwell chamber experiment showed that the number of transmembrane cells in the miR-196a mimic group was significantly larger than that in the NC-mimic group,and the number of transmembrane cells in the miR-196a inhibitor group was significantly smaller than that in the NC-inhibitor group(P＜0.05).Cell scratch test showed that the cell migration distance in the miR-196a mimic group was significantly longer than that in the NC-mimic group,and the cell migration distance in the miR-196a inhibitor group was significantly shorter than the NC-inhibitor group (P＜0.05).Western blot showed that there was no significant difference in HMGA2 or HOXB8 protein expression among the 4 TE1 cell groups (P＞0.05);the expressions of ANXA1 and NTN4 proteins in the miR-196a mimic group were significantly lower than those in the NC-mimic group,but the expressions of ANXA1 and NTN4 proteins in the miR-196a inhibitor group were significantly higher than those in the NC-inhibitor group (P＜0.05).ConclusionsmiR-196a can be used as one of the indexes predicting the prognosis of esophageal carcinoma.It may inhibit the proliferation,invasion and migration of esophageal cancer cells by inhibiting the expressions ofANXA1andNTN4genes.

microRNA;esophageal carcinoma;prognosis;proliferation;invasion;migration

R735.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.13.010

1005-8982（2017）13-0050-08

2017-01-05