陳藝丹，潘一峰，趙天力

（1.中南大學湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008；2.中南大學湘雅醫(yī)院肝膽腸研究中心，湖南 長沙 410008；3.中南大學湘雅二醫(yī)院心血管外科，湖南 長沙 410011）

可降解室間隔缺損封堵器的安全性與有效性的動物實驗研究

陳藝丹1，潘一峰2，趙天力3

（1.中南大學湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008；2.中南大學湘雅醫(yī)院肝膽腸研究中心，湖南 長沙 410008；3.中南大學湘雅二醫(yī)院心血管外科，湖南 長沙 410011）

目的評價新型可吸收封堵器的生物安全性、相容性、可行性和有效性，為臨床應用提供參考。方法選取實驗動物成年比格犬27只，17只實驗組用犬通過開胸B超引導下經右室游離壁穿刺室間隔方法復制室間隔缺損（VSD）動物模型，模型犬復制后，即刻植入可吸收VSD封堵器，術后抽血查生化指標，并在第3、6、9和12個月隨機處死3只實驗組犬和2只對照組犬，取其心臟及其他臟器標本。通過比較血液生化指標、心臟大體標本、病理學、免疫組織化學檢查，對其他器官進行病理學檢查，評價新型可吸收封堵器植入后的安全性及有效性。結果所有實驗用犬均存活，無并發(fā)癥，病理組織學檢查示封堵器逐漸被破壞吸收并完全被纖維組織及內皮細胞覆蓋，免疫組織化學檢查示封堵器表面逐漸出現(xiàn)上皮細胞，并可見新生血管組織。結論新型可吸收封堵器設計科學合理、操作簡便，具有很好的生物相容性，其內皮化完全且迅速，并發(fā)癥少，可有效的封堵VSD，具有良好的臨床安全性應用前景。

室間隔缺損；比格犬；可吸收封堵器；經胸介入；食管超聲

室間隔缺損（ventricular septal defect，VSD）是最常見的先天性心臟缺損之一，占所有先天性心臟病的20%左右[1]。自從2002年AMPLATZER發(fā)明偏心型鎳鈦合金室間隔缺損封堵器，取得不錯的短中期療效，但也出現(xiàn)許多無法忽視的并發(fā)癥，特別是遠期房室傳導阻滯，這也是美國食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）拒絕審批該封堵器在美國上市的主要原因[2]。而許多假說認為[3]遠期房室傳導阻滯與其封堵器在室間隔長期刺激有關，并且金屬封堵器永久留存心臟內的遠期安全性尚缺乏遠期隨訪資料。本研究選用可降解高分子聚合材料聚對二氧環(huán)己酮（polydiox-anone，PDO）、聚左旋乳酸（poly-L-lactic acid，PLA）無紡布和聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）制作而成的可吸收VSD封堵器，通過經胸介入的方法置入實驗動物體內，并對其生物安全性和有效性進行評估。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取實驗動物成年比格犬17只為實驗組，雌性，體重（19.60～26.80）kg，平均（22.92±1.48）kg。另外選取成年比格犬10只為對照組，雌性，體重（18.50～25.90）kg，平均（23.82±1.96）kg，兩組體重比較差異無統(tǒng)計學意義。

實驗用比格犬均由中南大學實驗動物中心提供，中南大學實驗動物中心鑒定為純種比格犬，采購自四川成都比格犬飼養(yǎng)基地。HE染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）和CD34染色試劑盒（美國Vector公司）由中南大學湘雅二醫(yī)院病理科提供。

1.2 儀器與設備

實驗用封堵器、封堵器輸送裝置及超聲儀器（美國GE公司）由上海形狀記憶公司提供。

1.3 實驗過程

1.3.1 麻醉 實驗犬以丙泊酚1.5 mg/kg靜脈推注，氯胺酮10 mg/kg、地西泮0.3 mg/kg肌內注射，約 5～10 min即可誘導麻醉，呈仰臥位固定于手術床上，經口氣管插管接呼吸機。

1.3.2 復制VSD模型 犬的胸廓區(qū)常規(guī)消毒、鋪單，經右胸3、4肋間切口進胸，于右室游離壁經6 F動脈鞘管內芯緩慢送入鈍頭穿刺針，經胸彩色B超（彩超）下使針尖指向室間隔，穿過室間隔后有“落空感”，鞘管內芯繼續(xù)前送少許，退出穿刺針，經鞘管內芯送入導絲，B超下可見導絲于左室內彎曲呈環(huán)，犬VSD模型復制成功。通過彩超看VSD穿刺大?。ㄒ话銥?～4mm）是否符合VSD模型要求。

1.3.3 植入VSD封堵器 沿制備模型實驗中保留的導絲送入7 F小切口專用輸送鞘管至左室內，退出導絲及擴張鞘。封堵器（腰長為6 mm）均由鼠齒鉗推送桿負載送入輸送鞘，彩超觀察下先后釋放左室及右室盤面。觀察5 min左右，再次彩超確認封堵器未發(fā)生偏移、脫落、殘余漏等，止血后逐層關胸。

1.3.4 術后處理 實驗當天抽取所有犬只血液送檢血常規(guī)、凝血功能、C反應蛋白、血沉及肝腎功能，術后第3天復查，處死前復查。

所有犬只術后由中南大學實驗動物中心繼續(xù)飼養(yǎng)。喂養(yǎng)環(huán)境保持溫度18～30℃，濕度40%～50%，每日喂食，術后常規(guī)應用氨芐青霉素3 d（0.5 g/d），喂服阿司匹林腸溶片5 mg/（kg·d），直至處死。

術后第3、6、9、12和24個月分別隨機取3只實驗組犬和2只對照組犬再次實行全身麻醉，經胸彩超評估實驗組犬體內可吸收封堵器超聲下影像表現(xiàn)，然后予以推注10%氯化鉀50 ml，待心臟停跳后取出心臟，大體觀察封堵器位置、形態(tài)及盤面組織覆蓋情況。

1.3.5 體內吸收速率與內皮化速率測定 對所取實驗組大體標本每個盤面各切兩片，一片進行HE染色，制成病理學標本，另一片用CD34（內皮細胞標志物）進行免疫組織化學標記，并采用SP法（AEC染色）制成免疫組織化學切片。

在不同時間點（第 1、3、6、9、12和 24個月）的每組標本不同盤面（A、B、C、D面）的病理學切片中各隨機取15個點（放大倍數(shù)×400），測算其空泡面積，以時間為橫坐標，空泡吸收率（1-空泡面積/總面積×100%）縱坐標，畫出體內吸收率變化曲線。

在不同時間點（第 1、3、6、9、12和24個月）的每組標本不同盤面（A、B、C、D面）的免疫組織化學切片中各隨機取15個點（放大倍數(shù)×400），測算內皮細胞，以時間為橫坐標，內皮化（內皮細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%）為縱坐標，畫出體內吸收率變化曲線。

1.3.6 生物毒性相關研究 術后處死犬只進行實驗組和對照組對比，比較兩組心肌組織外觀有無區(qū)別，有無明顯壞死灶，并對肝臟、脾臟、腎臟、肺部進行外觀比較。然后對其進行細胞形態(tài)學檢測比較。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較用 t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 封堵成功率

共對17只復制VSD模型的實驗比格犬分別植入可吸收VSD封堵器，均成功植入，成功率為100%。超聲觀測下記錄、觀察封堵器的位置、形態(tài)，結果顯示17只實驗犬植入的可吸收VSD封堵器位置理想，雙側盤面平整無移位（見圖1）。

2.2 術后一般狀態(tài)

實驗犬術后一般情況良好，無死亡，無并發(fā)癥，進食正常，活動無異常，無偏癱，無行為異常，無肉眼血尿及黑便。實驗組犬與對照組犬術后狀態(tài)未見差異。術后血常規(guī)、C反應蛋白除術后當天外，差異無統(tǒng)計學意義，肝腎功能、凝血功能、血沉差異無統(tǒng)計學意義。見附表。

2.3 大體解剖

實驗組犬與對照組犬心臟大體標本無明顯差別，除實驗組犬心臟封堵器處有薄層組織覆蓋外，兩組均未見明顯壞死組織及其他異常。

圖1 經胸超聲介入下室間隔缺損封堵術

附表 兩組術后生化結果比較 （±s）

附表 兩組術后生化結果比較 （±s）

組別術后當天實驗組白細胞/（×109/L）21.15±3.26紅細胞/（×1012/L）7.05±2.17血小板/（×109/L）756.16±89.65谷丙轉氨酶/（u/L）23.71±18.65谷草轉氨酶/（u/L）32.17±15.46對照組 8.72±4.58 8.04±3.17 796.27±95.46 32.53±27.16 29.48±12.95 t值 3.629 -0.340 -0.480 -0.442 0.201 P值 0.018 0.378 0.332 0.344 0.427術后第3天實驗組12.89±4.297.68±2.26752.75±87.1524.19±15.9633.15±16.73對照組 8.96±4.87 8.16±4.18 789.25±102.47 33.09±21.65 28.15±11.53 t值 0.958 -0.173 -0.432 -0.540 0.360 P值 0.204 0.437 0.347 0.313 0.371術后3個月實驗組9.17±2.967.97±1.85769.37±92.3725.81±17.5433.04±17.09對照組 8.84±3.75 7.63±3.81 762.14±91.03 24.22±19.50 31.78±16.03 t值 0.111 0.140 0.086 0.096 0.082 P值 0.459 0.449 0.468 0.465 0.470術后6個月實驗組9.01±3.578.80±2.69742.15±113.9625.13±15.7030.33±15.98對照組 8.82±4.21 8.09±3.01 769.26±106.39 27.09±20.19 30.86±15.20 t值 0.055 0.278 -0.266 -0.124 -0.037 P值 0.480 0.400 0.404 0.455 0.486術后9個月實驗組7.99±5.207.56±3.84749.28±121.7726.67±14.9232.06±14.71對照組 8.29±3.96 8.14±4.02 751.02±109.35 29.83±14.65 33.13±18.63 t值 -0.068 -0.163 -0.162 -0.233 -0.073 P值 0.475 0.440 0.494 0.415 0.473

續(xù)附表

實驗組可吸收VSD封堵器植入位置理想，瓣膜均不受影響，術后第1個月標本可見封堵器雙側盤面均有一薄層透亮組織覆蓋，盤面邊緣部分與周圍組織融合，無血栓和贅生物，術后第3、6個月，標本顯示封堵器雙側盤面上覆蓋的組織逐漸增厚，手感封堵器PDO絲變脆，其左側盤面結構平整，腱索與盤面無黏連，盤面均未發(fā)現(xiàn)血栓，術后第12個月封堵器PDO絲進一步變脆，并逐漸柔軟，大部分被吸收（見圖2）。封堵器在超聲下聲像在第3個月時最強，第12個月時最弱，幾乎難以在超聲下看到（見圖3），說明封堵器隨著時間逐漸被吸收。

2.4 其他重要臟器

心臟、肝、脾、肺、雙腎等大體標本觀察未見異常，實驗組犬與對照組犬未見差異。

2.5 病理組織學檢查結果

兩組犬只心臟、肝、脾、肺、雙腎細胞形態(tài)學差異無統(tǒng)計學意義。取出實驗組大體標本后本研究按上述方法進行分組對封堵器表面組織各個盤面組織行光鏡組織學檢查。封堵器表面被纖維組織和其表面的內皮細胞覆蓋，可見少量慢性炎癥細胞存在。經染色，封堵器雙側盤面組織覆蓋情況無明顯差異。封堵器在第3個月還可見較為完整的封堵器晶體，第6個月晶體逐漸破碎，第9個月晶體空隙逐漸被填滿，第12個月組織逐漸規(guī)則排列于晶體空隙中（見圖4）。

圖2 不同時期右室面大體觀

2.6 免疫組織化學檢查結果

取出實驗組大體標本后本研究按上述方法進行分組對封堵器表面組織各個盤面組織行免疫組織化學檢查?？梢姺舛缕鞅砻娼M織在第3個月上皮細胞（紅色為上皮細胞，藍色為其他細胞細胞核）已經大量覆蓋，第6個月逐漸增多，第12個月后基本全部被上皮組織覆蓋，并可見新生血管組織。見圖5。

2.7 體內吸收速率與內皮化速率

實驗組封堵器在第3個月已經開始被逐漸裂解，但吸收率不高，第3個月封堵器開始裂解，第12個月吸收率增高（47.3%）。見圖6。

封堵器在第3個月上皮細胞已大量覆蓋（90.2%），第6個月進一步增多，第12個月后基本全部被上皮組織覆蓋（95.9%）。見圖7。

圖3 封堵器在不同時期超聲下影像

圖4 病理組織學檢查結果 （×100）

圖5 免疫組織化學檢查結果 （×400）

圖6 可吸收封堵器體內吸收率

圖7 可吸收封堵器體內上皮細胞覆蓋率

3 討論

VSD的傳統(tǒng)治療方法為體外循環(huán)下心內直視手術修補，但由于其創(chuàng)傷大、體外循環(huán)輔助相關并發(fā)癥多、需要輸血等[4-5]無可避免的缺點，越來越多的心臟科醫(yī)師開始尋求更微創(chuàng)的治療方式，1998年AMPLATZER封堵器的問世使室間隔缺損的介入治療成為可能，而室間隔缺損的介入治療一直以來便是結構性心臟病治療領域的一大爭議以及難題，美國FDA由于鎳鈦合金的遠期并發(fā)癥率過高一直未批準其應用于室間隔缺損[2]，可吸收性室間隔缺損封堵器被認為可以避免遠期并發(fā)癥，因此也成為國內外研究熱點之一[6-9]。本研究中可吸收封堵器所采用的制備材料PDO、PLA和PGA均已在臨床應用于可吸收縫線[10]、外科修補補片[11]和呼吸管道修復[12]中，已被證明具有良好的安全性能和可吸收性。

文獻報道[6-8]對可吸收封堵器的介入路徑采取的是經皮介入治療，但是可吸收封堵器的彈性恢復能力較鎳鈦記憶合金差，而經皮介入路徑長，且釋放回收等操作較復雜，因此并未取得很好的實驗效果。隨著介入治療的發(fā)展，一種新型的介入治療方式——食管超聲下經胸介入治療開始出現(xiàn)[13]，該方式主要是通過食管超聲的引導，在胸前小切口內，通過心臟表面直接將封堵器置入心臟內，從而達到封堵缺損的目的，該方式具有路徑短、路徑垂直于缺損、操作易掌握等優(yōu)點[14-15]。

本研究對PDO、PLA和PGA制成的可吸收室間隔缺損封堵器進行動物實驗研究，利用食道超聲下經胸介入路徑成功將所有封堵器置入實驗用犬體內，且封堵效果滿意。所有生化檢驗結果除術后當天白細胞和C反應蛋白兩組有差異外，其余均無差異，可見白細胞與C反應蛋白為術后正常反應性增高，封堵器置入無明顯毒副作用。整個實驗過程期間，無1例死亡，無栓塞、三度房室傳導阻滯等嚴重并發(fā)癥，所有實驗用犬術后均恢復良好，組織學檢查也證明其吸收率及上皮細胞覆蓋率均令人滿意，既沒有出現(xiàn)吸收過快室間隔缺損再通的現(xiàn)象，也沒有出現(xiàn)不吸收的情況。另還有5只實驗用犬有待第18個月和第24個月制成標本，進一步研究觀察，補充數(shù)據。

盡管本次研究實驗結果令人滿意，但是由于復制的室間隔缺損模型室缺直徑較小，并且為即刻置入封堵器，損傷后的炎癥反應較重，未能完全模擬臨床病情，因此該封堵器的有效性和安全性仍有待進一步人體實驗。

綜上所述，盡管可吸收室間隔缺損封堵器仍需要進一步的臨床研究，但是本研究證明該封堵器設計科學合理、操作簡便，具有很好的生物相容性，其內皮化完全且迅速，并發(fā)癥少，可有效地封堵VSD，具有良好的臨床安全性應用前景。

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（張蕾 編輯）

Animal study on safety and effectiveness of absorbable ventricular septal occluder

Yi-dan Chen1,Yi-feng Pan2,Tian-li Zhao3
(1.Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,China;
2.Hepatobiliary Research Center,Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,China;3.Department of Cardiovascular Surgery,the Second Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410011,China)

ObjectiveTo evaluate the safety,biocompatibility and effectiveness of the new absorbable occluder.MethodsA total of 27 adult Beagle dogs were enrolled and divided into 2 groups.Ventricular septal defect(VSD)animal models were prepared in experimental group(17 dogs)by open chest.VSD was punctured and the new absorbable occluder was implanted by guiding of transthoracic echocardiography.Laboratory examinations were done after surgery and pathological samples were obtained after euthanasia in the 3rd,6th,9th and 12th month.Then the safety and effectiveness were evaluated by comparing laboratory results,clinical and histopathological manifestations of the 2 groups.ResultsAll dogs survived.No complications occurred.Histopathological examination showed the occluders were biocompatible and immunohistochemical examination showed epithelial cells and new vessels were growing on the occluder surface.ConclusionsThe new absorbable occluder has been proven to be safe,effective and biocompatible in this study.

VSD;Beagle dog;absorbable occluder;transthoracic intervention;TEE

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.13.009

1005-8982（2017）13-0044-06

2016-12-14

趙天力，E-mail：dr.zhaotl@gmail.com；Tel：15574389964