郭宇飛，呂娟，王書勤

（1.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046）

巖鹿乳康膠囊對乳腺增生大鼠乳腺組織及雌孕激素受體表達(dá)的影響*

郭宇飛1，呂娟2，王書勤2

（1.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046）

目的觀察巖鹿乳康膠囊對乳腺增生大鼠乳腺組織及雌孕激素受體表達(dá)的影響，探討其治療乳腺增生的作用機(jī)制。方法用肌內(nèi)注射外源性苯甲酸雌二醇及黃體酮的方法復(fù)制大鼠乳腺增生模型，觀察各組大鼠乳腺組織變化，用免疫組織化學(xué)法檢測雌激素受體亞型（ERα、ERβ）和孕激素受體（PR）的表達(dá)水平。結(jié)果巖鹿乳康膠囊能減少實(shí)驗(yàn)大鼠乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞層數(shù)和腺泡數(shù)，同時降低乳腺組織ERα、PR的表達(dá)，提高ERβ的表達(dá)，抑制乳腺組織增生。結(jié)論巖鹿乳康膠囊對大鼠乳腺增生具有抑制作用，其治療機(jī)制可能與上調(diào)ERβ，下調(diào)ERα、PR的表達(dá)有關(guān)。

巖鹿乳康膠囊；乳腺增生；雌激素受體亞型；孕激素受體

乳腺增生是婦女的一種常見病和多發(fā)病，以周期性乳房疼痛為主要特征的一種既非炎癥又非腫瘤的乳腺疾病，是乳腺實(shí)質(zhì)的良性增生，屬中醫(yī)學(xué)“乳癖”范疇。巖鹿乳康膠囊是彝醫(yī)藥，由巖陀、鹿銜草、鹿角霜三味藥組成，具有益腎、活血，軟堅(jiān)散結(jié)之功效，在治療乳腺增生上具有良好臨床療效。本研究通過復(fù)制乳腺增生大鼠模型，觀察各組大鼠乳腺組織病理變化，測定乳腺組織中雌激素受體（estrogen receptor，ER） 亞型 （ERα、ERβ） 和孕激素受體（prosgestogen receptor，PR）水平，探索巖鹿乳康膠囊抑制乳腺增生的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

成年未孕Wistar雌性大鼠60只（北京維通利華有限公司提供），鼠齡7～8周，體重180～200 g，合格證號：11400700094092。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥及試劑

巖鹿乳康膠囊（云南龍海天然植物藥業(yè)有限公司，批號：z20025379），枸櫞酸他莫西芬片（三苯氧胺，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號：08062501），乳癖消顆粒（哈爾濱太華藥業(yè)有限公司，批號：z19990028），苯甲酸雌二醇注射液（蘇州蘇牧動物藥業(yè)有限公司，批號：100862511），黃體酮注射液（天津金耀藥業(yè)有限公司，批號：h12020533）。SA1022兔IgG-免疫組織化學(xué)試劑盒SABC即用型，DAB顯色試劑盒（批號：AR1022）均購自武漢博士德生物工程有限公司。ERα 抗體（批號：21244-1-AP），ERβ 抗體（批號：14007-1-AP）均購自美國Proteintech公司，PR抗體（批號：bs-0183R）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分組、復(fù)制模型及給藥 將Wistar雌性大鼠60只隨機(jī)分為空白組、疾病模型組、去卵巢組、三苯氧胺組、乳癖消顆粒組和巖鹿乳康膠囊組，每組10只。除空白組外，其余各組大鼠大腿內(nèi)側(cè)肌內(nèi)注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/（kg·d），使用25 d后改為肌內(nèi)注射黃體酮4 mg/（kg·d），連續(xù)5 d，復(fù)制乳腺增生模型[1]?？瞻捉M、疾病模型組及去卵巢組蒸餾水灌胃0.2 ml/d，三苯氧胺組2.07 mg/（kg·d），乳癖消顆粒組2.52 g/（kg·d），巖鹿乳康膠囊組630 mg/（kg·d），各組分別灌胃給藥4周，末次給藥后24 h處死動物取材。

1.3.2 組織形態(tài)學(xué)觀察 取大鼠第3對乳腺，用10%甲醛溶液固定、石蠟包理、連續(xù)切片、染色，光鏡下計(jì)數(shù)導(dǎo)管上皮層數(shù)和腺泡數(shù)。

1.3.3 ERα、ERβ、PR免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組織化學(xué)SABC法，按試劑盒說明書步驟進(jìn)行，高倍鏡下觀察，拍片。用Image-Pro Plus 6分析軟件對各組照片進(jìn)行平均光密度測算，定量分析。細(xì)胞胞漿或細(xì)胞核呈黃色或棕黃色著色為陽性表達(dá)，平均光密度值[mean density=（IOD SUM）/area]反映了這張照片上免疫反應(yīng)物的表達(dá)強(qiáng)度。ERα、ERβ、PR陽性表達(dá)的水平與平均光密度值呈正相關(guān)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方法（one-way ANOVA），實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠乳腺形態(tài)

空白組大鼠乳腺組織可見乳腺小葉體積小、形態(tài)規(guī)則，乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞排列整齊，腺泡數(shù)量少，未發(fā)現(xiàn)有乳腺增生的癥狀（見圖1～3）。與空白組比較，疾病模型組大鼠乳腺組織導(dǎo)管上皮細(xì)胞層數(shù)及腺泡數(shù)目增多（P＜0.05），腺泡和導(dǎo)管增生、擴(kuò)張，細(xì)胞排列紊亂，有典型的乳腺增生癥狀。與疾病模型組比較，各治療組（三苯氧胺組、乳癖消顆粒組及巖鹿乳康膠囊組）導(dǎo)管上皮細(xì)胞層數(shù)、腺泡數(shù)減少（P＜0.05），導(dǎo)管擴(kuò)張減輕，乳腺增生程度均有不同程度的改善。去卵巢組導(dǎo)管上皮層數(shù)與腺泡數(shù)低于空白組，病理表現(xiàn)相近。見表1。

2.2 巖鹿乳康膠囊對乳腺增生大鼠乳腺組織ER α、ER β、PR 表達(dá)的影響

2.2.1 各組大鼠乳腺組織ERα的表達(dá) 與空白組比較，疾病模型組平均光密度值升高，陽性細(xì)胞表達(dá)增多（P＜0.05）。與疾病模型組比較，各治療組平均光密度值降低（P＜0.05），陽性細(xì)胞表達(dá)減少。表明當(dāng)大鼠乳腺組織形態(tài)表現(xiàn)為明顯增生時，乳腺組織內(nèi)的ERα表達(dá)水平隨之升高，而各治療組均可下調(diào)ERα表達(dá)，有益于抑制增生。巖鹿乳康膠囊組與三苯氧胺組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在數(shù)值上接近三苯氧胺組。見圖1、表2。

2.2.2 各組大鼠乳腺組織ERβ的表達(dá) 與空白組比較，疾病模型組、去卵巢組的平均光密度值下降，陽性細(xì)胞表達(dá)減少。與疾病模型組比較，三苯氧胺組、巖鹿乳康膠囊組及乳癖消顆粒組的平均光密度值均升高，陽性細(xì)胞表達(dá)增多，且?guī)r鹿乳康膠囊組及乳癖消顆粒組與疾病模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明巖鹿乳康膠囊組及乳癖消顆粒組可上調(diào)ERβ表達(dá)，以巖鹿乳康膠囊組最為明顯。見圖2、表2。

2.2.3 各組大鼠乳腺組織PR的表達(dá) 與空白組比較，疾病模型組平均光密度值升高，陽性細(xì)胞表達(dá)增多（P＜0.05）。與疾病模型組比較，去卵巢組、三苯氧胺組、巖鹿乳康膠囊組及乳癖消顆粒組平均光密度降低（P＜0.05），陽性細(xì)胞表達(dá)減少，表明乳腺增生模型大鼠的PR表達(dá)水平升高，三苯氧胺組、巖鹿乳康膠囊組及乳癖消顆粒組藥物的應(yīng)用能降低大鼠乳腺組織PR含量。見圖3、表2。

圖1 ER α免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 （10×40）

圖2 ER β免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 （10×40）

圖3 PR免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 （10×40）

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，疾病模型組大鼠乳腺組織明顯增生時，乳腺內(nèi)ERα和PR表達(dá)水平隨之升高，ERβ表達(dá)下降?？瞻捉M的正常乳腺組織中ERα的表達(dá)率低于ERβ的表達(dá)。推測ERβ對正常乳腺有保護(hù)作用。去卵巢組的ERα、ERβ、PR的表達(dá)均低于空白組，這可能與大鼠去卵巢后內(nèi)源性雌孕激素的缺乏導(dǎo)致雌孕激素受體的表達(dá)減弱有關(guān)。三苯氧胺組在ERα，PR表達(dá)上與疾病模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但在ERβ表達(dá)上與疾病模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示ERα和ERβ對抗雌激素物質(zhì)三苯氧胺來說，有不同的親和力。ERα在多種細(xì)胞中可介導(dǎo)三苯氧胺的激動作用而ERβ則不能[2]。巖鹿乳康膠囊組在調(diào)節(jié)ERα，PR表達(dá)方面趨向三苯氧胺組，優(yōu)于乳癖消顆粒組，在上調(diào)ERβ表達(dá)上優(yōu)于這兩組。

表1 各組大鼠乳腺導(dǎo)管上皮層數(shù)、腺泡數(shù)比較（n=6，±s）

表1 各組大鼠乳腺導(dǎo)管上皮層數(shù)、腺泡數(shù)比較（n=6，±s）

注：1）與疾病模型組比較，P ＜0.05；2）與空白組比較，P ＜0.05；3）與三苯氧胺組比較，P＜0.05

組別腺泡數(shù)空白組 2.167±0.7531） 3.667±1.0331）疾病模型組 4.667±1.2112）3） 13.333±2.1602）3）去卵巢組 1.833±0.7531） 2.833±0.7531）3）三苯氧胺組 2.667±0.8161） 4.667±1.0331）乳癖消顆粒組 3.333±1.0331）2） 7.667±1.6331）2）3）巖鹿乳康膠囊組 3.167±0.7531） 5.500±1.0491）2）導(dǎo)管上皮細(xì)胞層數(shù)

表2 各組大鼠乳腺組織ER α、ER β、PR平均光密度值比較 （n=10，±s）

表2 各組大鼠乳腺組織ER α、ER β、PR平均光密度值比較 （n=10，±s）

注：1）與疾病模型組比較，P＜0.05；2）與三苯氧胺組比較，P＜0.05；3）與空白組比較，P ＜0.05

組別PR空白組 0.309±0.0371）2）ERβ 0.382±0.0861）2） 0.475±0.084疾病模型組 0.704±0.0852）3）ERα 1.403±0.1433） 0.419±0.098去卵巢組 0.280±0.0691）2）3）0.366±0.0622）3） 0.256±0.0451）2）三苯氧胺組 0.406±0.0621） 0.443±0.054 0.379±0.0571）3）乳癖消顆粒組 0.486±0.1191）2） 0.491±0.0441） 0.501±0.0421）2）3）巖鹿乳康膠囊組 0.438±0.0751） 0.524±0.0671）2） 0.408±0.0541）3）

3 討論

乳房是多種內(nèi)分泌激素的靶器官，乳腺增生的病因除了過高的E2直接刺激或P值降低不能保護(hù)乳腺組織，使乳腺實(shí)質(zhì)增生過度和復(fù)舊不全外[3]，還與局部乳腺組織ER、PR含量相關(guān)，ER、PR的表達(dá)量可提示乳房組織對性激素的敏感性。目前國內(nèi)外的研究認(rèn)為ER的功能主要是在ER信號通路中起重要作用，具體表現(xiàn)在激素相關(guān)的靶器官如乳腺組織、骨骼組織和脂肪組織[4]。ER是一類由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，是核受體超家族的成員，2種亞型ERα、ERβ介導(dǎo)雌激素而使其產(chǎn)生作用。ERα和ERβ在雌激素的靶組織分布不同調(diào)節(jié)機(jī)制也不同，兩者有不同的生物學(xué)作用[5]，且在人類的乳腺中ERβ比ERα的分布更為廣泛[6]。研究者[7]證實(shí)幾乎100%的導(dǎo)管上皮不典型增生都高表達(dá)ERα，約75%的導(dǎo)管原位癌、大于90%的小葉原位癌，約70%的浸潤性乳腺癌病灶中可檢測到增高的ERα。約85%的正常乳腺導(dǎo)管上皮中有表達(dá)ERβ，其表達(dá)強(qiáng)度在正常導(dǎo)管上皮、導(dǎo)管位癌、浸潤性導(dǎo)管癌依次減少。有研究[8]顯示ERα與ERβ在45例正常乳腺組織中均有表達(dá)，且在表達(dá)量上，ERβ高于ERα，提示ERβ可能是正常乳腺的優(yōu)勢雌激素受體，ERβ的表達(dá)可能在正常乳腺細(xì)胞中發(fā)揮更重要的作用。KOEHLER等[9]在動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ERβ對正常乳腺具保護(hù)作用。在正常乳腺中ERβ表達(dá)比ERα更為豐富，活化的ERα促進(jìn)乳腺及其他組織細(xì)胞的增殖，己被推薦作為區(qū)分激素依賴和非激素依賴的乳腺癌的標(biāo)志物；近期研究也表明活化的ERβ可拮抗乳腺及其他組織的增殖，高濃度的ERβ可以下調(diào)ERα的表達(dá)[10]。雌激素也能調(diào)節(jié)和控制PR的表達(dá)，PR依賴于ER存在并受雌激素的調(diào)節(jié)和控制，因而PR表達(dá)狀態(tài)能夠顯示雌激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)的功能狀況。當(dāng)孕酮含量升高時經(jīng)PR的介導(dǎo)，通過完整的PR系統(tǒng)，使PR合成進(jìn)一步增加，對PR的依賴敏感性同步增加，引起乳腺上皮細(xì)胞的增生和細(xì)胞功能活躍[11]。ER和PR過度表達(dá)與乳腺增生病的發(fā)生有較大相關(guān)性。

祖國醫(yī)學(xué)稱乳腺增生為“乳癖”，多因情志內(nèi)傷，肝氣郁結(jié)，乳絡(luò)阻滯或腎陽不足以致沖任不調(diào)，氣滯痰凝所致。治法則以疏肝理氣，溫補(bǔ)腎陽，活血化瘀，軟堅(jiān)散結(jié)，消腫止痛等為主。巖鹿乳康膠囊是彝醫(yī)藥，由巖陀、鹿銜草和鹿角霜三味藥組成，巖陀，苦、澀，涼，有活血化瘀、理氣祛痰、消腫止痛之功；鹿銜草味甘苦，性溫，能補(bǔ)虛，益腎，活血調(diào)經(jīng)，調(diào)理沖任；鹿角霜味咸，歸肝腎經(jīng)，能溫陽寒，軟堅(jiān)散結(jié)?，F(xiàn)代藥理證明，巖陀主要化學(xué)成分為巖白菜素，具有抗炎、抗HIV、抑制微生物、鎮(zhèn)咳、抗氧化、鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)免疫等作用[12]。鹿角霜能對抗戊酸雌二醇性小鼠乳腺增生，大劑量能抑制MA-737小鼠乳腺癌的生長[13]，且有類似內(nèi)分泌激素的作用[14]。已經(jīng)有相關(guān)研究證明鹿銜草通過植物雌激素樣作用，提升血清雌激素水平[15]。因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)上的相似性，植物性雌激素可通過ER的結(jié)合，從而表現(xiàn)出雌激素活性和抗雌激素活性2種重要的生物學(xué)活性[16]，由此可見，巖鹿乳康膠囊治療乳腺增生與其改善機(jī)體內(nèi)分泌功能有關(guān)，可能是通過調(diào)節(jié)激素分泌水平，減弱異常的雌、孕激素對乳腺的生物學(xué)效應(yīng)。

綜上所述，①巖鹿乳康膠囊組治療大鼠乳腺增生，在對乳腺導(dǎo)管上皮層數(shù)和腺泡數(shù)等抑制作用方面優(yōu)于乳癖消顆粒組，接近三苯氧胺組的抑制效果。②疾病模型組ERα和PR表達(dá)水平升高，ERβ表達(dá)下降。巖鹿乳康膠囊組可上調(diào)ERβ，下調(diào)ERα和PR的表達(dá)，提示巖鹿乳康膠囊治療乳腺增生的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)了ERα、ERβ、PR的表達(dá)相關(guān)，且ERβ的表達(dá)與乳腺保護(hù)作用密切相關(guān)。③三苯氧胺可下調(diào)ERα和PR的表達(dá)，對ERβ上調(diào)不明顯，提示巖鹿乳康膠囊治療乳腺增生的機(jī)制與雌激素受體拮抗劑三苯氧胺存在差異。巖鹿乳康膠囊組在抑制大鼠乳腺組織增生的同時，乳腺ERα，PR表達(dá)水平隨之降低，同時ERβ表達(dá)上調(diào)。因而推測巖鹿乳康膠囊一方面下調(diào)大鼠乳腺組織ERα和PR的表達(dá)，使乳腺組織對雌激素的敏感性下降，從而減少受體與激素結(jié)合形成的復(fù)合物對基因的活化和對靶細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，起到抑制乳腺增生的作用，另一方面上調(diào)ERβ表達(dá)，對乳腺組織起到保護(hù)作用。巖鹿乳康膠囊抑制與保護(hù)兼具，且能調(diào)理體質(zhì)，體現(xiàn)了中醫(yī)藥在治療乳腺增生的優(yōu)越性。但其具體作用機(jī)制及是否有預(yù)防乳腺癌的作用，有待于今后進(jìn)一步研究闡明。

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（張蕾 編輯）

Effect of Yanlurukang Capsules on breast tissue and expressions of ER and PR in rats with hyperplasia of mammary glands*

Yu-fei Guo1,Juan Lyu2,Shu-qin Wang2
(1.Henan Province Hospital of TCM,Zhengzhou,Henan 450002;2.Henan University of Chinese Medicine,Zhengzhou Henan 450046)

ObjectiveTo observe the effect of Yanlurukang Capsules on the breast tissue and expressions of estrogen receptor(ER)and progesterone receptor(PR)in rats with hyperplasia of mammary glands(HMG),and to discuss the mechanism.MethodsBreast hyperplasia rat model was established by intramuscular injection of estradiol benzoate and progesterone.The changes of breast tissue were observed in rats of each group.The expressions of ERα,ERβand PR in breast tissues were detected using immunohistochemical staining.ResultsYanlurukang Capsules significantly reduced the layers of mammary ductal epithelial cells and the number of acini in the experimental rats,down-regulated the expressions of ERα and PR,and enhanced the expression of ERβ.ConclusionsYanlurukang Capsules can inhibit HMG in rats,the mechanism may be related to up-regulation of ERβ expression and down-regulation of ERα and PR expressions.

Yanlurukang Capsules;hyperplasia of mammary glands;ER;PR

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.13.003

1005-8982（2017）13-0014-05

2016-12-21

河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項(xiàng)課題普通項(xiàng)目（No：2013ZY02036）；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（No：13A360610）