鐘軍華，袁勇，宋飛飛，楊世忠，林丹

（海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，海南 ?？?570102）

肝纖溶顆粒與復(fù)方鱉甲軟肝片對大鼠肝纖維化模型細(xì)胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)影響研究*

鐘軍華，袁勇，宋飛飛，楊世忠，林丹

（海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，海南 ?？?570102）

目的探究肝纖溶顆粒與復(fù)方鱉甲軟肝片對大鼠肝纖維化模型細(xì)胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)影響。方法48只雄性清潔級SD大鼠隨機(jī)分為：正常對照組、模型對照組、復(fù)方鱉甲軟肝片組及肝纖溶顆粒組，每組各12只。除正常對照組外各組復(fù)制肝纖維化模型。于復(fù)制模型后的3周各組大鼠同時(shí)給藥，正常對照組與模型對照組大鼠給予生理鹽水1.5 ml/kg灌胃，1次/d；復(fù)方鱉甲軟肝片組給予33.3%復(fù)方鱉甲軟肝片溶液1.5 ml/kg重灌胃，1次/d；肝纖溶顆粒組給予33.3%肝纖溶顆粒溶液1.5 ml/kg灌胃，1次/d。各組連續(xù)用藥6周。實(shí)驗(yàn)開始后第3、6和9周對各組大鼠肝臟病理學(xué)、細(xì)胞凋亡數(shù)量、肝纖維化指標(biāo)水平以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測。結(jié)果與其他各組相比，肝纖溶顆粒組纖維增生程度評分下降（P＜0.05），肝凋亡數(shù)下降（P＜0.05）；透明質(zhì)酸、層黏連蛋白、血清Ⅲ型前膠原、血清Ⅳ型膠原水平下降（P＜0.05）；CHOP、ATF6蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.05）。結(jié)論肝纖溶顆粒組肝纖維化大鼠細(xì)胞凋亡數(shù)量和肝纖維化水平較復(fù)方鱉甲軟肝片組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），肝纖溶顆粒能夠改善肝臟病理變化，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，對臨床有指導(dǎo)意義。

肝纖溶顆粒；復(fù)方鱉甲軟肝片；大鼠肝纖維化模型；細(xì)胞凋亡；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子

各種慢性肝病，包括病毒性肝炎、酒精性肝病以及非酒精性脂肪肝等肝臟疾病有相當(dāng)一部分會轉(zhuǎn)化為肝硬化，從而引起肝癌，甚至死亡，其中肝纖維化是關(guān)鍵的一個(gè)步驟，而早期肝纖維化是一種可逆性病變[1]，因此臨床研究以如何阻斷纖維化的進(jìn)展為預(yù)防肝硬化及肝癌的重要課題之一。肝纖維化是由于肝內(nèi)膠原沉積增多，肝臟結(jié)構(gòu)受損導(dǎo)致患者出現(xiàn)消化功能障礙、糖代謝異常、凝血功能紊亂與肝缺血再灌注損傷[2]。西藥治療肝纖維化的研發(fā)仍處于臨床研究階段，并無高效、無明顯毒副作用的藥物。祖國醫(yī)學(xué)大量的臨床研究資料為肝纖維化提供了基礎(chǔ)治療契機(jī)，在改善臨床癥狀等諸多方面存在較大潛力。肝纖溶顆粒是一種由鱉甲、黃芪、三七、紫河車、丹參制成的中藥復(fù)方[3]，臨床應(yīng)用具有活血化瘀、益氣軟堅(jiān)的療效。曾有研究顯示，肝纖溶顆粒能夠減輕炎癥反應(yīng)[4]，緩解肝細(xì)胞變性壞死，對急慢性肝炎及肝纖維化有良好的預(yù)防和治療作用。但現(xiàn)今對本品靶點(diǎn)及其分子機(jī)制尚未進(jìn)行深入研究。本研究采用復(fù)制動(dòng)物模型及中藥干預(yù)的方法，深入探討肝纖溶顆粒對肝纖維化的藥效機(jī)制和復(fù)方有效成分的作用機(jī)制是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑相關(guān)，為臨床防治肝纖維化提供新的防治策略和有效方法提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和方法論的指導(dǎo)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

復(fù)方鱉甲軟肝片，0.5 g/片（批號：20130511，內(nèi)蒙古福瑞醫(yī)療科技股份有限公司），肝纖溶顆粒（鱉甲、黃芪、三七、紫河車、丹參組成，長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供），四氯化碳（上海子起生物科技有限公司），甲醛（上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司）。

恒溫液壓動(dòng)物手術(shù)臺（上海玉研科學(xué)儀器有限公司），石蠟包埋機(jī)（湖北泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司），LVEM5臺式透射電子顯微鏡（Quantum量子科學(xué)儀器貿(mào)易北京有限公司），Stratos臺式離心機(jī)（賽默飛世爾科技），全自動(dòng)生化分析儀（江蘇省醫(yī)藥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地），放射性檢測儀（北京東方德教育科技有限公司北科研發(fā)中心），WD-9413B型凝膠成像分析系統(tǒng)（上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司）。

大鼠透明質(zhì)酸（HA）ELISA kit（上海古朵生物科技有限公司），層黏連蛋白（LN）Elisa kit（南京賽泓瑞生物科技有限公司），大鼠Ⅲ型前膠原（PCⅢ）ELISA試劑盒（上海江萊生物科技有限公司），大鼠Ⅳ型膠原（ColⅣ）ELISA試劑盒（上海金穗生物科技有限公司），細(xì)胞凋亡-原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）（北京永欣康泰科技發(fā)展有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 采用健康清潔級雄性SD大鼠 48只，鼠齡為 7周齡，體重為（200±20）g，購買于南京君科生物工程有限公司，許可證號：RAWMX-90011。隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、復(fù)方鱉甲軟肝片組及肝纖溶顆粒組，每組各12只。分籠飼養(yǎng)，確保正常飲食和飲水。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境，動(dòng)物自由進(jìn)食、水，實(shí)驗(yàn)室溫度維持在25℃。

1.2.2 肝纖維化模型復(fù)制[5]除正常對照組外，其余3組健康清潔級雄性SD大鼠進(jìn)行模型復(fù)制。給予40%CCL4色拉油溶液皮下注射給藥，首次劑量為0.5 ml/kg，以后劑量按照0.3 ml/kg注射，3次/周，連續(xù)用藥6周。

1.2.3 藥品制備及應(yīng)用 用研缽將復(fù)方鱉甲軟肝片研磨成粉末狀，將其與無菌蒸餾水混合調(diào)制為濃度為33.3%的復(fù)方鰲甲軟肝片溶液；將肝纖溶顆粒與無菌蒸餾水混合調(diào)制為濃度為33.3%的肝纖溶顆粒溶液。于復(fù)制模型后的3周各組大鼠同時(shí)給藥，正常對照組與模型對照組大鼠給予生理鹽水1.5 ml/kg灌胃，1次/d；復(fù)方鱉甲軟肝片組給予33.3%復(fù)方鱉甲軟肝片溶液1.5 ml/kg重灌胃，1次/d；肝纖溶顆粒組給予33.3%肝纖溶顆粒溶液1.5 ml/kg灌胃，1次/d。各組連續(xù)用藥6周。

1.3 觀察指標(biāo)

于實(shí)驗(yàn)開始后第3、6、9周最后一次給藥2 h后，每組隨機(jī)選取4只進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)觀察。

1.3.1 肝臟病理學(xué)檢測 大鼠股動(dòng)脈放血處死，取肝左葉，切分為3 mm×1 mm×1 mm大小，用10%甲醛溶液固定，石臘包埋切片，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察炎癥反應(yīng)及纖維組織增生等病理變化情況。將纖維增生程度分為0～4級，0級無纖維化；1級為纖維結(jié)締組織僅局限于匯管區(qū)或存在匯管區(qū)擴(kuò)大的區(qū)域，出現(xiàn)向小葉發(fā)展的傾向；2級為纖維結(jié)締組織增生侵入肝小葉2/3和1級有相同的變化；3級為纖維結(jié)締組織增生侵入小葉甚至到達(dá)中央靜脈周圍；4級為纖維結(jié)締組織蔓延整個(gè)小葉，并存在多處彌漫性增生，形成假小葉，與3級有相同的變化。分別為0、1、2、3、4 分。

1.3.2 細(xì)胞凋亡的檢測 采用TdT介導(dǎo)的脫氧尿嘧啶缺口末端標(biāo)（TUNEL）法檢測各組大鼠肝細(xì)胞凋亡情況，分別記錄每個(gè)高倍視野內(nèi)的肝凋亡細(xì)胞數(shù)量，取平均值。

1.3.3 肝纖維化指標(biāo) 取大鼠腹主動(dòng)脈血，分離血清，采用放射性免疫分析法檢測血清透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、層黏連蛋白（laminin，LN）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）以及Ⅳ型膠原（CⅣ）水平。

1.3.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測 鼠肝中葉取材，行ATF6和CHOP免疫組織化學(xué)顯色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，同一時(shí)間點(diǎn)不同組間首先進(jìn)行方差分析，利用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較；使用配對t檢驗(yàn)對不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)同一組之間差異進(jìn)行分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 纖維增生程度評分比較

在相同用藥時(shí)間內(nèi)4組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），復(fù)方鱉甲軟片組（t=-3.629，P=0.011）、肝纖溶顆粒對照組（t=-6.382，P=0.001）的纖維增生程度評分低于模型組，并且肝纖溶顆粒組低于復(fù)方鱉甲軟片組（t=-3.416，P=0.014），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。復(fù)方鱉甲軟片組（F=8.134，P=0.020）、肝纖溶顆粒組（F=26.148，P=0.001）的纖維增生程度評分用藥后3～9周呈下降趨勢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與復(fù)方鱉甲軟片組比較，肝纖溶顆粒組的纖維增生程度評分下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 肝凋亡數(shù)的表達(dá)值比較

肝纖溶顆粒組在肝凋亡數(shù)上低于復(fù)方鱉甲軟片組，在相同用藥時(shí)間內(nèi)，復(fù)方鱉甲軟片組和肝纖溶顆粒組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.189），但它們與模型對照組（P=0.000）和正常對照組（P=0.000）之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。復(fù)方鱉甲軟片組（F=1.282，P=0.344）、肝纖溶顆粒組（F=4.021，P=0.078）的肝凋亡數(shù)用藥后3～9周呈下降趨勢，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與復(fù)方鱉甲軟片組比較，肝纖溶顆粒組的肝凋亡數(shù)除在第3周無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（t=1.703，P=0.078），在6和9周均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.496和3.992，P=0.047 和 0.007），見表 2 和圖 1。

2.3 肝纖維化指標(biāo)含量比較

復(fù)方鱉甲軟片組和肝纖溶顆粒組在大鼠血清HA含量上低于模型對照組，方差分析顯示這兩組與模型對照組在不同給藥時(shí)間內(nèi)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。配對t檢驗(yàn)結(jié)果顯示它們與正常對照組以及彼此之間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（復(fù)方鱉甲軟片組vs正常對照組，P=0.054；肝纖溶顆粒組vs正常對照組，P=0.727；復(fù)方鱉甲軟片組vs肝纖溶顆粒組，P=0.263）。方差分析顯示復(fù)方鱉甲軟片組（F=8.268，P=0.019）和肝纖溶顆粒組（F=6.572，P=0.031）的大鼠HA含量在用藥后3～9周呈下降趨勢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表1 各組大鼠纖維增生程度評分比較 （n=4，分，±s）

表1 各組大鼠纖維增生程度評分比較 （n=4，分，±s）

注：1）與模型對照組比較，P ＜0.05；2）與復(fù)方鱉甲軟片組比較，P ＜0.05

9周正常對照組 1.20±0.13 1.34±0.14 1.19±0.18 - -模型對照組 28.02±3.19 28.02±3.19 28.02±3.19 - -復(fù)方鱉甲軟片組 21.05±2.141） 16.93±2.001） 14.28±1.541） 8.134 0.020肝纖溶顆粒組 16.14±1.921）2） 10.08±1.021）2） 8.38±1.001）2） 26.148 0.001 F值 97.736 99.961 114.301 P值 0.000 0.000 0.000組別3周6周F值P值

表2 各組大鼠肝凋亡數(shù)的表達(dá)值比較 （n=4，±s）

表2 各組大鼠肝凋亡數(shù)的表達(dá)值比較 （n=4，±s）

注：1）與模型對照組比較，P ＜0.05；2）與復(fù)方鱉甲軟片組比較，P ＜0.05

9周正常對照組 1.37±0.16 1.33±0.16 1.35±0.15 - -模型對照組 7.08±0.70 7.14±0.76 7.11±0.74 - -復(fù)方鱉甲軟片組 4.10±0.441） 3.74±0.431） 3.56±0.391） 1.282 0.344肝纖溶顆粒組 3.52±0.521） 3.04±0.361） 2.59±0.291）2） 4.021 0.078 F值 67.956 77.747 91.248 P值 0.000 0.000 0.000組別3周6周F值P值

圖1 各組大鼠肝細(xì)胞凋亡情況 （×200）

復(fù)方鱉甲軟片組和肝纖溶顆粒組的大鼠血清LN含量隨給藥時(shí)間增加而略微增加并且它們的含量均低于模型對照組。方差分析顯示在給藥3和6周這兩組與模型對照組中大鼠血清LN含量對比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.086和0.172），而在給藥9周后大鼠血清LN含量與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。方差分析結(jié)果表明復(fù)方鱉甲軟片組中大鼠血清LN含量隨給藥時(shí)間增加但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.077，P=0.927），肝纖溶顆粒組LN含量變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.014，P=0.986）。見表4。

復(fù)方鱉甲軟片組和肝纖溶顆粒組大鼠血清PCⅢ含量在各給藥時(shí)間中均低于模型組，不同培養(yǎng)時(shí)間下，組內(nèi)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且各組隨時(shí)間增加大鼠血清PCⅢ含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.354和 0.417，P=0.716和 0.677）。詳見表 5。

表3 各組大鼠血清H A含量變化比較 （n=4，μg/L，±s）

表3 各組大鼠血清H A含量變化比較 （n=4，μg/L，±s）

注：?與模型對照組比較，P＜0.05

9周正常對照組 314.86±41.26 245.63±30.82 325.46±33.48 - -模型對照組 369.83±41.29 415.38±42.77 480.93±50.92 - -組別3周6周F值P值復(fù)方鱉甲軟片組肝纖溶顆粒組257.39±34.78?235.09±27.83?316.39±34.76?271.34±24.02?377.92±39.19?319.80±33.50?8.268 6.572 0.019 0.031 F值 8.158 14.692 10.500 P值 0.008 0.001 0.004

表4 各組大鼠血清LN含量變化比較 （n=4，μg/L，±s）

表4 各組大鼠血清LN含量變化比較 （n=4，μg/L，±s）

注：?與模型對照組比較，P＜0.05

9周正常對照組 25.29±3.49 23.29±3.09 25.28±2.97 - -模型對照組 33.29±3.45 32.87±3.52 43.28±4.87 - -復(fù)方鱉甲軟片組 28.19±2.90? 28.94±3.10 29.11±3.181） 0.077 0.927肝纖溶顆粒組 26.17±2.89? 25.83±3.10? 26.19±2.971） 0.014 0.986 F值 3.770 4.977 16.337 P值 0.059 0.031 0.001組別3周6周F值P值

表5 各組大鼠血清PC I I I含量變化比較 （n=4，μg/L，±s）

表5 各組大鼠血清PC I I I含量變化比較 （n=4，μg/L，±s）

9周正常對照組 37.29±4.02 37.29±4.15 39.29±4.07 - -模型對照組 43.29±4.63 43.29±4.59 43.29±5.19 - -復(fù)方鱉甲軟片組 41.20±4.59 38.29±4.01 40.38±4.49 0.354 0.716肝纖溶顆粒組 38.19±4.18 39.01±4.11 41.19±4.19 0.417 0.677 F值 1.202 1.176 0.423 P值 0.369 0.378 0.742組別3周6周F值P值

復(fù)方鱉甲軟片組和肝纖溶顆粒組大鼠血清CⅣ在不同給藥時(shí)間下均低于模型對照組，方差分析顯示培養(yǎng)第3周復(fù)方鱉甲軟片組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.100），但肝纖溶顆粒組與模型對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0018）。培養(yǎng)6～9周后這兩組與模型組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（6周：復(fù)方鱉甲軟片組vs模型對照組，P=0.019；肝纖溶顆粒組vs模型對照組，P=0.0019；9周：復(fù)方鱉甲軟片組vs模型對照組，P=0.0055；肝纖溶顆粒組vs模型對照組，P=0.0006）。復(fù)方鱉甲軟片組和肝纖溶顆粒組比較在各時(shí)間段內(nèi)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（復(fù)方鱉甲軟片組vs肝纖溶顆粒組：P3周=0.0066；P6周=0.027；P9周=0.034）。復(fù)方鱉甲軟片組和肝纖溶顆粒組大鼠血清CⅣ含量隨著給藥時(shí)間增加而呈現(xiàn)下降趨勢（復(fù)方鱉甲軟片組F=2.189，P=0.193；肝纖溶顆粒組F=0.813，P=0.487），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表6。

2.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較

復(fù)方鱉甲軟片組、肝纖溶顆粒組的CHOP、ATF6蛋白表達(dá)水平在各給藥時(shí)間內(nèi)均低于模型對照組，各培養(yǎng)時(shí)間下組內(nèi)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=126.545、124.792 和 142.968，均 P=0.000）。用藥后3～9周這2種蛋白呈下降趨勢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（CHOP：復(fù)方鱉甲軟片組P=0.046；肝纖溶顆粒組P=0.036；ATF6：復(fù)方鱉甲軟片組P=0.000；肝纖溶顆粒組P=0.001）；與復(fù)方鱉甲軟片組比較，肝纖溶顆粒組的CHOP、ATF6蛋白表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（CHOP：復(fù)方鱉甲軟片組P=0.000，肝纖溶顆粒組P=0.000；ATF6：復(fù)方鱉甲軟片組P=0.000；肝纖溶顆粒組P=0.000），見表7和圖2、3。

表6 各組大鼠血清C I V含量變化比較 （n=4，u/L，±s）

表6 各組大鼠血清C I V含量變化比較 （n=4，u/L，±s）

注：1）與模型對照組比較，P ＜0.05；2）與復(fù)方鱉甲軟片組比較，P ＜0.05

9周正常對照組 5.02±3.49 5.12±3.09 5.06±0.57 - -模型對照組 11.43±1.37 12.09±1.72 12.08±1.57 - -復(fù)方鱉甲軟片組 9.79±0.99 8.94±1.001） 8.11±0.961） 2.189 0.193肝纖溶顆粒組 7.23±0.781）2） 7.10±0.781）2） 6.50±0.681） 0.813 0.487 F值 6.111 7.46 26.390 P值 0.018 0.11 0.000組別3周6周F值P值

表7 各組大鼠肝臟C H O P和ATF6蛋白表達(dá)比較 （n=4，±s）

表7 各組大鼠肝臟C H O P和ATF6蛋白表達(dá)比較 （n=4，±s）

注：1）與模型對照組比較，P ＜0.05；2）與復(fù)方鱉甲軟片組比較，P ＜0.05

組別CHOP 6周2.54±0.27 2.57±0.28模型對照組 56.39±6.02 59.02±6.76復(fù)方鱉甲軟片組 28.11±3.791） 23.74±3.431）肝纖溶顆粒組 12.17±1.361）2） 11.07±1.361）2）F值 126.545 124.792 P值 0.000 0.000 3周正常對照組ATF6 9周2.69±0.28 3.10±0.37 3.19±0.37 3.35±0.39 58.14±6.73 77.29±12.39 78.29±11.58 75.39±7.64 19.39±2.391） 36.02±3.931） 31.29±3.611） 25.38±2.671）8.68±1.021）2） 23.49±2.591）2） 15.49±1.631）2） 13.29±2.441）2)142.968 66.884 86.601 171.463 0.000 0.000 0.000 0.000 9周3周6周

圖2 各組大鼠肝臟C H O P蛋白表達(dá) （免疫組織化學(xué)×200）

圖3 各組大鼠肝臟ATF6蛋白表達(dá) （免疫組織化學(xué)×200）

3 討論

肝纖維化是由于多種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的病理過程，患有本病的患者細(xì)胞外基質(zhì)分泌量增高，降解失衡，于肝臟內(nèi)過度堆積，血清轉(zhuǎn)氨酶升高代謝異常，白蛋白合成障礙，肝細(xì)胞受損，肝臟嚴(yán)重受累，最終導(dǎo)致肝硬化及肝癌的發(fā)生[6]。我國針對肝纖維化的非創(chuàng)傷性以及抗肝纖維化藥物的臨床治療取得了長期有效的進(jìn)展，研究證明肝纖溶顆粒對肝纖維化有良好的緩解作用，能夠改善平滑肌痙攣，促進(jìn)微循環(huán)，調(diào)整肝血液流量，抑制自由基作用效果。研究顯示，中藥抗肝纖維化的作用機(jī)制具有多方面、多層次、復(fù)合性的作用[7]。肝纖溶顆粒的藥物組成中丹參具有活血涼血、祛瘀止痛的作用，有研究顯示，丹參明顯降低血清Ⅲ膠原蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞合成以及抗氧化的作用[8]。黃芪具有補(bǔ)氣健脾、利水的功效，研究人員通過對肝纖維化大鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，黃芪能夠改善肝纖維化程度。三七能夠止血定痛、活血化瘀，研究顯示[9]，三七具有改善微循環(huán)，抗過氧化作用，抑制肝纖維化的發(fā)生。曾有研究顯示，肝纖溶顆粒治療瘀血阻絡(luò)型肝纖維化療效明確[10]。鱉甲具有滋陰潛陽，退熱除蒸，軟堅(jiān)散結(jié)之功效，研究顯示，復(fù)方鱉甲片能夠通過降低血清中透明質(zhì)酸、層黏蛋白水平，提高尿中羥脯氨酸，從而起到抗纖維化的作用[11]。本研究就肝纖溶顆粒與復(fù)方鱉甲軟肝片進(jìn)行對比，探究兩者治療肝纖維化的療效以及藥效機(jī)制。在此類研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要，SD大鼠由于生長快，繁育性能好，其抗病能力強(qiáng)，自發(fā)腫瘤率低，對性激素感受性高的特性，非常適合本實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞凋亡在人類疾病的發(fā)病、機(jī)體發(fā)育以及組織穩(wěn)定中起關(guān)鍵作用，屬于機(jī)體內(nèi)不必須或被損壞的細(xì)胞，能夠?qū)雇鈦聿≡w以及缺陷細(xì)胞，進(jìn)而防御機(jī)體受損。肝臟的生理活動(dòng)和細(xì)胞凋亡具有相關(guān)性，可能通過基因抑制、激活或突變等多途徑發(fā)揮作用。肝細(xì)胞凋亡是正常的生理過程，是細(xì)胞更新、增殖和再生的重要機(jī)制，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因素包括射線、高溫、毒素藥物以及缺血缺氧等物理因素，機(jī)體正常的細(xì)胞凋亡能夠抗感染腫瘤、預(yù)防肝細(xì)胞自身免疫反應(yīng)，從而保護(hù)正常細(xì)胞，機(jī)體正常分泌的肝細(xì)胞凋亡抑制因子能夠預(yù)防過度凋亡誘發(fā)的肝衰竭。肝細(xì)胞凋亡不僅發(fā)生于肝發(fā)育以及成人肝細(xì)胞更新，同時(shí)是誘發(fā)肝臟損傷以及肝臟疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。現(xiàn)代研究顯示，肝纖維化、病毒性肝炎以及自身免疫性肝炎等肝臟疾病均出現(xiàn)大量肝細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重影響患者肝臟功能，誘發(fā)病情的惡化[12]。本研究顯示，與鱉甲軟片組相比，肝纖溶顆粒組的纖維增生程度評分下降，證實(shí)肝纖溶顆粒降低肝纖維化大鼠細(xì)胞凋亡數(shù)量較復(fù)方鱉甲軟肝片顯著，能緩解肝臟的損傷。

診斷肝纖維化需要進(jìn)行肝纖4項(xiàng)檢查，因此肝纖4項(xiàng)是診斷肝纖維化發(fā)展的首選指標(biāo)，具有衡量炎癥活動(dòng)以及纖維化程度的作用。血清PCⅢ水平與肝纖維化病變程度緊密相關(guān)，在患病早期即升高，對慢性肝炎肝纖維化的早期診斷以及預(yù)后有臨床診斷價(jià)值[13]。CⅣ參與基底膜的構(gòu)成，當(dāng)患者出現(xiàn)肝纖維化時(shí)，肝細(xì)胞發(fā)生變性壞死，巨噬細(xì)胞活躍，基地膠原的更新率升高，促使CⅣ水平升高，反映肝纖維化過程敏感性較高[14]。LN是一種參與肝纖維活動(dòng)的基底膜特有非膠原性結(jié)構(gòu)蛋白，可有效反映纖維進(jìn)展，隨著肝纖維化轉(zhuǎn)化為肝硬化患者食管靜脈曲張加重，LN水平增高[15]。HA是一種由間質(zhì)細(xì)胞合成的反應(yīng)肝內(nèi)纖維量以及肝組織受損程度的肝纖維化以及肝硬變敏感指標(biāo)，隨著肝纖維化不斷加劇，HA水平隨之增高，肝硬化時(shí)達(dá)到高峰。本研究顯示，與鱉甲軟片組相比，肝纖溶顆粒組的透明質(zhì)酸、LN、血清PCⅢ、血清CⅣ較低，證實(shí)肝纖溶顆粒降低肝纖4項(xiàng)水平較復(fù)方鱉甲軟肝片顯著，減少肝內(nèi)膠原，抑制纖維以及成纖維細(xì)胞的增殖分裂，促進(jìn)肝臟細(xì)胞修復(fù)，從而抗肝纖維化。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）源自于真核細(xì)胞，為蛋白質(zhì)合成、折疊和運(yùn)輸以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子儲存、鈣離子信號傳導(dǎo)、類固醇、膽固醇及其他脂類合成等反應(yīng)提供主要場所，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、蛋白質(zhì)和脂類合成?，F(xiàn)代研究顯示，酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、膽汁淤積、乙型和丙型肝炎病毒等疾病的發(fā)病機(jī)制與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）誘發(fā)的損傷具有相關(guān)性[16]。ERS 的發(fā)生主要由于ER出現(xiàn)功能障礙，患者出現(xiàn)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡，阻礙蛋白質(zhì)N-相關(guān)的糖基化作用，突變蛋白表達(dá)，和其他不同類型的細(xì)胞應(yīng)激引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的積聚。曾有研究顯示[17]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)CHOP與堿基重復(fù)序列相結(jié)合，加速TRB3的表達(dá)，與相關(guān)凋亡具有相關(guān)性。TRB3對CHOP具有抑制作用，能夠起負(fù)反饋?zhàn)饔?。有研究顯示，大鼠肝纖維化過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子CHOP以及ATF6的表達(dá)水平升高，參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。本研究顯示，與鱉甲軟片組相比，肝纖溶顆粒組的CHOP、ATF6蛋白表達(dá)下降，證實(shí)肝纖溶顆粒降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)較復(fù)方鱉甲軟肝片顯著，起抗氧化作用，抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。

因此，可認(rèn)為肝纖溶顆粒降低肝纖維化大鼠細(xì)胞凋亡數(shù)量、肝纖維化水平，較復(fù)方鱉甲軟肝片顯著，能夠改善肝臟病理變化，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，對臨床有指導(dǎo)意義。在下一步研究中，將對本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論進(jìn)行更加深入的探討，為本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果做出進(jìn)一步論證。

[1]葉靜,劉清華,王璐璐.抗肝纖維化藥物治療的研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2014,54(42):101-103.

[2]王蘭,王紅梅.組織因子、凝血功能紊亂與肝缺血再灌注損傷[J].中華消化雜志,2005,25(12):760-761.

[3]段斐,陳冬志,牛建昭,等.復(fù)方鱉甲軟肝片對高脂性脂肪肝大鼠血脂的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2005,20(6):375-376.

[4]孫龍,孫琳琳,楊世忠.肝纖溶顆粒對肝纖維化大鼠血清TNF-α、IL-6水平的影響[J].中國老年學(xué)雜志,2006,26(8):1069-1070.

[5]閆冰川,丁常清,江偉熾,等.長期腹腔注射四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型的建立[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2015,32(6):1464-1465.

[6]尤紅,吳鵬.肝纖維化的治療進(jìn)展[J].中華肝臟病雜志,2010,18(8):574-575.

[7]陳曦,牟璐璐,陳丹丹,等.逍遙散對肝纖維化大鼠模型抗纖維化作用及其機(jī)制研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2014,25(3):241-244.

[8]馬文東,張麗娟,羅玲,等.抗纖維化短肽對血清誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成與Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].華北煤炭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,10(3):291-293.

[9]姜輝,高家榮,張家富,等.三七總皂苷對肝纖維化大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制[J].中藥藥理與臨床,2013,29(3):71-74.

[10]白靜麗,楊世忠,陳漉,等.肝纖溶顆?？箤?shí)驗(yàn)性肝纖維化治療中血清HA、LN、PCⅢ的動(dòng)態(tài)變化[J].中國老年學(xué)雜志,2006,26(1):96-98.

[11]張東偉,王繼峰,牛建昭,等.復(fù)方鱉甲片預(yù)防肺纖維化大鼠細(xì)胞外基質(zhì)過度形成的實(shí)驗(yàn)研究[J].中草藥,2004,35(5):545-548.

[12]袁淑芳,張躍新,單鑫,等.腫瘤壞死因子α、Caspase-3、核因子κB mRNA在病毒性肝炎中的表達(dá)與肝細(xì)胞凋亡[J].中華肝臟病雜志,2006,14(2):129-131.

[13]王傳敏,石慶鳳,湯守兵,等.乙型肝炎患者血清IL-1β、γ-IFN、HA、LN和PCⅢ在肝炎肝纖維化時(shí)水平的變化及其意義[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2015,14(9):718-721.

[14]李健,牛建昭,曾艷,等.大鼠ALD發(fā)生過程中血清HA、LN、C_(IV)水平及肝組織膠原表達(dá)變化的動(dòng)態(tài)觀察[J].中國藥物依賴性雜志,2004,13(1):18-21.

[15]張平,袁迎春,任芳.肝硬化門脈高壓與內(nèi)皮素及纖維化指標(biāo)關(guān)系的分析[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2005,27(4):274-275.

[16]李祥柱.IRE1α與乙型病毒性肝炎相關(guān)性研究進(jìn)展 [J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2015,31(23):3582-3585.

[17]杜錫潮,韓冰,謝汝佳,等.肝纖維化大鼠肝臟中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子CHOP和TRB3的表達(dá)變化[J].中國病理生理雜志,2013,29(5):906-912.

（張蕾 編輯）

Effect of Hepatic Fibrinolysis Granules combined with Fufang Biejia Ruangan Tablets on apoptosis and endoplasmic reticulum related factor expressions in rat hepatic fibrosis model*

Jun-hua Zhong,Yong Yuan,Fei-fei Song,Shi-zhong Yang,Dan Lin
(Department od Traditional Chinese Medicine,the Affiliated Hospital of Hainan Medical College,Haikou,Hainan 570102,China)

ObjectiveTo investigate the effects of Hepatic Fibrinolysis Granules combined with Fufang Biejia Ruangan Tablets on cell apoptosis and endoplasmic reticulum(ER)related factor expressions in rat hepatic fibrosis model.MethodsA total of 48 male SD rats of clean grade were randomly divided into normal control group,model control group,Biejia Ruangan Tablets group and Hepatic Fibrinolysis Granules group with 12 rats in each group.The hepatic fibrosis models were copied in all the groups except the normal control group.After the model was made for 3 weeks,the rats were given medicines at the same time.In the normal control group and the model control group the rats were given intragastric administration of 1.5 ml/kg normal saline,once a day.In the Fufang Biejia Ruangan Tablets group the rats were given 33.3%Fufang Biejia Ruangan Tablets solution 1.5 ml/kg for gavage,once a day.In the Hepatic Fibrinolysis Granules group the rats were given 33.3%Hepatic Fibrinolysis solution 1.5 ml/kg for gavage,once a day.The medication continued for 6 weeks.In the 3rd,6th and 9th week of the experiment,the liver pathology was observed,the number of apoptosis cells and the levels of hepatic fibrosis indexes and ER-related indexes were detected in all the groups.ResultsCompared with other groups,the fibrosis grade score significantly decreased(P＜0.05);the number of apoptotic hepatocytes was significantly reduced(P＜0.05);the levels of hyaluronic acid,laminin,serum type III procollagen and type IV collagen were decreased significantly(P＜0.05);CHOP and ATF6 expression levels also decreased significantly(P＜0.05)in the Hepatic Fibrinolysis Granules group.ConclusionsHepatic Fibrinolysis Granules decrease the number of apoptosis cells and hepatic fibrosis level in rats with hepatic fibrosis.They are better than Biejia Ruangan Tablets in improvement of the pathological changes of liver and adjustment of endoplasmic reticulum related indicators,therefore have clinical significance.

Hepatic Fibrinolysis Granules;Biejia Ruangan Tablets;rat model of hepatic fibrosis;cell apoptosis;endoplasmic reticulum related factor

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.13.002

1005-8982（2017）13-0006-08

2016-12-15

海南省衛(wèi)計(jì)委科學(xué)課題（瓊衛(wèi)2011-54）