李曼麗，楊朝陽，李曉光

（1.北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 北京 100191；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 神經(jīng)生物學(xué)系 北京 100069）

殼聚糖載體加載堿性成纖維細(xì)胞因子誘導(dǎo)成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的研究*

李曼麗1，楊朝陽2，李曉光1

（1.北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 北京 100191；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 神經(jīng)生物學(xué)系 北京 100069）

目的利用生物材料在體外將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞。方法利用全骨髓貼壁培養(yǎng)法提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并利用細(xì)胞表面抗原CD45和CD90進行鑒定。分為3組，單純殼聚糖組、加載了堿性成纖維細(xì)胞因子（bFGF）的殼聚糖組和單純bFGF組。分別在3和7 d時利用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記蛋白Nestin、幼稚神經(jīng)元標(biāo)記蛋白Tuj-1等指標(biāo)的表達(dá)情況。結(jié)果加載了bFGF的殼聚糖處理細(xì)胞時，細(xì)胞在第3天出現(xiàn)了大量的Nestin陽性細(xì)胞，雖然在其他兩組中也出現(xiàn)了Nestin陽性細(xì)胞，但加載了bFGF的殼聚糖組比其他兩組多，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。同樣的，在誘導(dǎo)7 d時，Nestin和Tuj-1雙陽性的細(xì)胞在加載了bFGF組中的比例要比其他兩組要多，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論加載有bFGF的殼聚糖能夠?qū)⒊赡甏笫蠊撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞高比例誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自體移植治療神經(jīng)退行性疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)提供了理論和實驗依據(jù)。

殼聚糖；堿性成纖維細(xì)胞因子；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；神經(jīng)分化

殼聚糖為脫乙酰甲殼素，來源廣泛。殼聚糖由于游離氨基的存在，其反應(yīng)活性比甲殼素強[1]。由于其價格低廉，具有良好的生物性能并且組織相容性和生物降解性良好[2]，逐漸在組織工程中廣泛應(yīng)用。堿性成纖維細(xì)胞因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）由154個氨基酸組成，為FGF家族的一員，對促血管形成、誘導(dǎo)胚胎發(fā)育、促進神經(jīng)生長等功能有廣泛的作用，并在體內(nèi)廣泛分布，其生物活性要比酸性成纖維細(xì)胞生長因子（acid fibroblast growth factor，aFGF）大近 10 倍[3]。有研究證實，bFGF 能夠促進神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)細(xì)胞。

筆者之前的研究證實加載了NT-3的殼聚糖能夠緩釋NT-3誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖并遷移到脊髓損傷區(qū)修復(fù)脊髓損傷并改善其運動功能[4-5]。筆者也研究了殼聚糖加載bFGF后對神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響，結(jié)果顯示殼聚糖加載了bFGF后誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的比例要比單純的殼聚糖和單純的bFGF的比例提高[6]。

神經(jīng)干細(xì)胞不能用于自體移植，可能會導(dǎo)致免疫排斥和倫理問題，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞易于獲取，可以取自自體，避免了上述問題，近年來已經(jīng)成為了細(xì)胞移植的熱門資源。本文主要研究殼聚糖加載bFGF誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：成年Wistar大鼠，220 g左右。SPF級，首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供，許可證號：SYXK（京）2013-0004。

試劑：殼聚糖和bFGF（美國Sigma公司），Nestin和Tuj-1（美國Millipore公司），山羊抗兔或山羊小鼠熒光二抗（美國Invitrogen公司），Hoechst33342（美國Sigma公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 成年骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提取6%水合氯醛0.6 ml/100 g腹腔注射麻醉。75%酒精浸泡60 s，放置于冰上。采用無菌手術(shù)器械，剪開皮膚、肌肉暴露股骨和脛骨，利器剪斷置于含1%青鏈霉素的PBS中，體式顯微鏡下剝除殘余肌肉和筋膜等，洗掉油脂和浮血，清洗3次后，注射器吸取2 ml含10%FBS的DMEM將骨髓沖出于含8 ml培養(yǎng)基的10 cm平板中。注射器吹打?qū)⒓?xì)胞吹散，于濕潤的37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)為P0代。

1.2.2 成年骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)傳代 P0代培養(yǎng)24 h后全換液，之后2～3 d全換液，待細(xì)胞生長至80%～90%融合進行傳代，傳代時先用PBS洗滌細(xì)胞2次，2 ml 0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，將細(xì)胞平均分到2個平板中，相同條件下傳至P3代以待下一步處理。

解析本地區(qū)的中考卷要從“類”著手，再將“類”分成若干個小類，那么每小類相當(dāng)于類中的一個“點”，通過對每個小類命題的解析，引導(dǎo)學(xué)生思考每小類之間的不同點，尋求小類命題的共同點，由小類到大類的歸納中抽象出質(zhì)的東西.

1.2.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定 將P3代細(xì)胞以1×105個/cm2密度種植于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，去除培養(yǎng)基，用PBS洗3遍。每孔加入含EDTA的胰酶0.5 ml消化2 min，加入等體積胰酶終止消化，收集細(xì)胞到EP管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1ml PBS洗1次，同樣1000r/min離心5 min，棄上清加入熒光標(biāo)記Ⅰ抗（PE-Cy5-labeled anti-Rat CD45/FITC-labeled anti-Rat CD90）平均每 106個細(xì)胞加1μl，冰上孵育40 min后，PBS洗滌1次，5 min，上機檢測。

1.2.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化 P3代細(xì)胞以1×105個/cm2密度種植于放置有多聚賴氨酸包被過蓋玻片的6孔板中。24 h后待細(xì)胞貼壁，每孔分別添加不同的誘導(dǎo)劑：10 mg/ml殼聚糖，單純bFGF組向培養(yǎng)基中加入20 ng/ml bFGF，bFGF-殼聚糖載體組向培養(yǎng)基中加入10 mg/ml加載有bFGF的殼聚糖。每2～3 d半量換液1次。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測 Trizol法提取全RNA，用含有去除基因組DNA的gRemover的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，之后以cDNA為模板，Nestin正向引物：GAGGACCAGG AGGCATGTAG，反向引物：TCTTCTGGAGACCTCAGG GA；GAPDH 正向引物：AGGTCGGTGTGAACGGATT TG，反向引物：TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA。

1.2.6 免疫熒光染色 PBS洗3次，5 min/次。4%的多聚甲醛4℃固定40 min。PBS洗掉多聚甲醛，并用0.3%TritonX-100破膜5 min。之后1%正常山羊血清（NGS）于37℃中孵育30 min。加入相應(yīng)一抗，濃度分別為 Nestin 1∶100 Tuj-1 1∶100，37℃孵育2h，PBS洗掉多余一抗后加入Alexa594和Alexa 488標(biāo)記的山羊抗兔或山羊小鼠熒光二抗（1∶300），37℃孵育1 h。PBS洗掉多余二抗后，Hoechst33342（1∶1 000）染核。去離子水洗掉多余染料，50%PB甘油封片后BX51熒光顯微鏡成像。

1.2.7 圖像分析 DP Controller中成像并隨機選取20個視野拍照，分別計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)和傳代生長狀態(tài)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)時細(xì)胞貼壁后形狀不規(guī)則且細(xì)胞數(shù)目較少，待生長1～2 d后，細(xì)胞開始有小的突起進而其形態(tài)變?yōu)殚L梭形。細(xì)胞傳代后，依然保持長梭形的形態(tài)但增殖速度明顯增加。見圖1。

2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定結(jié)果

利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在塑料制品中的貼壁性，采用全細(xì)胞貼壁法，去除不貼壁細(xì)胞。傳代3次后流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面抗原。經(jīng)鑒定，95%以上的細(xì)胞為CD45-/CD90+細(xì)胞。即95%以上為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。見圖2。

2.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞正常形態(tài) （×200）

圖2 細(xì)胞表面抗原流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果

圖3 各組N est i n表達(dá)情況

如圖3所示，誘導(dǎo)1 d后，加載bFGF的殼聚糖組中能夠看到細(xì)胞開始有突起，細(xì)胞形態(tài)開始向神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)發(fā)展。在單純殼聚糖組中細(xì)胞形態(tài)基本沒有變化，單純bFGF組中細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生了變化，但變化不明顯（見圖2）。誘導(dǎo)3 d后，這種變化進一步加劇，即單純殼聚糖誘導(dǎo)細(xì)胞幾乎沒有Nestin+細(xì)胞，但單純bFGF和加載有bFGF的殼聚糖誘導(dǎo)細(xì)胞時，Nestin+細(xì)胞更多，細(xì)胞突起更長。RT-PCR也能夠檢測到誘導(dǎo)3 d后在加載了bFGF的殼聚糖組中Nestin的RNA表達(dá)水平要比單純bFGF組的表達(dá)量高，單純殼聚糖組中幾乎沒有Nestin的表達(dá)。并且表達(dá)Nestin的細(xì)胞聚集成團狀，形成類神經(jīng)球的結(jié)構(gòu)。

2.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由神經(jīng)干細(xì)胞繼續(xù)分化為幼稚神經(jīng)元

為了驗證這些具有神經(jīng)干細(xì)胞特征的細(xì)胞是否能夠進一步向神經(jīng)細(xì)胞分化，本研究增加了誘導(dǎo)時間，在誘導(dǎo)7 d時檢測幼稚神經(jīng)元標(biāo)記蛋白Tuj-1和神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記蛋白的共標(biāo)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在加載有bFGF的殼聚糖組，能夠檢測到大量Nestin+和Tuj-1+雙標(biāo)細(xì)胞。在單純bFGF組能夠檢測到雙標(biāo)細(xì)胞但是數(shù)量不多。單純殼聚糖組沒有檢測到雙標(biāo)細(xì)胞。見圖4。

圖4 各組神經(jīng)干細(xì)胞向幼稚神經(jīng)元分化情況

3 討論

神經(jīng)退行性疾病是目前危害人類健康和生活質(zhì)量的疾病之一。神經(jīng)退行性疾病主要是由于神經(jīng)細(xì)胞損傷、凋亡、崩解或是傳導(dǎo)通路受阻造成的。為了解決這些問題，研究者們致力于研究補充損失的神經(jīng)細(xì)胞。為此，細(xì)胞誘導(dǎo)分化成為了研究熱點。

神經(jīng)干細(xì)胞作為神經(jīng)細(xì)胞的祖細(xì)胞，就是分化為神經(jīng)細(xì)胞，這其中包括神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。但是，成年動物內(nèi)源性NSCs主要位于海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層、側(cè)腦室下區(qū)、脊髓中央管室管膜區(qū)[6-8]，細(xì)胞資源較少，且不適宜自體移植。這樣就涉及免疫排斥和倫理問題，并具有成瘤風(fēng)險。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞臨床上易于獲得并對患者創(chuàng)傷較小能夠自體移植，不涉及免疫排斥和倫理問題，最近已經(jīng)成為了細(xì)胞移植的明星細(xì)胞。

殼聚糖為去乙?；募讱に?，在自然界中來源廣泛[9]。具有游離的氨基使其具有更強的反應(yīng)活性。殼聚糖具有良好的生物組織相容性，能夠在體內(nèi)降解[10]，在生物材料中研究較廣泛。筆者之前的研究證實，殼聚糖在結(jié)合NT-3后能夠在培養(yǎng)體系中緩釋14周以上[11-13]。解決了生長因子半衰期短，給藥方式不適合臨床等問題。

本研究采用了全骨髓貼壁法提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在塑料制品中具有貼壁的性質(zhì)，全骨髓貼壁法能夠去除大部分的其余細(xì)胞。利用流式細(xì)胞術(shù)通過檢測細(xì)胞表面抗原95%的細(xì)胞為CD45-/CD90+細(xì)胞。說明此方法能夠得到較高純度的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。為下一步的誘導(dǎo)分化做出了準(zhǔn)備。

誘導(dǎo)1 d后，單純殼聚糖組形態(tài)與正常的BMSC相似。說明BMSC不經(jīng)過誘導(dǎo)處理并不能夠自發(fā)的分化為神經(jīng)干細(xì)胞。而加載了bFGF的殼聚糖組和單純bFGF組的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了變化，細(xì)胞開始有了少量突起，單純bFGF組類似，說明在短時間內(nèi)單純bFGF和加載了bFGF的殼聚糖組可能在誘導(dǎo)效果上類似，主要是因為單純bFGF在短時間內(nèi)還能夠保持一定的濃度和效用。

誘導(dǎo)3 d后，單純殼聚糖組還是沒有變化，單純bFGF組和加載了bFGF的殼聚糖組誘導(dǎo)效果出現(xiàn)了差異。加載了bFGF殼聚糖組的Nestin表達(dá)要比單純殼聚糖組多，同樣細(xì)胞形態(tài)也均發(fā)生了變化，說明誘導(dǎo)3 d時加載了bFGF的殼聚糖組的誘導(dǎo)效果要比單純殼聚糖組明顯，可能是由于將bFGF加載到殼聚糖中，能夠使bFGF緩慢釋放，具有持續(xù)的誘導(dǎo)效果。本課題組先前的報道顯示加載了NT-3的殼聚糖具有緩釋NT-3的效果，并且緩釋時間能夠持續(xù)14周[13]。同樣說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在向神經(jīng)細(xì)胞分化的過程中是先分化為神經(jīng)干細(xì)胞，形成神經(jīng)球狀細(xì)胞后，才進行下一步分化。待誘導(dǎo)7 d后，細(xì)胞出現(xiàn)了Nestin和Tuj-1雙標(biāo)細(xì)胞，更說明了這些新生的誘導(dǎo)來的幼稚神經(jīng)元是經(jīng)神經(jīng)干細(xì)胞分化來的。同樣，3組誘導(dǎo)結(jié)果還是有差異的。MSC在經(jīng)加載了bFGF的殼聚糖的誘導(dǎo)，持續(xù)的bFGF的釋放導(dǎo)致MSC受到持續(xù)的bFGF的誘導(dǎo)，更多的細(xì)胞分化為了幼稚神經(jīng)元。單純bFGF在體內(nèi)的降解較快，半衰期只有幾分鐘，所以單純bFGF組中只有少量的Nestin和Tuj-1雙標(biāo)細(xì)胞。而單純殼聚糖組由于缺乏誘導(dǎo)因素，只有極少量的細(xì)胞甚至是沒有細(xì)胞能夠分化為Nestin和Tuj-1雙標(biāo)細(xì)胞。

本文結(jié)合了本課題組之前的研究，將bFGF加載到殼聚糖中研究其對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)情況。擴展了殼聚糖緩釋細(xì)胞因子的種類。證明了殼聚糖不僅能夠緩釋NT-3，同樣也能夠緩釋bFGF。并且能夠達(dá)到很好的誘導(dǎo)效果。為將殼聚糖緩釋細(xì)胞因子應(yīng)用于臨床奠定了基礎(chǔ)。另外，本實驗主要針對MSC，對于自體移植給藥都是很大的創(chuàng)新。為修復(fù)神經(jīng)退行性疾病及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷開辟了新思路。

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（張蕾 編輯）

Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells of adult rat into nerve cells induced by chitosan carrier loaded with bFGF*

Man-li Li1,Zhao-yang Yang2,Xiao-guang Li1
(1.Department of Biomedical Engineering,School of Biological Science and Medical Engineering,Beihang University,Beijing 100191,China;2.Department of Neurobiology,School of Basic Medical Sciences,Capital Medical University,Beijing 100069,China)

ObjectiveTo inducein vitrodifferentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neuron-like cells by biological material.MethodsUsing bone marrow adherent characteristic,bone marrow mesenchymal stem cells were extracted.Then the cells were identified by cell surface antigens CD45 and CD90.The cells were divided into three groups namely pure chitosan,chitosan-loaded bFGF group and bFGF group.The expressions of neural stem cell marker Nestin and neuron-like cell marker Tuj-1 were evaluated using immunocytochemical method on the 3rd and 7th d respectively.ResultsThe proportion of Nestin-positive cells in the bFGF loaded group on the 3rd day was significantly higher than that in the other two groups(P＜0.05).Similarly,the proportion of Nestin and Tuj-1 double positive cells in the bFGF loaded group was significantly higher than that in the other two groups on the 7th day of induction(P＜0.05).ConclusionsbFGF-loaded chitosan can induce differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells of adult rat into neuron-like cells at a high proportion,which provides a theoretical and experimental evidence for autologous transplantation in the treatment of neurodegenerative diseases and centralnervous system injury.

chitosan;bFGF;BMSC;neuronal differentiation

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.13.001

1005-8982（2017）13-0001-05

2016-12-16

國家國際科技合作專項項目（No：2014DFA30640）

李曉光，E-mail：lxgchina@sina.com；Tel：010-83950083