蔣盼盼+陳志誼+甘穎+劉永鋒+陸凡

摘要：通過(guò)設(shè)施大棚藥效試驗(yàn)，探究解淀粉芽孢桿菌B1619對(duì)設(shè)施蔬菜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的防治效果；通過(guò)室內(nèi)毒力試驗(yàn)，測(cè)定解淀粉芽孢桿菌B1619對(duì)蔬菜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的毒殺效果。設(shè)施大棚藥效試驗(yàn)結(jié)果表明，一般情況下，溝施的田間防效高于穴施；當(dāng)施用菌粉量較少時(shí)，穴施田間防效高于溝施；設(shè)施番茄、黃瓜溝施解淀粉芽孢桿菌B1619量為 16 g/株時(shí)，其防效分別為69.12%、87.77%。室內(nèi)毒力測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果表明，40%甲基異柳磷乳油對(duì)2齡線(xiàn)蟲(chóng)的EC50（24 h）為85.252 1 mg/L，EC50（48 h）為77.704 7 mg/L；解淀粉芽孢桿菌B1619發(fā)酵液對(duì)2齡線(xiàn)蟲(chóng)的EC50（24 h）為12.056 0 CFU/mL，EC50（48 h）為12.906 6 CFU/mL；解淀粉芽孢桿菌B1619粗提物對(duì)2齡線(xiàn)蟲(chóng)的EC50（24h） 為稀釋 9.324 6倍，EC50（48 h）為稀釋9.960 4倍。室內(nèi)外試驗(yàn)結(jié)果均表明，解淀粉芽孢桿菌B1619對(duì)設(shè)施蔬菜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病有明顯的防治效果。

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌B1619；設(shè)施蔬菜；根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)；毒力測(cè)定；防治效果

中圖分類(lèi)號(hào)： S432.4+5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）12-0081-04

近年來(lái)，設(shè)施蔬菜發(fā)展迅速，特別是番茄、辣椒、黃瓜，已成為高效農(nóng)業(yè)發(fā)展的新產(chǎn)業(yè)。然而，因設(shè)施大棚的密閉性和單一作物連作引起的茄果類(lèi)蔬菜土傳病害（根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)?。╊l繁暴發(fā)，嚴(yán)重制約著該產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1-2]。2011年宋志強(qiáng)對(duì)江蘇省9個(gè)地區(qū)進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)平均發(fā)生率為73.6%[3]。據(jù)河南、山東、云南等地區(qū)報(bào)道，因該病危害，溫室大棚一般減產(chǎn)20%～30%，重者可達(dá)60%～70%，甚至絕收[4]。利用生防菌防治設(shè)施蔬菜土傳病害的研究備受關(guān)注，這些微生物通過(guò)分泌抗菌物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗病性等方式，調(diào)節(jié)根圍微生態(tài)結(jié)構(gòu)、抑制病害發(fā)生、促進(jìn)植物生長(zhǎng)，在防治植物病害中發(fā)揮著重要作用[5-7]。江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所自2006年起，開(kāi)展生物防治設(shè)施蔬菜土傳病害研究，針對(duì)番茄枯萎病菌、青枯病菌進(jìn)行拮抗微生物的篩選，從2萬(wàn)多個(gè)菌株中分離出具有較強(qiáng)拮抗能力的生防菌——解淀粉芽孢桿菌B1619[8]。該菌株可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性，并對(duì)番茄有促生作用，能有效控制設(shè)施蕃茄枯萎病、青枯病、根腐病、立枯病等重要土傳病害引起的連作障礙[9-11]。在推廣應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，生防菌B1619能夠有效地防治設(shè)施蔬菜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病。

本研究通過(guò)室內(nèi)毒力測(cè)定、日光大棚試驗(yàn)，明確生防菌B1619對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的抑制作用，對(duì)設(shè)施蔬菜（番茄、黃瓜）根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的防治效果，為今后大面積推廣應(yīng)用B1619防控設(shè)施蔬菜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試蔬菜品種番茄品種為天妃七號(hào)，購(gòu)自沈陽(yáng)谷雨種業(yè)有限公司；黃瓜品種為德瑞特201，購(gòu)自天津德瑞特種業(yè)有限公司。

1.1.2供試菌株解淀粉芽孢桿菌B1619，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物防治研究室提供。

1.1.3培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基為YPG（胰蛋白胨5.0 g，葡萄糖5.0 g，酵母膏5.0 g，水1.0 L，pH值為7.0）；固體培養(yǎng)基為YPGA（在YPG培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂）。

1.1.4供試藥劑40%甲基異柳磷乳油（青島雙飛農(nóng)化生物科技有限公司）。

1.1.5供試生物殺菌劑1.2億活芽孢/mL解淀粉芽孢桿菌B1619水分散粒劑（江蘇省蘇科農(nóng)化有限責(zé)任公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1生防菌B1619發(fā)酵液的制備從保存菌株B1619的試管中挑取2環(huán)菌種在YPGA斜面上，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h活化，即得到新鮮活化的B1619菌株；挑取2環(huán)轉(zhuǎn)接到含有330 mL YPG培養(yǎng)基的三角瓶中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng) 48 h，即為B1619發(fā)酵液原液。

1.2.2B1619發(fā)酵液含菌量的測(cè)定采用平板菌落計(jì)數(shù)法。取上述B1619發(fā)酵液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)? mL稀釋菌液涂布于已凝固的YPGA平板上，28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，檢測(cè)B1619發(fā)酵液含菌量為4.8×109 CFU/mL。

1.2.3B1619發(fā)酵液粗提物的制備將B1619發(fā)酵原液于10 000 r/min、4 ℃冷凍離心15 min，得上清液即粗提物原液。

1.3生防菌B1619防治設(shè)施蔬菜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病田間試驗(yàn)

1.3.1B1619防治設(shè)施番茄根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)田間試驗(yàn)于2014年8月在江蘇省徐州市銅山區(qū)棠張鎮(zhèn)前進(jìn)村日光大棚中進(jìn)行。田間小區(qū)試驗(yàn)共有7個(gè)處理，處理1：穴施，定植時(shí)施用8 g/株，定植后進(jìn)行田間管理再施用2次，每次4 g/株；處理2：穴施，定植時(shí)施用4 g/株，定植后進(jìn)行田間管理再施用2次，每次2 g/株；處理3：溝施，定植時(shí)施用 8 g/株，定植后進(jìn)行田間管理再施用2次，每次4 g/株；處理4：溝施，定植時(shí)施用4 g/株，定植后進(jìn)行田間管理再施用2次，每次2 g/株；處理5為空白對(duì)照，不施用生防菌B1619。每個(gè)小區(qū)種植128株苗，每個(gè)處理重復(fù)2次，試驗(yàn)小區(qū)隨機(jī)排列。

1.3.2B1619防治設(shè)施黃瓜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)田間試驗(yàn)于2015年2月在江蘇省徐州市銅山區(qū)棠張鎮(zhèn)前進(jìn)村日光大棚中進(jìn)行。田間小區(qū)試驗(yàn)共有4個(gè)處理，處理1：溝施，定植時(shí)施用8 g/株，定植后進(jìn)行田間管理再施用2次，每次 4 g/株；處理2：溝施，定植時(shí)施用4 g/株，定植后進(jìn)行田間管理再施用2次，每次2 g/株；處理3：穴施，定植時(shí)施用 8 g/株，定植后進(jìn)行田間管理再施用2次，每次4 g/株；處理4為空白對(duì)照，不施用生防菌B1619。每個(gè)小區(qū)種植352株苗，每個(gè)處理重復(fù)2次，試驗(yàn)小區(qū)隨機(jī)排列。endprint

1.3.3田間管理穴盤(pán)法育苗，苗齡30 d時(shí)移栽定植，定植時(shí)施用菌粉后立即澆足活棵水，定植后進(jìn)行常規(guī)田間管理，按照各個(gè)處理的方法施撒1.2億活芽孢/mL解淀粉芽孢桿菌B1619水分散粒劑，然后立即灌溉。

1.3.4田間試驗(yàn)調(diào)查番茄、黃瓜均在收獲后拔秧時(shí)，調(diào)查每個(gè)小區(qū)各處理植株根部的發(fā)病情況，參考Barker等分級(jí)方法[12-13]，計(jì)算病情指數(shù)及防效。

1.3.5田間試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)方法病情指數(shù)=（各級(jí)發(fā)病數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總?cè)~片數(shù)×最高級(jí)代表值）×100；

防效=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/（對(duì)照病情指數(shù)）×100%。

1.4生防菌B1619防治設(shè)施蔬菜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病室內(nèi)毒力測(cè)定

1.4.1根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的分離試驗(yàn)所用根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)采自江蘇省徐州市銅山區(qū)棠張鎮(zhèn)前進(jìn)村，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)（Meloidogyne incognita）。取發(fā)病番茄植株根系，用水輕輕沖洗，挑取根部新鮮卵塊，置于貝曼漏斗中孵化，24 h后開(kāi)始收集2齡幼蟲(chóng)（J2），每天收集1次，共收集1周，2齡線(xiàn)蟲(chóng)懸浮液稀釋為100頭/mL，4 ℃保存待用。

1.4.2B1619對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)室內(nèi)毒力的測(cè)定

1.4.2.1各種濃度菌液和藥劑的制備試驗(yàn)組為解淀粉芽孢桿菌B1619發(fā)酵原液、B1619發(fā)酵液粗提物原液與稀釋5、10、15、20、25倍；陽(yáng)性對(duì)照為40%甲基異柳磷乳油，依次配制成10、25、50、100、200 mg/L；以無(wú)菌水和YPG培養(yǎng)基處理為空白對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)6次。

1.4.2.2根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)毒力測(cè)定方法吸取1 mL分離所得的2齡根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)懸浮液于已滅菌的直徑6 cm的培養(yǎng)皿中，分別加入1 mL不同稀釋倍數(shù)的B1619發(fā)酵液、粗提物、甲基異柳磷等，放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48 h后進(jìn)行觀(guān)察計(jì)數(shù)，采用針觸法判斷并記錄線(xiàn)蟲(chóng)死亡情況[14]，統(tǒng)計(jì)死亡率。

1.5數(shù)據(jù)分析

利用DPS 7.05軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1生防菌B1619防治設(shè)施蔬菜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的田間試驗(yàn)結(jié)果

2014年8月開(kāi)展的B1619水分散粒劑防治番茄根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病田間小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。其中溝施處理下，定植時(shí)施用 8 g/株，定植后進(jìn)行田間管理再施用2次，每次4 g/株，田間防效為6912%，防效高于相同條件下穴施，穴施田間防效為2861%；溝施處理下，定植時(shí)施用4 g/株，定植后進(jìn)行田間管理再施用2次，每次2 g/株，田間防效為7.84%，防效低于相同條件下穴施，穴施田間防效為24.79%。

表示差異顯著（P<0.05）。表2同。

2015年2月開(kāi)展的B1619水分散粒劑防治黃瓜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病田間小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。其中溝施處理下，定植時(shí)施用 8 g/株，定植后進(jìn)行田間管理再施用2次，每次4 g/株防效最高，為8777%；穴施處理下，定植時(shí)施用8 g/株，定植后進(jìn)行田間管理再施用2次，每次4 g/株防效次之，防效為7193%；溝施處理下，定植時(shí)施用 4 g/株，定植后進(jìn)行田間管理再施用2次，每次2 g/株防效為6402%。本田間試驗(yàn)結(jié)果表明，相同條件下，一般溝施的田間防效高于穴施；當(dāng)施用菌粉量較少時(shí)，穴施田間防效高于溝施。

2.2生防菌B1619防治設(shè)施蔬菜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果

由表3可以看出毒力回歸方程B1619發(fā)酵液濃度與線(xiàn)蟲(chóng)死亡率的關(guān)系，處理24 h時(shí)毒力回歸方程為y=-3.253 9x+89.229，r2=0.951 9，EC50=12.056 0倍；處理48 h時(shí)，毒力回歸方程為y=-3.382x+93.65，r2=0.950 7，EC50=12.906 6 CFU/mL。隨著B(niǎo)1619發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的增大，根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的死亡率逐漸降低，根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)死亡率與B1619發(fā)酵液稀釋倍數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。另外，隨著B(niǎo)1619發(fā)酵液處理時(shí)間的增加，根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的死亡率增高。表3B1619發(fā)酵液對(duì)2齡線(xiàn)蟲(chóng)的毒力測(cè)定結(jié)果

由表4毒力回歸方程可以看出B1619發(fā)酵液粗提物濃度與線(xiàn)蟲(chóng)死亡率的關(guān)系，處理24 h時(shí)毒力回歸方程為y=-3.007 3x+78.042 0，r2=0.978 1，EC50為稀釋9.324 6倍；處理48 h時(shí)，y=-3.105 0x+80.927 0，r2=0.971 7，EC50為稀釋9.960 4倍。隨著B(niǎo)1619發(fā)酵液粗提物稀釋倍數(shù)的增大，根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的死亡率逐漸降低，根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)死亡率與B1619發(fā)酵粗提物稀釋倍數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；另外，隨著B(niǎo)1619發(fā)酵粗提物處理時(shí)間的增加，根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的死亡率增高。表4B1619粗提物對(duì)2齡線(xiàn)蟲(chóng)的毒力測(cè)定結(jié)果

3結(jié)論與討論

目前設(shè)施蔬菜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的防治通常采用農(nóng)業(yè)、化學(xué)、物理等方法。農(nóng)業(yè)防治中常采用清除病殘?bào)w、嫁接栽培、合理輪作等方法；化學(xué)防治中常采用有機(jī)磷類(lèi)如甲基異柳磷等化學(xué)殺線(xiàn)蟲(chóng)劑處理土壤，雖然室內(nèi)毒力測(cè)定試驗(yàn)時(shí)線(xiàn)蟲(chóng)死亡率很高，但許多化學(xué)農(nóng)藥因?qū)Ψ前袠?biāo)生物具有潛在毒性，在蔬菜中殘留量高，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，已被陸續(xù)禁用；物理防治主要采用太陽(yáng)能高溫悶棚的方法。這些措施對(duì)設(shè)施蔬菜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的防控效果不理想，根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病在許多蔬菜種植區(qū)依然十分嚴(yán)重。植物保護(hù)專(zhuān)家們力圖通過(guò)利用生防菌等微生物及生物農(nóng)藥代替化學(xué)農(nóng)藥防治線(xiàn)蟲(chóng)病害[15]，如李頌等研究表明，黑曲霉菌株Snf009發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)具有較強(qiáng)的活性，它對(duì)溫室番茄線(xiàn)蟲(chóng)的防效達(dá)到50%[16]。馬金慧等發(fā)現(xiàn)哈茨木霉菌株TRI2對(duì)黃瓜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)有較好的防治作用[17]。唐佳頻等對(duì)1 432株海洋和極地來(lái)源的細(xì)菌進(jìn)行抗南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的離體篩選試驗(yàn)，明確惡臭假單胞菌1A00316菌體具有誘導(dǎo)番茄對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的抗性作用[18]。張艷杰等報(bào)道玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93-63 菌株發(fā)酵物對(duì)設(shè)施蔬菜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病具有較好的防治效果[19]。本研究從土壤中分離篩選獲得解淀粉芽孢桿菌生防菌株B1619，研發(fā)成“1.2億活芽孢/mL解淀粉芽孢桿菌B1619水分散粒劑”，對(duì)設(shè)施番茄、黃瓜的防效分別可達(dá)到69.12%、87.77%。實(shí)踐證明，設(shè)施條件下，在土壤中大量引進(jìn)有益微生物（生防菌劑）能夠有效地防治蔬菜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病，并且無(wú)毒、無(wú)致病性、無(wú)殘留，對(duì)設(shè)施蔬菜的生長(zhǎng)有一定的促生作用，生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益均十分顯著，具有廣闊的應(yīng)用前景。endprint

芽孢桿菌是一類(lèi)廣泛存在于土壤、湖泊、海洋、動(dòng)植物表體的生防菌，多數(shù)菌株無(wú)致病性、生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單，在植物的表面易于存活、定殖、繁殖，對(duì)多種植物病害尤其是土傳病害有較好的防控效果；同時(shí)生產(chǎn)芽孢桿菌制劑的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，制劑穩(wěn)定，儲(chǔ)存期長(zhǎng)，施用方便，對(duì)人畜安全，對(duì)環(huán)境友好，是一種理想的防控植物病害流行的生防因子[20]。成飛雪等在田間施用對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)有毒殺作用的芽孢桿菌 YC-10 菌株，發(fā)現(xiàn)它能降低黃瓜根際根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)J2的蟲(chóng)口密度，減少根結(jié)的形成，促進(jìn)植株生長(zhǎng)[21]。余子全等研究表明，堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌YBf-10在穩(wěn)定期能大量合成對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)具有毒殺活性的小分子化合物，對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)表現(xiàn)出極高毒力[22]。Tong等報(bào)道蠟樣芽孢桿菌X5有一定的殺線(xiàn)蟲(chóng)活性[23]。本研究分離篩選獲得的解淀粉芽孢桿菌B1619是1株對(duì)設(shè)施蔬菜土傳病害多種病原菌（根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)）具有較強(qiáng)拮抗能力的生防菌，能有效控制設(shè)施蕃茄枯萎病、青枯病、根腐病、立枯病等重要土傳病害引起的連作障礙，同時(shí)該菌株可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性，并對(duì)番茄有促生作用。本試驗(yàn)獲得的解淀粉芽孢桿菌生防菌株B1619對(duì)設(shè)施蔬菜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)有較好的田間防控效果，進(jìn)一步驗(yàn)證了芽孢桿菌在植病生防領(lǐng)域中具有較大的研究和應(yīng)用價(jià)值。

目前國(guó)內(nèi)外已報(bào)道多種生防菌中含有殺線(xiàn)蟲(chóng)活性物質(zhì)，如Huang等發(fā)現(xiàn)1株具有殺根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的根際細(xì)菌巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）YMF3.25，該菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)具有很強(qiáng)的抑制作用，經(jīng)固相微萃取（SPME-GCMS）分析和鑒定表明，其主要的活性揮發(fā)物質(zhì)為苯乙醛（benzeneacetaldehyde）、2-壬酮（2-nonanone）、癸醛（decanal）、2-十一酮（2-undecanone）和二甲基二硫（dimethyl disulphide）[24]。曾慶飛等從白淺灰鏈霉菌的發(fā)酵液中分離獲得2個(gè)對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)J2具有活性的化合物，其中1個(gè)活性組分經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定為諾卡胺素（nocardamine）[25]。本試驗(yàn)使用的解淀粉芽孢桿菌B1619發(fā)酵液粗提物對(duì)2齡根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)有明顯的毒殺作用，用粗提物原液處理后線(xiàn)蟲(chóng)的死亡率分別為78.85%、82.49%；解淀粉芽孢桿菌B1619發(fā)酵液原液處理后線(xiàn)蟲(chóng)的死亡率分別為8055%、84.99%；B1619發(fā)酵液粗提物和發(fā)酵液對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明，B1619的發(fā)酵液粗提物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)起主要毒殺作用。至于B1619菌株發(fā)酵液粗提物中對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)有毒殺作用的主要生物活性物質(zhì)以及活性物質(zhì)的分離、結(jié)構(gòu)鑒定、作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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