王芳+楊笑笑+李振輪+楊水英

摘要：研究礦質(zhì)營養(yǎng)元素硼、鈣、鎂、鐵對番茄青枯菌在馬鈴薯液體培養(yǎng)基中生長的影響，同時研究硼、鈣、鎂、鐵分別對青枯菌胞內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性的影響，最后采用盆栽接種法研究復(fù)合礦質(zhì)元素組合對番茄青枯病發(fā)病率的影響。結(jié)果表明，礦質(zhì)元素硼、鈣、鎂、鐵對青枯菌在馬鈴薯液體培養(yǎng)基中的生長有顯著的抑制作用；經(jīng)鈣、鎂、鐵處理過的青枯菌胞內(nèi)SOD、POD、CAT活性均顯著升高，而經(jīng)硼處理過的青枯菌胞內(nèi)SOD、POD、CAT活性顯著低于對照組；土壤中添加復(fù)合礦質(zhì)元素組合后，盆栽試驗結(jié)果表明，隨著時間的增長，添加礦質(zhì)元素的處理中青枯病菌的數(shù)量減少，番茄青枯病的發(fā)病時間推遲，并且發(fā)病率減緩。

關(guān)鍵詞：礦質(zhì)元素；青枯病菌；番茄；盆栽試驗；生長；致病力

中圖分類號： S436.412.1+5文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）12-0077-04

番茄青枯菌是一種土傳病原菌，屬于勞爾氏菌屬假單胞桿菌（Ralstonia solanacearum），該菌可在土壤中長期殘存，通過寄主植物根部的自然孔口或傷口侵入寄主，比如馬鈴薯、番茄、花生、姜、木麻黃、桑、油橄欖、煙草等數(shù)百種植物，一旦侵染就會引發(fā)嚴重的細菌性萎蔫病，造成植物快速枯死，常給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失，目前尚無有效的防治方法，因此研究防控番茄青枯病的有效方法一直是熱點和難點。

礦質(zhì)營養(yǎng)元素不僅影響農(nóng)作物的生長發(fā)育、產(chǎn)量、品質(zhì)，而且一些礦質(zhì)營養(yǎng)元素還抑制植物病害的發(fā)生[1]。如 Sugimoto 等研究表明，大豆移栽前及移栽后14 d，噴施甲酸鈣、硝酸鈣都能顯著抑制大豆莖腐病的發(fā)生[2]。李鑫研究指出，感染馬鈴薯Y病毒的煙草噴施鐵元素、銅元素均能不同程度地提高煙株體內(nèi)葉綠素含量，說明鐵元素、銅元素能抑制病毒對葉綠體的降解，減輕病毒病的癥狀[3]。Dannon等研究硅營養(yǎng)與番茄青枯病的關(guān)系指出，增加硅營養(yǎng)可明顯降低番茄青枯病的發(fā)病率、病情指數(shù)，誘導(dǎo)番茄對青枯病產(chǎn)生抗病特性[4-7]。He等研究指出，碳酸鈣可以作為一種土壤改良劑，通過提高土壤中鈣離子濃度來抑制青枯病菌生長，從而控制由青枯菌引起的煙草青枯病[8]。營養(yǎng)調(diào)控是一條值得探索的新途徑，然而目前尚無鎂、鐵抑制青枯病菌生長的研究報道，也沒有硼、鈣、鎂、鐵復(fù)合施用抑制青枯菌生長及對青枯病發(fā)生影響的研究報道。

本試驗研究了硼、鈣、鎂、鐵4種礦質(zhì)營養(yǎng)元素對青枯菌生長的影響。結(jié)果表明，硼、鈣、鎂、鐵可以顯著抑制番茄青枯菌的生長，同時4種元素復(fù)合可以顯著延緩番茄青枯病的發(fā)生，研究結(jié)果為利用礦質(zhì)營養(yǎng)元素防治番茄青枯病的發(fā)生奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

供試菌株為番茄青枯病菌，由土壤多尺度界面過程與調(diào)控重慶市重點實驗室分離鑒定。

供試土壤于2013年6月采自重慶市彭水縣潤溪鎮(zhèn)白果坪，其基本理化性質(zhì)詳見表1。表1供試土壤的基本性質(zhì)

土樣營養(yǎng)元素含量（g/kg）全氮全磷全鉀有機質(zhì)含水量

（%）有效養(yǎng)分含量（mg/kg）堿解氮速效磷速效鉀pH值

（1 ∶1）正交試驗1.700.791.510.019 3926.31119.0092.90270.006.18盆栽試驗1.720.623.980.031 5925.1380.5053.36258.036.11

番茄品種為美國大紅王。

礦質(zhì)元素試劑包括MgSO4·7H2O、Na2B4O7·10H2O、Fe2（SO4）3·xH2O、CaSO4·2H2O，以上均為分析純。

基本培養(yǎng)基包括PCCG選擇性培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基。

Hoagland營養(yǎng)液：1 L母液（1），KNO3 101.11 g、KH2PO4 27.28 g、MgSO4 98.61 g；1 L母液（2），Ca（NO3）2 205.05 g；1 L 母液（3）：H2BO3 32.86 g、MnCl2·7H2O 1.81 g、ZnSO4·7H2O 0.22 g、H3MoO4·H2O 0.09 g、CuSO4·5H2O 0.08 g；1 L 母液（4），F(xiàn)eSO4·7H2O 1.39 g、Na·EDTA 1.86 g。每配制1 L營養(yǎng)液需（1）4 mL、（2）5 mL、（3）1 mL、（4）4 mL。

1.2方法

1.2.1硼、鈣、鎂、鐵對青枯菌在液體培養(yǎng)基中生長量的影響本試驗選擇硼、鈣、鎂、鐵4種礦質(zhì)營養(yǎng)元素，每種元素根據(jù)植物在土壤中缺乏臨界值、毒害臨界值設(shè)10個濃度處理水平（表2），將不同濃度水平的硼、鈣、鎂、鐵添加到馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中，以不添加礦質(zhì)營養(yǎng)元素的馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基為對照，每個處理重復(fù)3次，在30 ℃、160 r/min 條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，隔12 h取樣分析培養(yǎng)液D600 nm，估算青枯菌數(shù)量，從而篩選出可抑制青枯病菌生長的礦質(zhì)元素適宜濃度水平。

1.2.2硼、鈣、鎂、鐵對番茄青枯菌細胞內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）的影響將礦質(zhì)元素硼、鈣、鎂、鐵添加到接種了青枯菌的馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中，160 r/min、30 ℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，以不添加硼、鈣、鎂、鐵為對照。硼、鈣、鎂、鐵濃度水平設(shè)置分別為90、600、400、150 mg/kg。將培養(yǎng)48 h的菌懸液4 ℃、5 000 r/min離心10 min，去除上清液，加適量磷酸緩沖液洗滌2次，離心取沉淀。1 g濕菌體中加入3倍體積的磷酸緩沖液，制成菌懸液，用樣品均質(zhì)破碎儀破碎（6 m/s、40 s），然后12 000 r/min、4 ℃離心 20 min，取上清液，即為粗酶液，用于SOD、POD、CAT活性的測定，測定方法參照文獻[3，11]。endprint

1.2.34種礦質(zhì)元素組合對土壤中青枯菌生長的影響根據(jù)“1.2.1”節(jié)的試驗結(jié)果，選取硼、鈣、鎂、鐵4種礦質(zhì)元素中抑制效果較好的幾個水平（表3），并且在缺乏臨界值和毒害臨界值之間進行正交試驗。將礦質(zhì)元素鎂、鈣、硼、鐵根據(jù)正交表 L9（34） 進行組合（表4），逐次添加到500 g土壤中，混勻后置于1 L三角瓶中滅菌，設(shè)空白對照。然后接種青枯菌使土壤的含菌量約為0.5億CFU/g，攪拌均勻保持土壤水分相對濕度為60%，置于30 ℃條件下培養(yǎng)。每隔10 d稱取樣品50.0 g，采用稀釋平板法，在PCCG選擇性培養(yǎng)基上進行平板接種，土壤懸液接種量為0.2 mL，每個稀釋度設(shè)3次重復(fù)，接種后的平板于30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，待菌落長出后用Acolyte全自動菌落計數(shù)儀進行計數(shù)，再根據(jù)稀釋濃度推算CFU值。

1.2.4復(fù)合礦質(zhì)元素組合對番茄青枯病發(fā)病的影響根據(jù)“1.2.3”節(jié)的試驗結(jié)果，采用抑制青枯病菌生長效果良好的復(fù)合礦質(zhì)元素配比進行盆栽試驗。取純凈的番茄種子，置于培養(yǎng)皿中的濕濾紙上，在25 ℃的培養(yǎng)箱中催芽48 h，把已催芽的種子播到穴盤中，每隔10 d澆霍格蘭氏營養(yǎng)液（Hoaglands solution），使植株正常生長。將過篩去除石塊和泥塊的土壤混勻，每個營養(yǎng)缽裝入1.0 kg土，每個處理25個營養(yǎng)缽即25個重復(fù)。將礦質(zhì)元素鎂、鈣、硼、鐵按組合分別混入土壤中，CK不添加這4種礦質(zhì)元素。滅菌后，按照100萬CFU/g土壤的量接入青枯病菌，3 d后將株高為20～30 cm，6～7張真葉的番茄植株傷根后移入上述土壤中。移苗后進行常規(guī)水肥管理，從番茄植株出現(xiàn)第1株病株開始調(diào)查記錄發(fā)病情況：發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)×100%。

1.2.5數(shù)據(jù)分析試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007、SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理，采用Duncans新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1礦質(zhì)元素硼、鈣、鎂、鐵對青枯菌在液體培養(yǎng)基中生長的影響

從表5可以看出，礦質(zhì)元素硼、鈣、鎂、鐵對青枯菌在馬鈴薯液體培養(yǎng)基中的生長有顯著的抑制作用。硼對青枯菌的抑制作用較強，隨著硼濃度的增大，硼對青枯菌生長的抑制作用逐漸增強，當(dāng)硼的濃度小于60 mg/kg（處理6）時，其對青枯菌生長的抑制率緩慢增強；當(dāng)硼的濃度大于90 mg/kg（處理7）時，其對青枯菌生長量的抑制作用非常強，抑制率均在70%以上；當(dāng)硼的濃度為200 mg/kg（處理10）時，抑制率達到9684%，青枯菌幾乎不生長，抑制效果為最佳。鈣對青枯菌生長的抑制作用隨著鈣濃度的增大而增強，低濃度的鈣對青枯菌的生長有一定的促進作用。鈣濃度為600 mg/kg（處理5）時對青枯菌生長量的抑制率顯著大于500 mg/kg（處理5）鈣時，抑制率增加40.10%。鎂、鐵對青枯菌生長的抑制率也隨濃度的增大而增大。鎂濃度高于500 mg/kg（處理7）時，對青枯菌的抑制作用較強；而濃度高于150 mg/kg（處理7）時，鐵對青枯菌生長的抑制作用較強。

2.2硼、鈣、鎂、鐵對番茄青枯菌細胞內(nèi)SOD、POD、CAT幾種酶的影響

試驗結(jié)果（表6）表明，在培養(yǎng)12 h后，與不處理的對照相比，經(jīng)600 mg/kg鈣、400 mg/kg鎂、150 mg/kg鐵處理過后的番茄青枯菌細胞內(nèi)SOD、POD、CAT活性均較對照顯著升

2.3復(fù)合礦質(zhì)元素組合對土壤中青枯菌生長的影響

據(jù)圖1可知，將青枯菌添加到土壤中后，青枯菌的數(shù)量隨著時間呈現(xiàn)先增后減少的趨勢。在培養(yǎng)20 d時，各處理青枯菌的數(shù)量較之前都有明顯的增長，其中組合1、2對青枯菌的生長有顯著地促進作用，但是在30 d時，組合1、2中青枯菌的數(shù)量顯著下降。而在40 d時，青枯菌的數(shù)量均呈現(xiàn)遞減趨勢，并且每種組合對青枯菌的生長都有顯著的抑制作用。培養(yǎng)20 d后，由圖1可以看出，隨著培養(yǎng)時間的增長，這4種礦質(zhì)元素組合對青枯菌生長的抑制作用逐漸增強，這可為田間施肥時間提供一定的理論參考。

2.4土壤中抑制青枯菌生長的礦質(zhì)元素最佳組合

根據(jù)圖1可知，在添加復(fù)合礦質(zhì)元素的土壤中培養(yǎng)青枯菌至40 d時，青枯菌的數(shù)量都呈現(xiàn)遞減趨勢，并且每種組合對青枯菌的生長都有顯著的抑制作用。所以筆者選擇40 d時的結(jié)果進行正交試驗。通過對正交試驗數(shù)據(jù)進行簡單的計算（表7），可以確定理論的最優(yōu)水平組合為A1B2C3D3，即含200 mg/kg鐵的Fe2（SO4）3，含 60 mg/kg 鎂的MgSO4，含 100 mg/kg 硼的Na2B4O7及含400 mg/kg鈣的CaSO4，這4種土壤添加劑能夠有效抑制土壤中青枯菌的生長，其中極差值最大的是Na2B4O7，即此組合中對青枯菌抑制作用的主要因子是Na2B4O7，其次是MgSO4，最后是CaSO4。本試驗結(jié)果表明，當(dāng)土壤中的鈣、鎂、鐵、硼元素達到一定量時，對青枯菌的生長有顯著的抑制作用。可嘗試通過添加這些元素，并控制添加一定的量，作為土壤添加劑或復(fù)合肥施用于農(nóng)田，從而達到抑制土壤中青枯菌生長的目的，具體的施用量還須進一步研究。表7礦質(zhì)元素抑菌效果L9（34）正交試驗結(jié)果

2.5復(fù)合礦質(zhì)元素組合對番茄青枯病發(fā)病的影響

由圖2可以看出，隨著栽培時間的延長，添加礦質(zhì)元素可以延緩番茄植株青枯病的發(fā)生，降低青枯病的發(fā)病率?？梢姡寥乐袕?fù)合礦質(zhì)元素的添加對番茄青枯病的發(fā)生有一定的防效。

3結(jié)論與討論

青枯病是一種土傳植物病害，目前尚無有效的防治方法，雖然一些化學(xué)藥劑有一定的抑制作用，但長期大量施用帶來的問題越來越嚴重[12]，因此探索綠色環(huán)保的控制方法具有重

要意義。礦質(zhì)營養(yǎng)元素不僅是植物正常生長的必需元素，同時一些研究表明，提高植物組織中某些礦質(zhì)元素的含量可以增強植物對一些病害的抵抗力[2，13-15]。已有研究結(jié)果表明，礦質(zhì)元素減緩植物病害發(fā)生可能是通過提高植物對病原菌的抗性，或是礦質(zhì)元素直接抑制病原菌生長[14，16-17]。然而目前尚無鎂、鐵抑制青枯病菌生長的研究報道，也沒有硼、鈣、鎂、鐵復(fù)合施用抑制青枯菌生長及對青枯病發(fā)生影響的研究報道。endprint

本試驗系統(tǒng)研究了礦質(zhì)元素硼、鈣、鎂、鐵對番茄青枯菌生長及致病力的影響。研究結(jié)果表明，隨著硼濃度的增大，硼對青枯菌生長的抑制作用逐漸增強，當(dāng)硼含量大于20 mg/kg時，對青枯菌生長的抑制率達到 12.97%，這與吳衛(wèi)玲的研究結(jié)果[18]一致：0.5 mmol/L硼酸鈉對青枯病菌生長抑制率達18.32%。同時，硼可以顯著降低青枯菌胞內(nèi)SOD、POD、CAT的活性，表明硼破壞了青枯菌的活性氧代謝系統(tǒng)，加強青枯菌膜脂過氧化，從而抑制青枯菌生長。研究結(jié)果與黃芳等關(guān)于硼抑制灰霉病菌孢子萌發(fā)機制的結(jié)果[19]一致：0.1%硼處理可破壞灰霉病菌活性氧清除系統(tǒng)，造成活性氧大量積累，使得膜脂過氧化加強，最終影響細胞的正常生理功能。低于 400 mg/kg 鈣（硫酸鈣）對青枯菌生長有促進作用，而 600 mg/kg 鈣（硫酸鈣）能顯著抑制青枯菌的生長。李洪研究表明，5 mmol/L氯化鈣能顯著抑制青枯菌的生長，抑制率達16.92%[20]。其原因一方面可能是伴隨陰離子不同，另一方面可能是硫酸鈣的溶解性低于氯化鈣，添加在液體培養(yǎng)基中后，實際起作用的有效鈣可能會少。鎂、鐵對青枯菌生長均表現(xiàn)出一定的抑制作用，然而鈣、鎂、鐵能顯著增強青枯菌胞內(nèi)SOD、POD、CAT活性，因此這3種元素不是通過影響青枯菌細胞中酶的清除氧這一機制來影響青枯菌的生長，其作用機制還有待進一步研究。礦質(zhì)營養(yǎng)硼、鈣、鎂、鐵與番茄青枯病之間存在相互關(guān)系，摸清病原物、寄主植物與礦質(zhì)元素三者之間的關(guān)系對從營養(yǎng)調(diào)控方面著手解決茄科類植物青枯病防控問題具有重要意義。

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