趙亞男+王曉東

摘要：為研究哈密瓜細菌性果斑病病菌（Acidovorax avenae subsp. citrulli，簡稱Aac）在不同培養(yǎng)條件下形成生物膜的能力，選用微孔板體外培養(yǎng)、結(jié)晶紫染色、分光光度測定法檢測哈密瓜細菌性果斑病病菌在不同載體、培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、葡萄糖濃度、初始pH值條件下生物膜的形成能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在11種供試載體中，Aac在聚苯乙烯表面易形成穩(wěn)定、明顯的生物膜；在供試的6種培養(yǎng)基中，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（LB）形成生物膜能力最強；以LB為培養(yǎng)基、聚苯乙烯孔板為載體、初始pH值為7、培養(yǎng)溫度28 ℃、培養(yǎng)24 h、葡萄糖濃度為30.0 mmol/L時，Aac形成生物膜能力最強。結(jié)果表明，不同載體、培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、葡萄糖濃度、初始培養(yǎng)pH值均對Aac生物膜形成能力有明顯影響。研究結(jié)果能為有效阻止Aac生物膜形成、有效防治哈密瓜細菌性果斑病病菌提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：哈密瓜細菌性果斑病病菌；生物膜形成能力；培養(yǎng)條件

中圖分類號： S436.5文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）12-0073-04

瓜類細菌性果斑病由燕麥種西瓜亞種（Acidovora avenae subsp. citrulli，簡稱Aac）引起，是一種嚴(yán)重的檢疫性病害[1]。它具有發(fā)病快、危害重、防治難等特點，給哈密瓜的安全生產(chǎn)造成了嚴(yán)重威脅，目前尚未發(fā)現(xiàn)免疫的哈密瓜品種[2-3]。在生產(chǎn)中長期和大量使用銅制劑、抗生素會導(dǎo)致環(huán)境安全、病原菌耐藥性問題的產(chǎn)生[4]。在自然或人工條件下，許多細菌主要以生物膜形式存在[5]。植物生境相關(guān)細菌生物膜的形成不僅對植物健康造成嚴(yán)重影響，同時也是植物-病原物互作中具有毒性作用的致病因子[6]。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）在紫花羅勒根部形成生物膜而引起病害，使受感染植物7 d內(nèi)死亡，根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）在寄主根部形成生物膜，有利于其將毒性質(zhì)粒注入寄主體內(nèi)引起根癌病[7]。植物病原細菌柑橘潰瘍病病菌生物膜在其定殖和病害循環(huán)中起重要作用[8]。細菌生物膜（biofilm，簡稱BF）是由細菌群體感應(yīng)（quorum sensing，簡稱QS）調(diào)控產(chǎn)生的生理效應(yīng)（如生物膜、分泌毒性因子、群集運動等）之一，是通過胞外基質(zhì)（蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等）聚集附著于生物或非生物表面形成的具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的群落[9-10]。處在成熟生物膜中的細菌對抗生素的耐受性是浮游細菌的100～1 000倍，細菌形成生物膜后，可通過限制藥物滲透使藥物在生物膜內(nèi)無法達到有效抑菌濃度或影響生物膜內(nèi)pH值而影響藥物的解離度等機制，從而降低抗生素的抑菌效能，明顯增強細菌的耐藥性[11-13]。因此，抑制或影響細菌生物膜的形成，降低細菌的耐藥性，減少細菌分泌毒性因子，提升抗生素的抑菌效能，將大大提高細菌病害防治效果，同時也可緩解因濫用抗生素等農(nóng)藥引起的環(huán)境安全問題。本試驗通過測定哈密瓜細菌性果斑病病菌在體外不同培養(yǎng)條件下形成生物膜的能力，以期了解哈密瓜細菌性果斑病病菌生物膜形成的干擾因素，為有效防治哈密瓜細菌性果斑病提供新思路。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試培養(yǎng)基細菌培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯（NB）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（LB）、酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基（YPD）、金氏培養(yǎng)液（KB）、M210培養(yǎng)基。

1.1.2供試菌株供試菌株瓜類細菌性果斑病病菌菌株XJ05-1（Aac）由石河子大學(xué)植物保護系王曉東提供。Aac接種于KB培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)36 h后備用。

1.1.3主要儀器及試劑Multiskan酶標(biāo)儀（FC）、FE20 pH計、UV-1800紫外可見分光光度計、DNP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱、96孔板、12孔板、葡萄糖（分析純）。

1.2方法

1.2.1Aac菌懸液的制備挑取少量Aac劃線于KB培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)36 h后，用無菌水清洗培養(yǎng)物，制備3×108 CFU/mL（D600 nm=1.0）Aac菌懸液。

1.2.2Aac成膜的檢測對生物膜的測定參照文獻[14-15]描述的方法并略有改動。將濃度為3×108 CFU/mL（D600 nm=10）的Aac菌懸液35 μL接種于裝有100 μL培養(yǎng)基的96孔板中，每個測試樣品6次重復(fù)。28 ℃靜置培養(yǎng) 24 h 后用超純水潤洗孔板3次，加入200 μL 0.4%結(jié)晶紫染色30 min，去掉染液，潤洗直至流出液澄清，最后用200 μL純乙醇溶解，振蕩，測定D570 nm。

1.2.3Aac在不同培養(yǎng)條件下生物膜形成的測定試驗載體：取700 μL濃度為3×108 CFU/mL菌液加入含有2 mL KB培養(yǎng)液的12孔板中，分別將無菌處理后表面光滑的不銹鋼片（網(wǎng)狀不銹鋼片）、表面粗糙的不銹鋼片、玻璃片、聚苯乙烯片、鋁片、鐵片、銅片、木條、錫紙、乳膠片、陶瓷片斜插入12孔板中，28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，測試生物膜形成能力。

培養(yǎng)基：向96孔聚苯乙烯微量孔板中分別加入100 μL TSB、KB、YPD、M210、NB、LB培養(yǎng)基，再加入35 μL濃度為 3×108 CFU/mL菌液。28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，測試生物膜形成能力。

培養(yǎng)時間：向裝有100 μL LB培養(yǎng)基的96孔聚苯乙烯微量孔板中加入35 μL濃度為3×108 CFU/mL菌懸液。在 28 ℃ 條件下靜置培養(yǎng)6、8、10、12、24、36、48、60 h后，測試生物膜的形成能力。培養(yǎng)溫度：向裝有100 μL LB培養(yǎng)基的96孔聚苯乙烯微量孔板中加入35 μL濃度為3×108 CFU/mL菌懸液。分別在18、23、28、33 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，測試生物膜的形成能力。endprint

葡萄糖濃度：取35 μL濃度為3×108 CFU/mL菌液加入到含有100 μL不同濃度葡萄糖（0.0、5.6、7.0、11.1、16.7、200、30.0 mmol/L）LB培養(yǎng)基的96孔聚苯乙烯微量孔板中，28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，測試生物膜的形成能力。

初始pH值：取35 μL濃度為3×108 CFU/mL菌液加入含有100 μL pH值分別為9、8、7、6、5、4、3、2的LB培養(yǎng)基中，在96孔聚苯乙烯微量孔板中28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，測試生物膜的形成能力。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SAS 8.0軟件中的方差分析程序（ANOVA）分析上述各試驗處理間的差異顯著性。比較各處理間的差異采用Duncans新復(fù)極差法。

2結(jié)果與分析

2.1不同附著材質(zhì)對Aac形成生物膜的影響

由圖1可見，Aac在表面光滑的不銹鋼片（E）、表面粗糙的不銹鋼片（G）、玻璃片（K）、聚苯乙烯片（C）、鋁片（D）、鐵片（A）、銅片（H）、錫紙（B）、陶瓷片（J）表面可以形成生物膜，在乳膠片（F）、木條（I）上無法形成生物膜，在聚苯乙烯片上形成的生物膜明顯、厚、穩(wěn)定。

2.2培養(yǎng)基對Aac形成生物膜的影響

由圖2可得，Aac在6種培養(yǎng)基中均可形成生物膜，其中Aac在LB培養(yǎng)基中形成生物膜能力最強，D570 nm最高，顯著高于除YPD培養(yǎng)基外的其他試驗組，在NB培養(yǎng)基中形成生物膜的能力最弱。

2.3培養(yǎng)時間對Aac形成生物膜的影響

由圖3可得，Aac生物膜在形成初期，D570 nm隨著時間的延長逐漸提高，在24 h時D570 nm達到最高值，這時生物膜形成能力最強，而后隨著培養(yǎng)時間的延長，D570 nm逐漸下降，生物膜的形成能力逐漸減弱。

2.4培養(yǎng)溫度對Aac生物膜形成的影響

由圖4可得，Aac在18、23、28、33 ℃條件下均可形成生物膜，形成生物膜能力隨著溫度的升高而增強，在28 ℃時，D570 nm達到最大值，隨后溫度升高，D570 nm下降，即生物膜形成能力減弱。

2.5初始pH值對Aac生物膜形成的影響

由圖5可得，Aac在初始pH值為5、4、3、2時幾乎無法形成生物膜，D570 nm接近0；當(dāng)初始pH值為7時，檢測的D570 nm最高，生物膜形成能力最強；在初始pH值為8～9時，D570 nm逐漸降低，生物膜形成能力減弱。

2.6葡萄糖濃度對Aac形成生物膜的影響

由圖6可得，Aac在葡萄糖濃度為0時形成生物膜的能力最弱，隨著葡萄糖濃度的增加，形成生物膜的能力逐漸增強，在葡萄糖濃度為30.0 mmol/L時，D570 nm最大，形成生物膜能力最強。

3結(jié)論與討論

本試驗研究了環(huán)境因素對哈密瓜細菌性果斑病病菌生物膜形成能力的影響發(fā)現(xiàn)，成膜載體、培養(yǎng)基、時間、溫度、葡萄糖濃度、初始pH值對其成膜能力均有影響。試驗結(jié)果顯示，在11種供試載體中，Aac在聚苯乙烯片上易形成明顯、穩(wěn)定的生物膜；6種供試培養(yǎng)基中，Aac在LB培養(yǎng)基中形成生物膜的能力最強，D570 nm=2.05；以LB為培養(yǎng)基、聚苯乙烯孔板為培養(yǎng)載體，初始培養(yǎng)pH值為7、葡糖糖濃度為 30.0 mmol/L、培養(yǎng)24 h時成膜能力達到最強，所檢測的D570 nm分別為134、1.98、1.30。

不同溫度下，Aac形成生物膜的能力是不同的。18～28 ℃ 時，D570 nm隨溫度升高逐漸提高，Aac生物膜形成能力逐漸增強。彭曉云等在不同培養(yǎng)條件下對金黃色葡萄球菌生物膜生長影響試驗中發(fā)現(xiàn)，溫度與生物膜呈依賴關(guān)系，隨著溫度的升高，BF表面積增大[16]。但本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Aac培養(yǎng)溫度達到 33 ℃ 時，D570 nm減小，反而抑制了成膜能力。溫度過高，可能使細胞組分（蛋白質(zhì)、核酸等）產(chǎn)生不可逆的失活，喪失細胞功能，對生物膜的形成有一定的影響[17]。

國外學(xué)者Sutherland發(fā)現(xiàn)，只要存在能合成胞外多糖的微生物菌屬，就能形成成熟、穩(wěn)定的生物膜[18]。并且研究表明，菌體黏附后生成的水不溶性多糖也有利于促進菌體間的聚集和維持生物膜的三維結(jié)構(gòu)[19]。本試驗在檢測不同葡萄糖濃度對哈密瓜細菌性果斑病菌生物膜形成的影響中發(fā)現(xiàn)，在不含有葡萄糖的培養(yǎng)基中，Aac形成生物膜的能力最低；隨著葡萄糖濃度的增加，Aac形成生物膜的能力逐漸增強。葡萄糖濃度的增加促進了菌體間的相互黏附、聚集，增強了成膜能力。同時，楊虹等發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖對鮑氏不動桿菌生物膜的形成能力、厚度有很強的促進作用[20]。

在進行不同初始pH值對Aac生物膜形成的影響試驗中發(fā)現(xiàn)，Aac在初始pH值低于6的環(huán)境里靜置培養(yǎng)，成膜能力幾乎喪失。初始pH值為7時，形成生物膜的能力最強，初始pH值為8～9時，Aac具有成膜能力，但逐漸減弱。劉文竹等研究發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌在pH值低于6的環(huán)境里，幾乎無法形成生物膜，成膜能力受到明顯抑制[21]。同時姜穎等研究也說明，低pH值條件下，培養(yǎng)的變形鏈球菌黏附力較弱，影響生物膜的形成[22]。細菌的群體感應(yīng)是細菌通過分泌可溶性信號分子來檢測群體密度并協(xié)調(diào)細菌生物功能的信息交流機制，為功能性生物膜的形成提供了保證。革蘭氏陰性菌的QS系統(tǒng)主要由信號分子N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（N-acyl-homoserine lactones，簡稱AHLs）、AHLs合成酶LuxⅠ族蛋白、AHLs受體LuxR族蛋白組成[23]。作為QS系統(tǒng)中的關(guān)鍵因子，AHLs可以調(diào)控細菌的生物膜形成、群游現(xiàn)象、抗生素的合成等多種生理生化功能[24]。關(guān)于偏酸性的環(huán)境是否對Aac的群體感應(yīng)系統(tǒng)存在影響，這將是后續(xù)試驗的重點。

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