郭詠梅 張博綦 閆素梅 史彬林 郭曉宇

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

硒對脂多糖誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

郭詠梅 張博綦 閆素梅*史彬林 郭曉宇

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

本試驗旨在研究硒(Se)對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMEC)氧化損傷的保護(hù)作用及其機制。將貼壁生長的第3代BMEC隨機分為8組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)1個培養(yǎng)孔。對照(CON)組采用基礎(chǔ)培養(yǎng)液，不添加Se和LPS，培養(yǎng)30 h；LPS組和6個Se保護(hù)組在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中分別添加不同水平的Se(0、10、20、50、100、150和200 nmol/L)，培養(yǎng)24 h后，加入1 μg/mL LPS作為外源刺激作用6 h。結(jié)果表明：1)與CON組相比，LPS組BMEC的相對增殖率顯著下降(P<0.05)，谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、硫氧還蛋白還原酶(TrxR)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性和總抗氧化能力(T-AOC)均顯著下降(P<0.05)，GPx1和TrxR1的基因和蛋白表達(dá)量、硒蛋白P(SelP)含量也顯著下調(diào)(P<0.05)；而LPS組的一氧化氮(NO)含量，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活性及其基因和蛋白表達(dá)量，炎癥因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)和白介素-6(IL-6)含量及其基因表達(dá)量，活性氧(ROS)活性，丙二醛(MDA)含量均顯著升高(P<0.05)，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路相關(guān)因子p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、c-Jun氨基端激酶(JNK)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)的基因表達(dá)量呈相似變化。2)與LPS組相比，Se保護(hù)組隨Se添加水平的增加，相對增殖率,T-SOD、CAT、GPx、TrxR活性，T-AOC，GPx1、TrxR1基因和蛋白表達(dá)量均呈先升高后下降趨勢；而NO含量，iNOS活性及其基因和蛋白表達(dá)量，炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6含量及其基因表達(dá)量，MAPK信號通路相關(guān)因子ERK1/2、JNK、p38MAPK的基因表達(dá)量，ROS活性，MDA含量呈先降低后升高的趨勢;以20～100 nmol/L Se保護(hù)效果較好，綜合來看50 nmol/L Se保護(hù)效果最好。結(jié)果提示，Se可提高BMEC的抗氧化功能，對LPS引起的細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用，其機制是Se增強TrxR活性從而抑制MAPK信號通路的激活，最終減少NO的大量釋放，但過高水平的Se會對細(xì)胞造成損傷。培養(yǎng)液中20～100 nmol/L Se的保護(hù)作用較好，尤其以50 nmol/L Se效果最好。

硒代蛋氨酸；脂多糖；奶牛乳腺上皮細(xì)胞；氧化損傷；保護(hù)作用

奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cell,BMEC)是乳成分合成與分泌的重要場所，其生物合成能力決定了奶牛乳腺的產(chǎn)奶潛力[1]。泌乳期的BMEC由于高代謝率引起的大量氧自由基蓄積，這是誘發(fā)細(xì)胞氧化損傷及抗氧化機能降低進(jìn)而引起乳房炎等代謝性疾病和乳品質(zhì)降低的重要原因之一[2]。微量元素硒(Se)主要通過合成硒蛋白發(fā)揮其生物學(xué)功能，對奶牛的抗氧化功能和免疫功能具有顯著促進(jìn)效果[3]。一些研究也指出，在Se推薦需要量的基礎(chǔ)上，適當(dāng)提高飼糧Se水平可進(jìn)一步提高抗氧化功能[4]，但關(guān)于其影響機制尚不完全清楚。因此，深入研究Se對乳腺氧化應(yīng)激損傷的緩解作用及其機理，為在生產(chǎn)中科學(xué)補加Se、保證奶牛乳腺健康和改善乳品質(zhì)具有重要的理論與實際意義。

一氧化氮(NO)是由誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)催化L-精氨酸經(jīng)多步氧化還原反應(yīng)生成的氣體信號分子。研究證實，NO具有雙向調(diào)節(jié)功能。一方面，適量的NO參與機體多種生理活動，并且具有抗菌及抗腫瘤作用，保護(hù)動物免受外界環(huán)境的感染[5];另一方面，過量的NO還會導(dǎo)致活性氮的產(chǎn)生、細(xì)胞信號通路的阻斷，誘導(dǎo)機體發(fā)生氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)[6]。一些研究指出，硒代蛋氨酸可下調(diào)鼠軟骨細(xì)胞中可誘導(dǎo)iNOS和環(huán)氧合酶-2產(chǎn)生的白介素-1β(IL-1β)基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制NO和前列腺素E2的大量產(chǎn)生[7]。Ferret等[8]的研究指出，硫氧還蛋白(thioredoxin,Trx)體系可保護(hù)人單核巨噬細(xì)胞免受NO引起的損傷，細(xì)胞對NO損傷作用的易感性與硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase,TrxR)和Trx的基因表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。Obata等[9]指出p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)信號通路的激活能促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)等多種細(xì)胞因子的基因表達(dá)；引起細(xì)胞內(nèi)iNOS基因的表達(dá)量增加，產(chǎn)生大量NO。細(xì)胞凋亡信號激酶-1(apoptosis signal-regulating kinase-1,ASK-1)是MAPK信號通路的上游激動劑，還原型Trx轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸问綍r，ASK-1被激活，從而激活MAPK信號通路[10]。體內(nèi)和體外研究結(jié)果得出，Se可以增加奶牛血液和BMEC的TrxR活性，改善其抗氧化功能，減緩氧化損傷[3,11]。這些研究提示，Se對BMEC氧化損傷的保護(hù)作用機制可能通過增強硒蛋白TrxR活性調(diào)節(jié)MAPK信號通路來影響細(xì)胞因子白介素(IL)的產(chǎn)生，進(jìn)而調(diào)節(jié)NO的生成，但相關(guān)研究甚少，確切機理需要進(jìn)一步探討。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘發(fā)的奶牛乳腺炎模型被國際公認(rèn)是研究乳房炎的主要病理模型[12]。本課題組利用LPS為應(yīng)激源，誘導(dǎo)BMEC產(chǎn)生大量的NO，已成功建立了細(xì)胞的氧化應(yīng)激模型[13]。鑒此，本試驗以LPS誘導(dǎo)BMEC氧化應(yīng)激，主要從TrxR活性和MAPK信號通路與NO的關(guān)系的角度，研究不同水平Se對細(xì)胞損傷的預(yù)保護(hù)作用及其可能機理，為提高奶牛乳腺組織抗氧化功能、科學(xué)補加Se和保障乳腺健康提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1BMEC的培養(yǎng)

BMEC采用膠原酶消化法獲得。于內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市北亞清真冷庫挑選3頭健康的奶牛，采集乳腺組織，剪去外層組織，取數(shù)塊深層組織依次經(jīng)含有3×雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍、75%酒精清洗1遍、含有1×雙抗的PBS清洗3遍。在深層剪取約1 mm3大小的組織塊于5 mL離心管中，充分剪碎后加入等體積的0.5%膠原酶Ⅱ，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱(HF240,HealFORS,37 ℃和5% CO2)中消化1 h。將消化液用80目的細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，收集濾液于15 mL的離心管中,離心后棄上清。所得沉淀用PBS重新懸浮離心，棄去上清，所得沉淀用培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞后接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待原代細(xì)胞的貼壁率達(dá)到80%～90%時，進(jìn)行細(xì)胞純化及傳代。將分離純化后的BMEC經(jīng)熒光免疫細(xì)胞染色法鑒定后，連續(xù)培養(yǎng)到第3代，將其分別接種于試驗設(shè)計要求的細(xì)胞培養(yǎng)器皿中，加入完全培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞貼壁率達(dá)到80%～90%時，棄去舊培養(yǎng)液，加入新的不含胎牛血清的培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24 h之后，按照試驗設(shè)計進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.2試驗設(shè)計

LPS(L4391)和硒代蛋氨酸(Se源,純度≥98%,S3132)均購自Sigma公司。

以LPS誘導(dǎo)BMEC氧化損傷，建立氧化損傷模型，LPS作用時間及作用濃度參照高瑞峰[12]的研究結(jié)果確定。將貼壁生長的第3代BMEC隨機分為8組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)1個培養(yǎng)孔。對照(CON)組采用基礎(chǔ)培養(yǎng)液，不添加Se和LPS，培養(yǎng)30 h；LPS組利用基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，加入1 μg/mL的LPS作用6 h；不同水平Se保護(hù)組分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加10(LSe10組)、20(LSe20組)、50(LSe50組)、100(LSe100組)、150(LSe150組)及200 nmol/L的Se(LSe200組)，培養(yǎng)24 h后，加入1 μg/mL的LPS作用6 h?；A(chǔ)培養(yǎng)液中蛋氨酸的濃度為115 588.99 nmol/L，因此硒代蛋氨酸的補加對基礎(chǔ)培養(yǎng)液蛋氨酸濃度的影響很小。

1.3測定指標(biāo)與方法

1.3.1 相對增殖率

BMEC相對增殖率采用噻唑藍(lán)(MTT)法測定。將第3代BMEC懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，按照試驗設(shè)計培養(yǎng)，向各培養(yǎng)孔中加入20 μL的MTT(5 mg/mL)，培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，甩板并拍干液體，再向每孔加入100 μL二甲基亞砜，使用全自動酶標(biāo)儀(Synergy 4,BioTek)振蕩10 min后，檢測各孔490 nm吸光度值(OD490 nm)。

相對增殖率(%)=(試驗組OD490 nm/CON組OD490 nm)×100。

1.3.2 抗氧化功能及炎癥因子

將第3代BMEC懸液接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，按照設(shè)計要求培養(yǎng)30 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液于1.5 mL Eppendorf管中15 455×g離心10 min，收集上清液用于抗氧化功能、炎癥因子含量的測定?？偪寡趸芰?T-AOC)采用鉬酸銨顯色法測定，總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用比色法測定，iNOS活性及硒蛋白P(SelP)、NO、IL-1、IL-6、TNF-α的含量均采用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，試劑盒購自美國R&D公司。

將上述棄去細(xì)胞培養(yǎng)液后的細(xì)胞培養(yǎng)皿置于冰上，加入1 mL PBS清洗2遍，加入1 mL動物細(xì)胞裂解液于冰上裂解30 min，用細(xì)胞刮板刮取貼壁細(xì)胞，收集于1.5 mL Eppendorf離心管中，4 ℃、15 455×g離心10 min，收集上清液用于細(xì)胞內(nèi)的抗氧化功能的測定。其中，谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性采用二硫代二硝基苯甲酸法測定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定，操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行，試劑盒購自南京建成生物研究所?；钚匝?ROS)及TrxR活性均采用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，試劑盒購自美國R&D公司。細(xì)胞內(nèi)的GPx活性、MDA含量換算為總蛋白質(zhì)基礎(chǔ)，總蛋白質(zhì)含量采用二喹啉甲酸(BCA)法測定，試劑盒購自北京碧云天公司。

1.3.3 細(xì)胞內(nèi)基因的相對表達(dá)量

以β-肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)標(biāo)基因，采用實時熒光定量PCR技術(shù)測定細(xì)胞中GPx1、GPx4、SelP、TrxR1、iNOS、IL-1、IL-6、TNF-α、p38MAPK、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N terminal kinase,JNK)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinas 1/2,ERK1/2)的基因表達(dá)量。

1.3.4 細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)量

以β-actin作為內(nèi)參蛋白，采用Western Blot法測定BMEC內(nèi)GPx1、TrxR1和iNOS的蛋白表達(dá)量，每個處理3個重復(fù)。主要操作步驟：將30 μg蛋白樣品與5×上樣緩沖液以4∶1的體積比混合，于干煮儀變性5 min后，用上樣針將樣品加到點樣孔內(nèi)。蛋白樣品分別依次經(jīng)濃縮膠(80 V、30 min)、分離膠(120 V、90 min)電泳分離，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(100 V、50 min)。轉(zhuǎn)膜完成后，用Tris緩沖液(TBST)洗滌膜3次，每次5 min，室溫封閉1 h，然后用TBST洗滌膜1次，每次5 min。將膜分別在4 ℃條件下過夜進(jìn)行一抗[兔抗β-actin多克隆抗體(20536-1-AP,Proteintech,1∶2 000稀釋)、兔抗GPx1多克隆抗體(ab22604,Abcam,1∶1 000稀釋)、兔抗TrxR1多克隆抗體(ab16840,Abcam,1∶500稀釋)和兔抗iNOS多克隆抗體(NBP1-97471,Novus Biological,1∶1 000稀釋)孵育，次日進(jìn)行二抗孵育，與辣根過氧化物酶(HPR)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(04-15-06,KPL,1∶1 000稀釋)室溫孵育1 h。用ECL超敏發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，并在凝膠成像儀(ImageQuant RT ECL,GE)上照相。用ImageJ軟件對圖像進(jìn)行灰度值分析，并計算目的蛋白表達(dá)量，計算公式如下：

目的蛋白表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.4試驗數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)采用SAS 9.0統(tǒng)計軟件中的方差分析(ANOVA)程序進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示差異趨于顯著。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞形態(tài)、相對增殖率、抗氧化功能及炎癥因子含量

如表1及圖1所示，與CON組相比，LPS組的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了改變，細(xì)胞界限不清，細(xì)胞形態(tài)明顯固縮，相對增殖率顯著下降(P<0.05)，較CON組降低23.57%；抗氧化指標(biāo)T-SOD、CAT、GPx、TrxR活性，T-AOC，SelP含量均顯著降低(P<0.05)，而ROS和iNOS活性，NO、MDA及炎癥因子TNF-α、IL-1和IL-6含量呈相反變化規(guī)律，顯著升高(P<0.05)。

與LPS組相比，Se保護(hù)組中的LSe20、LSe50、LSe100和LSe150組的細(xì)胞形態(tài)固縮情況有所緩解，相對增殖率顯著升高(P<0.05)，LSe50組為Se保護(hù)組中最高，且顯著高于其他各試驗組(P<0.05)，LSe10、LSe200組無顯著變化(P>0.05)；LSe20、LSe50、LSe100組的T-AOC、CAT和TrxR活性均顯著高于LPS組(P<0.05)，且LSe50組為Se保護(hù)組中最高，但LSe10、LSe150、LSe200組與LPS組無顯著差異(P>0.05)。LSe50、LSe100、LSe150組的GPx活性顯著高于LPS組(P<0.05)，以LSe100組為Se保護(hù)組中最高；但LSe10、LSe20、LSe200組與LPS組無顯著差異(P>0.05)。所有的Se保護(hù)組T-SOD活性均高于LPS組，以LSe50組為Se保護(hù)組中最高。LSe50組的SelP活性顯著高于LPS組(P<0.05)，其余各Se保護(hù)組均與LPS組差異不顯著(P>0.05)。所有Se保護(hù)組的MDA含量及ROS活性均顯著低于LPS組(P<0.05)，且以LSe50組最低；NO含量與iNOS活性也呈相似變化規(guī)律，但NO含量以LSe100組最低，iNOS活性以LSe50組最低，LSe200組的NO含量與iNOS活性均與LPS組無顯著差異(P<0.05)。LSe50、LSe100組TNF-α及IL-1含量及LSe20、LSe50組的IL-6含量均顯著低于LPS組(P<0.05)，其他Se保護(hù)組與LPS組均無顯著差異(P>0.05)。

圖1 Se對LPS誘導(dǎo)氧化損傷的BMEC形態(tài)的影響

2.2抗氧化酶和炎癥因子的基因和蛋白表達(dá)量

如表2和圖2所示，與CON組相比，LPS組的GPx1和TrxR1基因和蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，而iNOS基因和蛋白表達(dá)量、炎癥因子(TNF-α、IL-1和IL-6)及MAPK信號通路相關(guān)因子(p38MAPK、JNK、ERK1/2)基因表達(dá)量呈相反變化規(guī)律，均顯著升高(P<0.05)。

與LPS組相比，LSe20、LSe50、LSe100組的GPx1和TrxR1基因表達(dá)量，LSe50、LSe100、LSe150、LSe200組的SelP基因表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)，LSe50組的TrxR1、SelP基因表達(dá)量為Se保護(hù)組中最高。Se保護(hù)組GPx1和TrxR1的蛋白表達(dá)量均顯著高于LPS組(P<0.05)，最高值也出現(xiàn)在LSe50組。與LPS組相比，LSe20、LSe50、LSe100組的IL-1基因表達(dá)量及iNOS基因和蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，LSe50組為Se保護(hù)組中最低，LSe200組IL-1和iNOS基因表達(dá)量反而顯著升高(P<0.05)。所有Se保護(hù)組的TNF-α基因表達(dá)量均顯著低于LPS組(P<0.05)，LSe50組Se保護(hù)組中最低。MAPK信號通路相關(guān)的基因表達(dá)量與上述炎癥因子呈現(xiàn)相似的變化趨勢，與LPS組相比，p38MAPK(LSe20、LSe50、LSe100、LSe150組)與ERK1/2(LSe20、LSe50、LSe100組)的基因表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，且以LSe50組為Se保護(hù)組中最低。所有Se保護(hù)組的JNK基因表達(dá)量均顯著低于LPS組(P<0.05)，以LSe100組為其組中最低。

表1 Se對LPS誘導(dǎo)氧化損傷的BMEC相對增殖率、抗氧化功能及炎癥因子含量的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Values in the same row with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表2 Se對LPS誘導(dǎo)氧化損傷的BMEC抗氧化酶和炎癥因子基因及蛋白表達(dá)量的影響

續(xù)表2項目Items組別GroupsCONLPSLSe10LSe20LSe50LSe100LSe150LSe200SEMP值P-value基因表達(dá)量Geneexpressions谷胱甘肽過氧化物酶4GPx41.001.211.291.491.481.331.461.240.120.1393硫氧還蛋白還原酶1TrxR11.00a0.23f0.38cde0.40cd0.71b0.47c0.34def0.27ef0.03<0.0001硒蛋白PSelP1.00de0.59e0.93de1.37cde3.57a2.92ab2.57abc2.13bcd0.35<0.0001白介素-1IL-11.00f14.12b13.65b10.09cd6.57e7.78de12.69bc17.31a0.90<0.0001白介素-6IL-61.00c2.15a2.04a2.08a1.16bc1.96ab2.22a2.43a0.250.0059腫瘤壞死因子-αTNF-α1.00e19.16a13.18bc11.06c7.33d12.34bc13.03bc15.06b0.78<0.0001誘導(dǎo)型一氧化氮合酶iNOS1.00f2.33b2.02bc1.71cd1.20ef1.49de2.06bc2.94a0.12<0.0001p38絲裂原活化蛋白激酶p38MAPK1.00a1.89b1.49ab1.35a1.08a1.23a1.21a1.49ab0.150.0146c-Jun氨基端激酶JNK1.00d3.57a2.14b1.84bc1.48bcd1.05d1.21cd1.83bc0.23<0.0001細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2ERK1/21.00d2.34a1.76abc1.35cd1.19cd1.56bcd2.10ab2.32a0.180.0002蛋白表達(dá)量Proteinexpressions硫氧還蛋白還原酶1TrxR10.904c0.444f0.750d0.901c1.031a0.954b0.912c0.718e0.008<0.0001谷胱甘肽過氧化物酶1GPx10.618b0.356d0.439c0.622b0.907a0.622b0.593b0.407c0.013<0.0001誘導(dǎo)型一氧化氮合酶iNOS0.787cd0.936a0.928a0.810c0.682e0.768d0.848b0.928a0.008<0.0001

1：CON組 CON group；2：LPS組 LPS group；3：LSe10組 LSe10 group；4：LSe20組 LSe20 group；5：LSe50組 LSe50 group；6；LSe100組 LSe100 group；7：LSe150組 LSe150 group；8：LSe200組 LSe200 group。

圖2Se對LPS誘導(dǎo)氧化損傷的BMEC抗氧化酶蛋白表達(dá)量的影響

Fig.2 Effects of of Se on expressions of proteins of antioxidant enzymes in BMEC oxidative damaged by LPS

3 討 論

3.1LPS誘導(dǎo)BMEC引起的氧化損傷

細(xì)胞相對增殖率、抗氧化酶活性及炎癥因子含量是反映細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的主要指標(biāo)。正常情況下，體內(nèi)的抗氧化酶會清除多余的自由基，使其維持在生理水平，參與機體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]。但當(dāng)細(xì)胞遭受LPS等外源性刺激時，會產(chǎn)生大量的自由基并集聚[15]；自由基的過量產(chǎn)生會直接損傷DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，啟動炎癥介質(zhì)產(chǎn)生[16]。本試驗用LPS誘導(dǎo)細(xì)胞后，與CON組相比，LPS組的相對增殖率降低了23.57%，T-SOD、GPx、TrxR、CAT等抗氧化酶活性顯著下降，而炎癥因子TNF-α、IL-1和IL-6的含量及其基因表達(dá)量，MDA含量，自由基ROS活性，NO含量，iNOS活性及其基因和蛋白的表達(dá)量顯著升高，說明LPS誘導(dǎo)BMEC發(fā)生了氧化損傷。研究報道，LPS經(jīng)Toll樣受體4受體蛋白識別將信號傳入胞漿，引起MAPK信號通路的激活，而p38通路活化可使細(xì)胞內(nèi)iNOS基因的表達(dá)量增加，產(chǎn)生大量NO，過高含量的NO導(dǎo)致活性氮的產(chǎn)生、細(xì)胞信號通路的阻斷及全身性不可控制的炎癥發(fā)生，從而造成機體組織損傷[17]。MAPK信號通路的激活能誘導(dǎo)NF-κB通路活化，活化的NF-κB促使炎癥因子的大量生產(chǎn)，進(jìn)而引起NO的大量釋放，NO的過量釋放反過來又誘導(dǎo)ERK1/2、p38MAPK和JNK活化并刺激NF-κB的進(jìn)一步活化，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，造成機體損傷[18-19]?？梢?，LPS對細(xì)胞誘導(dǎo)的氧化損傷是通過MAPK信號通路的激活引起炎癥因子的產(chǎn)生，進(jìn)而誘導(dǎo)iNOS基因的過度表達(dá)和NO的過量產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS組的細(xì)胞炎癥因子含量及其相關(guān)基因和蛋白表達(dá)量增加的同時，MAPK信號通路被激活，相關(guān)因子p38MAPK、JNK及ERK1/2的基因表達(dá)量顯著升高，進(jìn)一步驗證了LPS對BMEC誘導(dǎo)的氧化損傷與其NO的過量產(chǎn)生有關(guān)。

3.2Se對LPS誘導(dǎo)的氧化損傷的保護(hù)作用及其機制

本研究結(jié)果顯示，與LPS組相比，Se保護(hù)組降低了TrxR、GPx等抗氧化酶活性，TrxR1、GPx1基因和蛋白的表達(dá)量，降低了MDA含量、ROS活性、NO含量、iNOS的基因和蛋白表達(dá)量，并下調(diào)了炎癥因子的含量及基因表達(dá)量，說明Se可以提高細(xì)胞的抗氧化功能，對LPS誘導(dǎo)引起的BMEC氧化損傷具有保護(hù)效果。Se作為體內(nèi)抗氧化酶如TrxR、GPx的組成成分，通過清除體內(nèi)的自由基而發(fā)揮抗氧化性損傷的作用，可防止生物大分子發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。因此Se對BMEC氧化損傷的保護(hù)機制與硒蛋白活性的增強有關(guān)。過量NO的產(chǎn)生是引起細(xì)胞產(chǎn)生損傷的主要原因之一。Zhao等[20]的研究指出，Se的缺乏引起雛雞的胰腺組織中TrxR的基因表達(dá)量顯著降低，iNOS的基因表達(dá)量及NO含量顯著升高。研究發(fā)現(xiàn)，促炎癥因子IL-1β可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的iNOS活性升高和其基因及蛋白表達(dá)量增加，進(jìn)而促進(jìn)NO的大量合成，導(dǎo)致炎癥加重[21]。小鼠巨噬細(xì)胞的相關(guān)研究結(jié)果指出，Se是通過降低炎癥因子的基因及蛋白表達(dá)量[22]，減少了炎癥因子的釋放，實現(xiàn)了其對細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，提高了細(xì)胞的抗氧化及抑炎功能。本研究以BMEC為對象的研究得出了類似的結(jié)果，Se保護(hù)組降低了炎癥因子TNF-α、IL-1和IL-6含量及其基因表達(dá)量，結(jié)合抗氧化功能、自由基含量和細(xì)胞活性的變化結(jié)果說明，Se對BMEC氧化損傷的保護(hù)作用與其降低了炎癥因子的基因和蛋白表達(dá)量，引起iNOS的活性降低，進(jìn)而減少了NO的大量生成有關(guān)。

在炎癥反應(yīng)中，細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α基因表達(dá)量增加與信號通路MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的增強有關(guān)，Se可能通過調(diào)節(jié)硒蛋白的表達(dá)抑制MAPK等信號途徑參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控，下調(diào)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)并促進(jìn)重建免疫穩(wěn)態(tài)而使機體恢復(fù)健康[23]。MAPK家族包括p38MAPK、JNK和ERK，它們分別可被上游相應(yīng)的激酶活化，其中ASK-1是MAPK家族的重要成員，是MAPK信號通路的上游激動劑，還原型Trx結(jié)合在ASK-1的N端區(qū)域，起抑制其活性的作用，當(dāng)Trx由于TrxR活性降低轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸问綍r，ASK-1被激活，從而激活MAPK信號通路中的JNK和p38MAPK[10]。巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)研究表明，LPS可誘導(dǎo)MAPK信號通路的活化，增加ROS和NO的產(chǎn)生，而加Se顯著降低了LPS誘導(dǎo)的H2O2的生成以及p38的活化[21]，降低了NO等促炎因子的產(chǎn)生[24]。柳晨[24]利用轉(zhuǎn)染Trx基因的小鼠神經(jīng)嵴母瘤細(xì)胞建立了NO毒性模型，研究了Trx基因的表達(dá)與NO的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)Trx可以保護(hù)小鼠神經(jīng)嵴母瘤細(xì)胞免受NO誘導(dǎo)的損傷，其原因可能是Trx的S-亞基能綁定NO，減少NO含量，清除氧自由基，提高細(xì)胞抗氧化水平[25]。本課題組的前期研究指出，Se的補加可顯著增強奶牛血液中的TrxR活性，促進(jìn)奶牛的抗氧化功能[3]。本研究結(jié)果得出，Se保護(hù)組的TrxR活性及TrxR1基因和蛋白表達(dá)量上調(diào)，而MAPK信號通路相關(guān)因子的基因表達(dá)量下調(diào)，提示BMEC受到LPS損傷后，Se可能是通過上調(diào)硒蛋白TrxR1的基因和蛋白表達(dá)量，增加了TrxR活性，抑制了MAPK信號通路的活化，進(jìn)而通過抑制IL-1的產(chǎn)生，降低iNOS活性，減少NO的釋放，從而對BMEC氧化損傷起到保護(hù)作用。然而，本研究并未對TrxR1基因行沉默和過表達(dá)，需要進(jìn)一步驗證。

適宜水平的Se可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，增強抗氧化功能及免疫功能[11]；而高水平的Se則抑制細(xì)胞增殖，并且減弱機體抗氧化功能及免疫功能，甚至導(dǎo)致機體病理性損傷[26]。本研究也得出Se對BMEC氧化應(yīng)激的保護(hù)作用與其水平有關(guān)，10 nmol/L的Se對BMEC無顯著保護(hù)作用，20～100 nmol/L的Se保護(hù)作用較好，尤其50 nmol/LSe的保護(hù)效果最好。然而，隨著Se水平進(jìn)一步增加，保護(hù)作用逐漸減弱，尤其是200 nmol/L的Se不僅沒有保護(hù)效果，反而引起細(xì)胞發(fā)生損傷。這可能是由于Se能代替含硫化合物中的硫原子，對多種酶和含硫氨基酸有抑制作用，同時抑制體內(nèi)的抗氧化過程而產(chǎn)生毒害[27]。Se的毒性也可能是正常金屬元素和微量元素紊亂導(dǎo)致的結(jié)果。這種紊亂反過來又可能影響生物體內(nèi)代謝途徑和級聯(lián)反應(yīng)，并伴隨著炎癥反應(yīng)的發(fā)生，最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激[28]。雖然Se對機體有保護(hù)作用，但其毒性范圍較小，毒性劑量大概在營養(yǎng)需要的3～5倍[29]。因此，合理控制Se的添加水平是Se發(fā)揮抗氧化及抑炎作用的前提。

4 結(jié) 論

① Se可提高BMEC的抗氧化功能，對LPS引起的細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用，其機制是Se增強TrxR活性從而抑制MAPK信號通路的激活，最終減少NO的大量釋放，但過高水平的Se會對細(xì)胞造成損傷。

② 培養(yǎng)液中20～100 nmol/L Se的保護(hù)作用較好，尤其以50 nmol/L Se效果最好。

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*Corresponding author, professor, E-mail: yansmimau@163.com

(責(zé)任編輯 王智航)

Protective Effects of Selenium on Bovine Mammary Epithelial Cells Oxidative Damaged by Lipopolysaccharide

GUO Yongmei ZHANG Boqi YAN Sumei*SHI Binlin GUO Xiaoyu

(College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

This experiment was conducted to investigate the protective effects of selenium (Se) on bovine mammary epithelial cells (BMECs) oxidative damaged by lipopolysaccharide (LPS) and the mechanism. The third-generation attachment cultured BMECs were randomly divided into 8 groups with 6 replicates per group and 1 culture pore per replicate. BMECs in control (CON) group were cultured in a basal medium without Se and LPS for 30 h. BMECs in LPS group and Se protection groups were exposed in Se with different concentrations (0, 10, 20, 50, 100, 150 and 200 nmol/L) for 24 h, and then treated with LPS (1 μg/mL) for 6 h. The results showed as follows: 1) compared with CON group, the relative proliferation rate in LPS group was significantly decreased (P<0.05), the activities of glutathione peroxidase (GPx), thioredoxin reductase (TrxR), superoxide dismutase (T-SOD) and catalase (CAT), and total antioxidant capacity (T-AOC) in LPS group were significantly decreased (P<0.05), and expressions of genes and proteins ofGPx1 andTrxR1 and selenoprotein P (SelP) content in LPS group was significantly decreased (P<0.05); however, nitric oxide (NO) content, activity, gene and protein expressions of inducible nitric oxide synthase (iNOS), contents and gene expressions of inflammatory factors [tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin-1 (IL-1) and interleukin-6 (IL-6)], active oxygen (ROS) activity, and malondialdehyde (MDA) content in LPS group were significantly increased (P<0.05), and gene expressions of factors related to the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway [p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK), c-Jun N terminal kinase (JNK) and extracellular signal-regulated kinas 1/2 (ERK1/2)] in LPS group showed the same tendency. 2) Compared with LPS group, with the increase of Se supplemental level in Se protection groups, relative proliferation rate, activities of T-SOD, CAT, GPx and TrxR, T-AOC, gene and protein expressions ofGPx1 andTrxR1 were increased first and then decreased; while NO content, activity, gene and protein expressions of iNOS, contents and gene expressions of inflammatory factors (TNF-α,IL-1 andIL-6), gene expressions of factors related to MAPK signal pathway [ERK1/2,JNKandp38MAPK], ROS activity, and MDA content showed the opposite trend; Se at 20 to 100nmol/L showed better protection effects, and in general Se at 50nmol/L showed the best protection effects. The results indicate that Se improves the antioxidant function of BMECs, and protects cells from oxidative damage induced by LPS mainly by increasing TrxR activity, inhibiting the activation of MAPK signaling pathway, and then decreasing NO content, however, high level of Se can cause damage to cells. Se at 20 to 100 nmol/L in culture medium has a better protection effect, and Se at 50 nmol/L has the best effect.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(9)：3375-3384]

selenomethionine; lipopolysaccharide; bovine mammary epithelial cell; oxidative damage; protective effect

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.09.043

2017-02-27

國家自然科學(xué)基金(31560650)

郭詠梅(1989—)，女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，博士研究生，從事動物礦物質(zhì)與維生素營養(yǎng)的研究。E-mail： ymguo2015@163.com

*通信作者：閆素梅，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： yansmimau@163.com

S823

：A

：1006-267X(2017)09-3375-10