陳 璐 趙艷麗 郭曉宇 史彬林 閆素梅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

賴(lài)氨酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)乳脂肪合成相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響

陳 璐 趙艷麗 郭曉宇 史彬林 閆素梅*

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

本試驗(yàn)旨在研究賴(lài)氨酸(Lys)對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)內(nèi)乳脂肪合成相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響，探討Lys影響乳脂肪合成的機(jī)理。將第3代BMECs隨機(jī)分為6組，每組6個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)1個(gè)培養(yǎng)孔。各組培養(yǎng)基中Lys的濃度分別為0.5(基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對(duì)照)、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0 mmol/L，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h后測(cè)定BMECs甘油三酯(TAG)含量、乳脂肪合成相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)量。結(jié)果表明：BMECs內(nèi)TAG含量(P=0.013)以及脂肪酸結(jié)合蛋白3(FABP3，P=0.001)、脂蛋白脂酶(LPL，P=0.096)、脂肪酸合成酶(FASN，P=0.003)、乙酰甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶6(AGPAT6，P=0.038)和甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶(GPAM，P=0.022)基因表達(dá)量對(duì)Lys呈顯著或趨于顯著的濃度依賴(lài)效應(yīng)。FABP3基因表達(dá)量以2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L組和LPL基因表達(dá)量以1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L組顯著高于0.5 mmol/L組(P<0.05)；FASN基因表達(dá)量以2.0 mmol/L組最高，顯著高于16.0 mmol/L組(P<0.05)；硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)基因表達(dá)量以2.0、4.0 mmol/L組顯著高于其他組(P<0.05)；磷脂酸磷酸酯酶1(LPIN1)、嗜乳脂蛋白亞家族1成員1(BTN1A1)和黃嘌呤脫氫酶(XDH)基因表達(dá)量均以1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L組顯著高于0.5 mmol/L組(P<0.05)；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)基因及蛋白表達(dá)量均以2.0、4.0 mmol/L組顯著高于0.5和8.0、16.0 mmol/L組(P<0.05)；固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)基因表達(dá)量以1.0、2.0、4.0 mmol/L組顯著高于其他組(P<0.05)，蛋白表達(dá)量以1.0 mmol/L組顯著高于其他組(P<0.05)。但高濃度Lys抑制AGPAT6和GPAM的基因表達(dá)，AGPAT6基因表達(dá)量以2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L組顯著低于0.5、1.0 mmol/L組(P<0.05)，GPAM基因表達(dá)量以16.0 mmol/L組顯著低于0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L組(P<0.05)?？梢?jiàn)，Lys對(duì)BMECs的乳脂肪合成具有顯著的促進(jìn)效果，但高濃度的Lys抑制了乳脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)。本試驗(yàn)條件下，培養(yǎng)基中Lys適宜濃度為2.0～4.0 mmol/L。

奶牛；乳腺上皮細(xì)胞；賴(lài)氨酸；乳脂肪

乳脂肪是牛奶的主要成分，是評(píng)價(jià)牛奶質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。氨基酸(AA)是乳蛋白合成的重要前體物，但AA在影響乳蛋白合成的同時(shí)，也影響著乳脂肪合成與組成[1]。因此，深入研究AA對(duì)乳脂肪合成的影響及機(jī)理，對(duì)調(diào)控乳腺內(nèi)乳成分的合成和改善乳品質(zhì)具有重要意義。賴(lài)氨酸(Lys)是動(dòng)物的必需氨基酸，Giallongo等[2]向奶牛灌注過(guò)瘤胃賴(lài)氨酸(RPLys)后發(fā)現(xiàn)，Lys在促進(jìn)乳蛋白合成的同時(shí)，對(duì)乳脂肪的合成具有促進(jìn)效果。Xu等[3]研究發(fā)現(xiàn)，向泌乳母豬飼喂Lys和纈氨酸(Val)后，適宜的Lys和Val比例能夠使母豬背部脂肪損失降到最低，說(shuō)明Lys和Val能夠影響乳脂肪的合成。韓慧娜[4]研究發(fā)現(xiàn)，秸稈飼糧條件下奶牛陰外動(dòng)脈灌注AA能促進(jìn)乳腺內(nèi)短鏈脂肪酸的攝取?？梢?jiàn)，Lys在一定程度上影響了乳脂肪的合成，然而國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道多集中在向奶牛瘤胃內(nèi)及陰外動(dòng)脈灌注Lys影響乳蛋白和乳脂肪合成的方面，但以奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)為模型，研究不同濃度Lys對(duì)乳脂肪合成相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響的國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少，此方面機(jī)理有必要繼續(xù)進(jìn)行研究和探索。鑒于此，本研究以BMECs為模型，研究不同濃度Lys對(duì)乳脂肪合成相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討Lys對(duì)BMECs內(nèi)乳脂肪合成的影響機(jī)理提供理論基礎(chǔ)，為調(diào)控奶牛Lys營(yíng)養(yǎng)水平、提高生產(chǎn)性能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器

Ⅱ型膠原酶、DMEM/F12培養(yǎng)基、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒鈉、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)購(gòu)自Gibco公司；Lys(L8662)、氫化可的松、表皮生長(zhǎng)因子、催乳素、油紅O、瓊脂糖和兔抗過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)抗體購(gòu)自Sigma公司(AV32880)；兩性霉素購(gòu)自Amresco公司；細(xì)胞培養(yǎng)用雙抗購(gòu)自Corning公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)和Tris緩沖液(TBS)購(gòu)自HyClone公司；RNAiso PLUS、PrimeScript RT Master Mix和SYBR Premix ExTaqTMⅡ購(gòu)自TaKaRa公司；放射免疫沉淀測(cè)定(RIPA)裂解液、2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉(BCA)蛋白質(zhì)濃度試劑盒、Western一抗稀釋液、Western二抗稀釋液、十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)電泳液、Western轉(zhuǎn)膜液、ECL化學(xué)超敏顯色液購(gòu)自北京碧云天公司；鼠抗固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)抗體購(gòu)自Abcam公司(ab3259)；兔抗磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體購(gòu)自Proteintech公司(10494-1-AP)；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔二抗購(gòu)自KPL公司(04-15-06)；HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗購(gòu)自天津三箭生物技術(shù)有限公司(LK2003)。

主要儀器包括：二氧化碳恒溫培養(yǎng)(Forma-311，Thermo公司)；生物安全柜(MSC-ADVANTAGE，Thermo公司)；倒置顯微鏡(Olympuse公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Synergy H4 BioTek，BioTek公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Cytorecon，GE公司)；熒光定量PCR儀(ABI-7500，ABI公司)；蛋白質(zhì)電泳儀、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜儀、蛋白質(zhì)成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.2原代BMECs體外培養(yǎng)

BMECs用膠原酶消化法獲得。在內(nèi)蒙古呼和浩特市北亞清真屠宰場(chǎng)選取3～5歲經(jīng)產(chǎn)的健康泌乳中期的高產(chǎn)荷斯坦奶牛乳腺組織。去除組織表層，于深層取約1 cm3的組織塊放入4 ℃預(yù)冷的3×雙抗PBS中。隨后在超凈臺(tái)內(nèi)分別用3×PBS、75%酒精和1×PBS清洗。再去除組織塊的表層，選腺泡豐富的組織剪成糊狀。加入等體積0.5%的Ⅱ型膠原酶溶液，37 ℃和5% CO2條件下消化1 h。之后用80目濾網(wǎng)過(guò)濾，收集細(xì)胞濾液，179×g離心5 min，棄上清；PBS沖洗細(xì)胞，179×g離心3 min，重復(fù)沖洗2次。加入完全培養(yǎng)基，吹打均勻后接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)原代細(xì)胞貼壁率達(dá)到80%～90%后用0.25%胰蛋白酶/EDTA對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化和傳代[5]。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)用第3代的BMECs，按照試驗(yàn)要求的細(xì)胞密度接種于不同的細(xì)胞培養(yǎng)板上，在37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。采用單因子隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)中使用的DMEM/F12培養(yǎng)基中Lys的濃度為0.5 mmol/L，參考李喜艷[6]和高海娜[7]的研究結(jié)果并通過(guò)噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定細(xì)胞的增殖率確定Lys的濃度，各組Lys的濃度分別為0.5(基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對(duì)照)、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0 mmol/L，每組6個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)1個(gè)培養(yǎng)孔。細(xì)胞貼壁率達(dá)到80%～90%時(shí)，換為饑餓培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求換成不同濃度Lys的培養(yǎng)基，37 ℃和5% CO2培養(yǎng)48 h。

1.4測(cè)試指標(biāo)與方法

1.4.1 細(xì)胞活力與TAG的含量

細(xì)胞活力采用MTT法檢測(cè)，以490 nm吸光度值(OD490 nm)計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率(RGR)，公式如下：

RGR(%)=(試驗(yàn)組OD490 nm/對(duì)照組OD490 nm)×100。

TAG含量參考Ramírez-Zacarías等[8]的方法測(cè)定，將細(xì)胞以5×104個(gè)/mL的密度接種于24孔培養(yǎng)板上，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)培養(yǎng)結(jié)束后，棄掉培養(yǎng)基，PBS清洗2遍，每孔加入4%多聚甲醛溶液0.2 mL固定細(xì)胞1 h，PBS清洗2遍，用0.5 mL油紅O工作液避光浸染2 h。用PBS清洗3遍，晾干培養(yǎng)板后，加入0.3 mL異丙醇萃取30 min，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為510 nm吸光度值(OD510 nm)，用以表示TAG含量。

1.4.2 BMECs內(nèi)乳脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)

將細(xì)胞以2×105個(gè)/mL的密度接種于6孔培養(yǎng)板，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)培養(yǎng)結(jié)束后，細(xì)胞總RNA按照Trizol法提取，用酶標(biāo)儀檢測(cè)總RNA的純度與濃度，260和280 nm吸光度值比值(OD260 nm/OD280 nm)在1.8～2.2表示總RNA純度較好。完整性用2%瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)。將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用PrimeScript RT Master Mix試劑盒的方法，反轉(zhuǎn)錄體系為10 μL。基因表達(dá)量采用SYBY Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒的方法進(jìn)行測(cè)定，反應(yīng)體系為20 μL。以GAPDH為管家基因，對(duì)乳脂肪合成相關(guān)基因[脂肪酸合成酶(FASN)、乙酰輔酶A羧化酶(ACACA)、PPARγ、SREBP1、硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)、脂肪酸結(jié)合蛋白3(FABP3)、脂蛋白脂酶(LPL)、乙酰甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶6(AGPAT6)、甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAM)、磷脂酸磷酸酯酶1(LPIN1)、嗜乳脂蛋白亞家族1成員1(BTN1A1)、黃嘌呤脫氫酶(XDH)]進(jìn)行相對(duì)定量，引物序列見(jiàn)表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火34 s，72 ℃延伸20 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，51個(gè)循環(huán)，繪制熔解曲線(xiàn)?；虻南鄬?duì)表達(dá)量采用2-△△Ct表示。

表1 乳脂肪合成相關(guān)基因的引物序列

續(xù)表1基因GenesGenBank登錄號(hào)GenBankaccessionNo.引物序列Primersequences(5'—3')長(zhǎng)度Length/bp參考文獻(xiàn)References嗜乳脂蛋白亞家族1成員1BTN1A1M35551F:AGGACGGACTGGGCAATTGR:GAACCCATTCTCGGGAGTCAT81Bionaz等[11]黃嘌呤脫氫酶XDHBC102076F:GATCATCCACTTTTCTGCCAATGR:CCTCGTCTTGGTGCTTCCAA100自行設(shè)計(jì)

F：上游引物;R：下游引物。

F: forward primer; R: reverse primer.

1.4.3 BMECs內(nèi)PPARγ和SREBP1的蛋白表達(dá)量

采用蛋白免疫印跡的方法測(cè)定，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。將細(xì)胞以1×106個(gè)/mL的密度接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)培養(yǎng)結(jié)束后，棄掉上清，用PBS清洗細(xì)胞2遍，每瓶加入250 μL含0.1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA細(xì)胞裂解液，4 ℃裂解5 min后刮下細(xì)胞并收集細(xì)胞懸液，4 ℃ 15 455×g離心10 min，取上清用于檢測(cè)蛋白的表達(dá)量。取適量樣品用BCA法測(cè)定樣品的蛋白質(zhì)濃度，隨后分別向60 μg的每種樣品中添加5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液，按照4∶1的比例混合，100 ℃加熱5 min使蛋白質(zhì)熱變性，然后進(jìn)行電泳，濃縮膠80 V電泳30 min，分離膠120 V電泳120 min。電泳結(jié)束后，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(100 V，4 ℃，50 min)。轉(zhuǎn)膜后，吐溫-TBS(TBST)漂洗3次，每次5 min，室溫?fù)u床上封閉1 h，TBST漂洗3次，每次5 min。然后將其分別與250倍稀釋的兔抗PPARγ一抗稀釋液和50倍的鼠抗SREBP1一抗稀釋液結(jié)合，于4 ℃孵育過(guò)夜，取出PVDF膜后TBST漂洗3次，每次5 min。隨后分別與稀釋1 000倍的山羊抗兔二抗稀釋液和稀釋500倍的山羊抗鼠二抗稀釋液結(jié)合，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min。用ECL顯色法試劑盒進(jìn)行顯色，在蛋白質(zhì)成像儀上照相分析。圖片用Quantity one軟件進(jìn)行灰度值分析，PPARγ和SREBP1蛋白表達(dá)量采用各組灰度值與0.5 mmol/L組灰度值的比值表示。

1.5數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)通過(guò)Excel進(jìn)行整理，采用SAS 9.0軟件的方差分析程序(ANOVA)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，同時(shí)用回歸統(tǒng)計(jì)程序進(jìn)行一次線(xiàn)性與二次曲線(xiàn)回歸分析，P<0.05表示組間的差異或回歸關(guān)系顯著，0.05≤P<0.10表示組間的差異或回歸關(guān)系趨于顯著，P>0.10表示組間的差異或回歸關(guān)系不顯著。

2 結(jié) 果

2.1Lys對(duì)BMECs細(xì)胞活力、TAG含量及乳脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

由表2可知，隨著Lys濃度的增加，BMECs RGR呈顯著的一次線(xiàn)性下降(P<0.001)，TAG含量呈顯著的二次曲線(xiàn)升高(P=0.013)，F(xiàn)ABP3和LPL基因表達(dá)量分別呈顯著和趨于顯著的一次線(xiàn)性增加(P=0.001和P=0.096)，其中，4.0、8.0、16.0 mmol/L組的RGR顯著低于0.5、1.0、2.0 mmol/L組(P<0.05)，F(xiàn)ABP3基因表達(dá)量以2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L組顯著高于0.5、1.0 mmol/L組(P<0.05)，LPL基因表達(dá)量以1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L組顯著高于0.5 mmol/L組(P<0.05)。隨著Lys濃度的增加，F(xiàn)ASN基因表達(dá)量呈顯著的二次曲線(xiàn)上升(P=0.003)，最高值出現(xiàn)在2.0 mmol/L組，顯著高于16.0 mmol/L組(P<0.05)。2.0、4.0 mmol/L組的SCD1基因表達(dá)量顯著高于其他組(P<0.05)。2.0、4.0 mmol/L組PPARγ基因表達(dá)量顯著高于0.5和8.0、16.0 mmol/L組(P<0.05)。1.0、2.0、4.0 mmol/L組的SREBP1基因表達(dá)量顯著高于其他各組(P<0.05)。AGPAT6和GPAM基因表達(dá)量隨Lys的增加均呈顯著的一次線(xiàn)性降低(P=0.038和P=0.022)，AGPAT6基因表達(dá)量以2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L組顯著低于0.5、1.0 mmol/L組(P<0.05)，GPAM基因表達(dá)量以16.0 mmol/L組顯著低于0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L組(P<0.05)。LPIN1基因表達(dá)量以1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L組較高，顯著高于0.5 mmol/L組(P<0.05)。BTN1A1和XDH基因表達(dá)量也以1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L組較高，顯著高于其他各組(P<0.05)。

表2 Lys對(duì)BMECs細(xì)胞活力、TAG含量和乳脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)量的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。P<0.05表示回歸關(guān)系顯著；0.05≤P<0.10表示回歸關(guān)系趨于顯著；P>0.10表示回歸關(guān)系不顯著。下表同。

Values in the same row with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05).P<0.05 means significant regression, 0.05≤P<0.10 means regression tend to be significant, andP>0.10 means no significant regression. The same as below.

2.2Lys對(duì)BMECsPPARγ和SREBP1蛋白表達(dá)的影響

由表3和圖1可知，PPARγ蛋白表達(dá)量以1.0、2.0、4.0 mmol/L組顯著高于其他組(P<0.05)，SREBP1蛋白表達(dá)量以1.0 mmol/L組顯著高于其他各組(P<0.05)。

表3 Lys對(duì)BMECs PPARγ和SREBP1蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

乳脂肪是衡量乳品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[13]，大約98%為T(mén)AG，其中，中短鏈脂肪酸(SMCFA)的含量占乳脂肪的2/3以上[14]，奶牛乳汁中有50%的C16∶0脂肪酸以及幾乎全部的C4∶0～C14∶0是由乳脂肪合成前體物(乙酸、β-羥丁酸)在乳腺?gòu)念^合成的[15]。TAG在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的表面合成，合成后以脂滴的形式積累，積累的脂滴通過(guò)質(zhì)膜的包裹再由細(xì)胞分泌出去[16]。因此，BMECs內(nèi)TAG含量和脂滴的累積能直接反映BMECs內(nèi)乳脂肪的合成。研究表明，AA不僅能影響乳蛋白的合成，也能影響乳脂肪的合成[1]。李珊珊[17]研究表明，在BMECs中添加必需氨基酸顯著促進(jìn)乳蛋白的合成的同時(shí)，可能通過(guò)SREBP1和PPARγ調(diào)節(jié)乳脂肪的合成。然而，Lys對(duì)BMECs內(nèi)的TAG合成的影響及其機(jī)理研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果得出，隨著Lys濃度增加，BMECs內(nèi)TAG含量呈顯著的二次曲線(xiàn)升高，說(shuō)明Lys對(duì)TAG含量的影響呈濃度依賴(lài)關(guān)系，關(guān)于其影響機(jī)理尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。

圖1 Lys對(duì)BMECs PPARγ和SREBP1蛋白表達(dá)的影響

與細(xì)胞內(nèi)的從頭合成、長(zhǎng)鏈脂肪酸(LCFA)的攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)、脂滴的形成等過(guò)程有關(guān)的基因均會(huì)影響TAG的合成。哺乳動(dòng)物組織中攝取和LCFA的主要基因是LPL和FABP3[18]。LPL能催化TAG分解為脂肪酸和甘油，為組織供能及貯存能量[19]。FABP3與細(xì)胞內(nèi)LCFA的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，可將LCFA從細(xì)胞膜上運(yùn)送到TAG和磷脂的合成位點(diǎn)[20]。趙艷麗等[21]研究表明，添加適宜濃度的蛋氨酸對(duì)BMECs內(nèi)FABP3和LPL基因表達(dá)具有顯著的促進(jìn)作用，說(shuō)明蛋氨酸可以促進(jìn)BMECs內(nèi)LCFA的攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究結(jié)果得出，2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L組FABP3基因表達(dá)量、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L組LPL基因表達(dá)均顯著高于0.5 mmol/L組，且二者均隨著Lys濃度的增加呈顯著和趨于顯著的一次線(xiàn)性增加，說(shuō)明Lys對(duì)BMECs內(nèi)LCFA的攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)可能具有一定的促進(jìn)效果，提示Lys對(duì)乳脂肪合成的促進(jìn)效果呈濃度依賴(lài)關(guān)系。

FASN是一種多功能的酶系統(tǒng)，參與脂肪酸合成的整個(gè)過(guò)程，F(xiàn)ASN是奶牛乳脂肪酸從頭合成過(guò)程中的關(guān)鍵基因[11]，泌乳期奶牛乳腺內(nèi)SMCFA(C4～C16)的合成受FASN編碼的蛋白調(diào)控[22]。并且，F(xiàn)ASN催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A而生成LCFA。硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)是Δ9去飽和酶中一種主要的酶，是細(xì)胞中單不飽和脂肪酸合成的限速酶[20]。Li等[23]研究發(fā)現(xiàn)，添加不同比例的含Lys的必需氨基酸可上調(diào)BMECs內(nèi)LPIN1、FASN和SCD的基因表達(dá)量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Lys對(duì)FASN基因表達(dá)的促進(jìn)效果呈顯著的濃度依賴(lài)效應(yīng)，尤以2.0 mmol/L組最高，顯著高于16.0 mmol/L組；Lys也促進(jìn)SCD1基因表達(dá)，以2.0、4.0 mmol/L組顯著高于其他組。這些研究結(jié)果部分地解釋了Lys對(duì)乳脂肪合成具有促進(jìn)效果的原因。

此外，GPAM、AGPAT6和LPIN1參與催化TAG的合成[24]，是參與乳脂肪合成的關(guān)鍵酶。GPAM催化脂酰輔酶A與甘油-3-磷酸的sn-1位點(diǎn)結(jié)合形成溶血磷脂酸；AGPAT6催化第2個(gè)脂酰輔酶A與甘油-3-磷酸的sn-2位點(diǎn)結(jié)合形成磷脂酸(PA)；LPIN能轉(zhuǎn)移磷酸基團(tuán)，將PA轉(zhuǎn)變成二酰甘油。研究發(fā)現(xiàn)敲除了泌乳小鼠的AGPAT6基因后不能合成乳脂肪[25]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lys對(duì)GPAM和AGPAT6基因表達(dá)量的作用效果呈顯著的濃度依賴(lài)效應(yīng)，隨著Lys濃度的增加抑制了它們的表達(dá)，AGPAT6以2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L組顯著低于0.5、1.0 mmol/L組，GPAM以16.0 mmol/L組顯著低于0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L組；同時(shí)，Lys顯著地促進(jìn)了LPIN1基因表達(dá)，以1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L組較高。這些研究結(jié)果說(shuō)明，高濃度的Lys抑制了乳脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)一步解釋了Lys對(duì)乳脂肪合成的促進(jìn)效果呈濃度依賴(lài)效應(yīng)的原因。

BTN1A1和XDH是調(diào)控脂滴形成的主要蛋白[26]。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)是核轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)屬于核激素受體家族中的配體激活受體，PPARγ可調(diào)控SREBP1基因的表達(dá)，同時(shí)LPL和ACACA等是PPARγ的標(biāo)靶基因[27]。Kadegowda等[28]用PPARγ激活劑處理BMECs后發(fā)現(xiàn)，上調(diào)了ACACA、FASN、SREBF1、SCD和LPIN1基因的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，BTN1A1和XDH基因表達(dá)量均以1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L組較高；PPARγ基因及蛋白表達(dá)量均以2.0、4.0 mmol/L組顯著高于0.5和8.0、16.0 mmol/L組；SREBP1基因表達(dá)量以1.0、2.0、4.0 mmol/L組較高，蛋白表達(dá)量以1.0、2.0 mmol/L組較高，進(jìn)一步從轉(zhuǎn)錄因子和脂滴形成的角度解釋了Lys對(duì)乳脂肪合成具有促進(jìn)效果的原因。FABP3、LPL、FASN、GPAM、AGPAT6等是PPARγ和SREBP1的靶基因，在本研究只對(duì)PPARγ和SREBP1的蛋白表達(dá)量進(jìn)行了探討研究，而對(duì)FABP3、LPL、FASN、GPAM、AGPAT6等蛋白表達(dá)量尚未開(kāi)展研究，有必要今后繼續(xù)研究探討，以更好地闡明Lys對(duì)乳脂肪合成的影響機(jī)理。

生冉[29]研究指出，雷帕霉素抑制雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路后，SREBP1、PPARγ、ACACA和SCD1的基因表達(dá)量顯著下降；Soliman等[30]的試驗(yàn)研究也得出了相似的結(jié)果，雷帕霉素抑制了人乳腺外植體中SREBP1及其靶基因ACACA、FASN和SCD1的基因表達(dá)，說(shuō)明mTOR信號(hào)通路通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子SREBP1和PPARγ調(diào)控乳脂肪的合成。Lys是否通過(guò)mTOR信號(hào)通路間接地調(diào)控乳脂肪的合成尚未見(jiàn)資料報(bào)道，本試驗(yàn)并未對(duì)mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)，需要進(jìn)一步深入研究。

綜合脂肪酸攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)、從頭合成、TAG的合成及脂滴形成的相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果可以看出，Lys對(duì)BMECs內(nèi)的乳脂肪合成具有一定的促進(jìn)效果，呈濃度依賴(lài)效應(yīng)，以2.0～4.0 mmol/L的Lys添加濃度為宜，且Lys對(duì)BMECs細(xì)胞活力的影響也呈顯著濃度依賴(lài)效應(yīng)。然而目前關(guān)于添加Lys對(duì)奶牛乳脂肪合成及其調(diào)控機(jī)理的研究甚少，并且本試驗(yàn)得出的結(jié)果還沒(méi)有在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證，因此，需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

① Lys對(duì)BMECs的乳脂肪合成具有顯著的促進(jìn)效果，但高濃度的Lys抑制了乳脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)。

② 本試驗(yàn)條件下，培養(yǎng)基中Lys適宜濃度為2.0～4.0 mmol/L。

[1] MAXIN G,RULQUIN H,GLASSER F.Response of milk fat concentration and yield to nutrient supply in dairy cows[J].Animal,2011,5(8):1299-1310.

[2] GIALLONGO F,HARPER M T,OH J,et al.Effects of rumen-protected methionine,lysine,and histidine on lactation performance of dairy cows[J].Journal of Dairy Science,2016,99(6):4437-4452.

[3] XU Y T,ZENG Z K,XU X,et al.Effects of the standardized ileal digestible valine:lysine ratio on performance,milk composition and plasma indices of lactating sows[J].Animal Science Journal,2016,doi:10.1111/asj.12753.

[4] 韓慧娜.秸桿日糧條件下陰外動(dòng)脈灌注乳脂和乳蛋白前體物對(duì)奶牛乳腺內(nèi)短鏈脂肪酸攝取規(guī)律的影響[D].碩士學(xué)位論文.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[5] SHENG R,YAN S M,QI L Z,et al.Effect of the ratios of acetate and β-hydroxybutyrate on the expression of milk fat- and protein-related genes in bovine mammary epithelial cells[J].Czech Journal of Animal Science,2015,60(12):531-541.

[6] 李喜艷.奶牛乳腺上皮細(xì)胞中賴(lài)氨酸蛋氨酸配比模式對(duì)酪蛋白合成的影響及機(jī)理研究[D].碩士學(xué)位論文.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2011.

[7] 高海娜.亮氨酸、組氨酸、賴(lài)氨酸和蛋氨酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中酪蛋白合成的影響及調(diào)控機(jī)理研究[D].碩士學(xué)位論文.蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2016.

[9] ZHOU Y,AKER R M, JIANG H.Growth hormone can induce expression of four major milk protein genes in transfected MAC-T cells[J].Journal of Dairy Science,2008,91(1):100-108.

[10] QI L Z,YAN S M,SHENG R,et al.Effects of saturated long-chain fatty acid on mRNA expression of genes associated with milk fat and protein biosynthesis in bovine mammary epithelial cells[J].Asian-Australasian Journal of Animal Sciences,2014,27(3):414-421.

[11] BIONAZ M,LOOR J J.Gene networks driving bovine milk fat synthesis during the lactation cycle[J].BMC Genomics,2008,9:366.

[12] 張養(yǎng)東.脂多糖對(duì)泌乳奶牛乳脂肪和乳蛋白影響及其機(jī)理研究[D].博士學(xué)位論文.哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[13] HARVATINE K J,BOISCLAIR Y R,BAUMAN D E.Recent advances in the regulation of milk fat synthesis[J].Animal,2009,3(1):40-54.

[14] JENSEN R G.The composition of bovine milk lipids:January 1995 to December 2000[J].Journal of Dairy Science,2002,85(2):295-350.

[15] HARFOOT C G,HAZLEWOOD G P.Lipid metabolism in the rumen[M]//HOBSON P N,STEWART C S.The rumen microbial ecosystem.Netherlands:Springer,1997.

[16] SOLIMAN G A.The integral role of mTOR in lipid metabolism[J].Cell Cycle,2011,10(6):861-862.

[17] 李珊珊.必需氨基酸調(diào)節(jié)奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的作用機(jī)制[D].博士學(xué)位論文.杭州:浙江大學(xué),2015.

[18] LRHNER R,KUKSIS A.Biosynthesis of triacylglycerols[J].Progress in Lipid Research,1996,35(2):169-201.

[19] BONNET M,LEROUX C,CHILLIARD Y,et al.Rapid communication:nucleotide sequence of the ovine lipoprotein lipase cDNA[J].Journal of Animal Science,2000,78(11):2994-2995.

[20] 胡菡,王加啟,李發(fā)弟,等.奶牛乳腺脂肪酸合成相關(guān)基因研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)2009(10):34-39.

[21] 趙艷麗,陳璐,史彬林,等.亮氨酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)乳脂合成相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2017,29(4):1319-1326.

[22] WAKIL S J.Fatty acid synthase,a proficient multifunctional enzyme[J].Biochemistry,1989,28(11):4523-4530.

[23] LI S S,HOSSEINI A,et al.Essential amino acid ratios and mTOR affect lipogenic gene networks and miRNA expression in bovine mammary epithelial cells[J].Journal of Animal Science and Biotechnology,2016,7:44.

[24] COLEMAN R A,LEE D P.Enzymes of triacylglycerol synthesis and their regulation[J].Progress in Lipid Research,2004,43(2):134-176.

[25] BEIGNEUX A P,VERGNES L,QIAO X,et al.AGPAT6-a novel lipid biosynthetic gene required for triacylglycerol production in mammary epithelium[J].Journal of Lipid Research,2006,47(4):734-744.

[26] MCMANAMAN J L,RUSSEL T D,SCHAACK J,et al.Molecular determinants of milk lipid secretion[J].Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia,2007,12(4):259-268.

[27] DESVERGNE B,MICHALIK L,WAHLI W.Transcriptional regulation of metabolism[J].Physiological Reviews,2006,86(2):465-514.

[28] KADEGOWDA A,BIONAZ M,PIPEROVA L,et al.Lipogenic gene expression in MAC-T cells is affected differently by fatty acids and enhanced by PPAR-gamma activation[J].Journal of Dairy Science,2008,91:678.

[29] 生冉.乙酸參與奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)乳脂肪和乳蛋白合成的調(diào)控機(jī)理研究[D].博士學(xué)位論文.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[30] SOLIMAN M,KIMURA K,AHMED M,et al.Inverse regulation of leptin mRNA expression by short- and long-chain fatty acids in cultured bovine adipocytes[J].Domestic Animal Endocrinology,2007,33(4):400-409.

*Corresponding author, professor, E-mail: yansmimau@163.com

(責(zé)任編輯 王智航)

Effects of Lysine on Expressions of Genes and Proteins Involved in Milk Fat Synthesis in Bovine Mammary Epithelial Cells

CHEN Lu ZHAO Yanli GUO Xiaoyu SHI Binlin YAN Sumei*

(Collage of Animal Science, Inner Mongolia Agriculture University, Hohhot 010018, China)

This study was to detect the effects of lysine (Lys) on expressions of genes and proteins involved in milk fat synthesis in bovine mammary epithelial cells (BMECs) and discuss the mechanism of Lys regulating milk fat synthesis. The 3rd passage BMECs were divided into six groups with six replicates per group and one pore per replicate. Cells were cultured in medium containing 0.5 (basal medium, control), 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 and 16.0 mmol/L Lys, respectively. The triglyceride (TAG) content, expressions of genes and proteins involved in milk fat synthesis were detected after 48 h cultivation at 37 ℃ and 5% CO2. The results showed as follows: TAG content (P=0.013) and gene expressions of fatty acid-binding protein 3 (FABP3,P=0.001), lipoprotein lipase (LPL,P=0.096), fatty acid synthase (FASN,P=0.003), 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 6 (AGPAT6,P=0.038) and glycerol-3-phosphate acyltrandferase (GPAM,P=0.022) acted dose-dependent on Lys at significant level or significant tendency. Compared with 0.5 mmol/L group, 2.0, 4.0, 8.0 and 16.0 mmol/L groups significantly increased gene expression ofFABP3 (P<0.05), and 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 and 16.0 mmol/L groups significantly increased gene expression ofLPL(P<0.05). Gene expression ofFASNin 2.0 mmol/L group was the highest, which was significantly higher than that in 16.0 mmol/L group (P<0.05). Gene expression of stearoyl-CoA desaturase 1 (SCD1) in 2.0 to 4.0 mmol/L groups was significantly higher than that in other groups (P<0.05). Gene expressions of phosphatidic acid phosphatase 1 (LPIN1), butyrophilin subfamily 1 member A1 (BTN1A1) and xanthine dehydrogenase (XDH) in 1.0, 2.0, 4.0 and 8.0 mmol/L groups were significantly higher than those in 0.5 mmol/L group. Compared with the 0.5, 8.0 and 16.0 mmol/L groups, 2.0 and 4.0 mmol/L groups significantly increased gene and protein expression of peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPARγ) (P<0.05). Gene expression of sterol regulatory element binding protein 1 (SREBP1) in 1.0, 2.0 and 4.0 mmol/L groups was significantly higher than that in the other groups (P<0.05), and protein expression ofSREBP1 in 1.0 mmol/L group was significantly higher than that in the other groups (P<0.05). High dose of Lys decreased gene expressions ofAGPAT6 andGPAM. Compared with 0.5 and 1.0 mmol/L groups, 2.0, 4.0, 8.0 and 16.0 mmol/L groups significantly decreased gene expression ofAGPAT6 (P<0.05). Compared with 0.5, 1.0, 2.0 and 4.0 mmol/L groups, 16.0 mmol/L groups significantly decreased gene expression ofGPAM(P<0.05). In conclusion, Lys significantly promote milk fat synthesis in BMECs, but high dose of Lys inhibits gene expressions related in milk fat synthesis. Under the conditions in the present study, 2.0 to 4.0 mmol/L of Lys is an optimal level in culture medium.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(9)：3366-3374]

dairy cow; bovine mammary epithelial cells; lysine; milk fat

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.09.042

2017-02-24

國(guó)家奶業(yè)“973計(jì)劃”項(xiàng)目(2011CB1008003)

陳 璐(1990—)，女，山西襄汾人，碩士研究生，從事奶牛營(yíng)養(yǎng)研究。E-mail：1510560671@qq.com

*通信作者：閆素梅，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： yansmimau@163.com

S823

：A

：1006-267X(2017)09-3366-09