郭春利 丹 妮 曹琪娜 哈斯額爾頓 敖長金

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

蛋氨酸三肽對奶牛乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)量的影響

郭春利 丹 妮 曹琪娜 哈斯額爾頓 敖長金*

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

本試驗(yàn)旨在研究蛋氨酸三肽(Met-Met-Met)對奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)酪蛋白和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)量的影響。采用酶消化法培養(yǎng)的第3代奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，各處理在培養(yǎng)基中分別添加0(對照)、40、50、60、70和80 μg/mL的蛋氨酸三肽，每個處理5個重復(fù)，每個重復(fù)1個培養(yǎng)孔，分別培養(yǎng)細(xì)胞24、48和72 h，檢測奶牛乳腺上皮細(xì)胞的相對增殖率，整體試驗(yàn)重復(fù)2次，確定最佳培養(yǎng)時間；各處理在培養(yǎng)基中分別添加0(對照)、40、50、60、70和80 μg/mL的蛋氨酸三肽，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)1個培養(yǎng)孔，以最佳培養(yǎng)時間培養(yǎng)，用實(shí)時定量PCR法檢測酪蛋白基因的表達(dá)量，確定適宜蛋氨酸三肽濃度，整體試驗(yàn)重復(fù)3次；以最佳培養(yǎng)時間和適宜蛋氨酸三肽濃度培養(yǎng)細(xì)胞，以未添加蛋氨酸三肽的培養(yǎng)基為對照，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)1個培養(yǎng)孔，測定小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的表達(dá)量，整體試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果表明：在培養(yǎng)基中添加蛋氨酸三肽培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞24 h時，相對增殖率最高；培養(yǎng)基中加入60 μg/mL的蛋氨酸三肽培養(yǎng)細(xì)胞24 h，αs1-酪蛋白和β-酪蛋白的基因表達(dá)量最高，同時發(fā)現(xiàn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體1和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體2基因表達(dá)量顯著高于對照處理(P<0.05)。綜上所述，培養(yǎng)基中添加60 μg/mL的蛋氨酸三肽能夠提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白和肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的表達(dá)量。

蛋氨酸三肽；奶牛乳腺上皮細(xì)胞；酪蛋白；小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體

乳蛋白是評價牛奶品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。酪蛋白含量占總?cè)榈鞍缀康?0%，它包括αs1-酪蛋白(CSN1S1)、αs2-酪蛋白(CSN1S2)、β-酪蛋白(CSN2)和κ-酪蛋白(CSN3)4種，這4種酪蛋白的比例分別為36.5%～40.7%、9.7%～10.2%、26.8%～30.5%、6.8%～9.7%[1]。前人研究認(rèn)為游離氨基酸是可以滿足動物機(jī)體各組織合成代謝的需要[2]，但新近的研究發(fā)現(xiàn)，在反芻動物體內(nèi)存在著小肽吸收的過程，其血液循環(huán)中的小肽可以參與奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)的乳蛋白合成，并在一定程度上彌補(bǔ)了乳腺合成乳蛋白過程中游離氨基酸攝入不足的問題[3]。Backwell等[4]給泌乳奶牛提供以二肽形式結(jié)合的組氨酸和相同數(shù)量的游離組氨酸,試驗(yàn)結(jié)果表明前者可以促進(jìn)乳腺合成更多的乳蛋白。Wang[5]發(fā)現(xiàn)在BMECs培養(yǎng)時加入氨基酸二肽，可以使細(xì)胞合成乳蛋白量的提高。高學(xué)軍等[6]也在培養(yǎng)BMECs的過程中添加了不同濃度的蛋氨酸-蛋氨酸二肽、蛋氨酸-賴氨酸二肽、賴氨酸-賴氨酸二肽和賴氨酸-蛋氨酸二肽，并已證實(shí)添加適宜濃度的二肽可以促進(jìn)CSN2基因和蛋白的表達(dá)。

目前已經(jīng)證明奶牛乳腺組織內(nèi)存在2種小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體，即小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體1(PepT1)和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體2(PepT2)[7-8]。這2種載體是根據(jù)自身系統(tǒng)內(nèi)部的定向質(zhì)子梯度和負(fù)膜電位來發(fā)揮其轉(zhuǎn)運(yùn)作用[9-10]，它們可以轉(zhuǎn)運(yùn)大部分二肽和三肽，但一般不能轉(zhuǎn)運(yùn)3個以上氨基酸殘基構(gòu)成的肽[1,4]。

在BMECs合成乳蛋白的研究過程中，關(guān)于第一限制性氨基酸蛋氨酸所組成的二肽已經(jīng)有了初步的研究，但對蛋氨酸三肽(methionyl-methionyl-methionine,Met-Met-Met)的研究未見報道。所以本試驗(yàn)在BMECs培養(yǎng)過程中添加不同濃度的蛋氨酸三肽，研究其對BMECs相對增殖率、酪蛋白和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)量的影響，以期為提高乳蛋白產(chǎn)量和改善牛奶品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

DMEM/F12培養(yǎng)基、Ⅱ型膠原酶、雙抗(青霉素-鏈霉素)、0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液均購自Gibco公司；胎牛血清(FBS)購自BI公司；組織/細(xì)胞總RNA提取試劑盒(DP431)購自TIANGE公司；PrimeScriptRTMaster Mix試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、ABI PrismTM(KR0390-v8.13)、6×上樣緩沖液、DL 2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均購自上海TAKARA公司；氫化可的松購自Sigma公司；噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞基砜(DMSO)和兩性霉素B均購自Amresco公司；磷酸鹽緩沖液(DPBS)購自HyClone公司；蛋氨酸三肽由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，合成報告顯示蛋氨酸三肽純度為98.10%，相對分子質(zhì)量為411.61。

主要儀器有：二氧化碳(CO2)恒溫培養(yǎng)(HF-240，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；倒置顯微鏡(Olympuse公司)；全自動酶標(biāo)儀(Synergy H4,Bio Tek公司)；梯度PCR儀(Veriti Thermal Cycler，Thermo公司)；實(shí)時定量PCR儀和電泳儀(Bio-Rad公司)。

1.2試驗(yàn)設(shè)計

本試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計。各處理在培養(yǎng)基中分別添加0(對照)、40、50、60、70和80 μg/mL的蛋氨酸三肽，每個處理5個重復(fù)，每個重復(fù)1個培養(yǎng)孔，分別培養(yǎng)細(xì)胞24、48和72 h，檢測BMECs的相對增殖率(relative growth rate，RGR)，整體試驗(yàn)重復(fù)2次，確定最佳培養(yǎng)時間；各處理在培養(yǎng)基中分別添加0(對照)、40、50、60、70和80 μg/mL的蛋氨酸三肽，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)1個培養(yǎng)孔，以最佳培養(yǎng)時間培養(yǎng)，用實(shí)時定量PCR法檢測酪蛋白基因的表達(dá)量，確定適宜蛋氨酸三肽濃度，整體試驗(yàn)重復(fù)3次；以最佳培養(yǎng)時間和適宜蛋氨酸三肽濃度培養(yǎng)細(xì)胞，以未添加蛋氨酸三肽的培養(yǎng)基為對照，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)1個培養(yǎng)孔，測定小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的表達(dá)量，整體試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3BMECs培養(yǎng)方法

BMECs采用酶消化法獲得。取健康的荷斯坦奶牛乳腺組織(內(nèi)蒙古呼和浩特北亞清真冷庫)，分離去除組織表面，在深層組織剪取約1 cm3的組織塊若干，放入預(yù)冷的DPBS中。將組織塊放入超凈臺，用DPBS將組織塊洗凈后，再剪去組織塊表層并將去表層的組織塊在離心管中剪成糊狀，1∶1加入0.5%膠原酶Ⅱ溶液。將消化液和組織混勻后在37 ℃的5% CO2條件下消化1 h，每隔20 min搖晃離心管。消化液用孔徑80目的細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞濾液，1 300 r/min離心5 min，棄上清。加入BMECs誘導(dǎo)培養(yǎng)基(每100 mL的DMEM/F12培養(yǎng)基中加入10% FBS、1 mL青霉素-鏈霉素、0.5 mL胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白、100 μL兩性酶素B、100 μL氫化可的松)，吹打均勻，轉(zhuǎn)移至25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37 ℃的5% CO2的條件下培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞的生長情況，待細(xì)胞生長至85%～95% 融合度時，根據(jù)BMECs與奶牛乳腺成纖維細(xì)胞對胰蛋白酶消化敏感性不同的特點(diǎn)，純化BMECs并進(jìn)行傳代。本試驗(yàn)采用第3代傳代細(xì)胞進(jìn)行研究。

1.4測試指標(biāo)與方法

1.4.1 MTT法檢測相對增殖率

細(xì)胞相對增殖率檢測采用MTT法[12]進(jìn)行，用以判定細(xì)胞活力。收集第3代BMECs，用BMECs誘導(dǎo)培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮液以1×104個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板(Corning，3599)上，置于37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h后吸出各孔內(nèi)培養(yǎng)液，培養(yǎng)基換成無血清的BMECs誘導(dǎo)培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，添加含不同濃度蛋氨酸三肽的無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h；在培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)；4 h后棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min后，用全自動酶標(biāo)儀檢測各培養(yǎng)孔的490 nm吸光度(OD490 nm)值。每個處理5個重復(fù)，每個重復(fù)1個培養(yǎng)孔，整體試驗(yàn)重復(fù)2次。相對增殖率計算公式如下：

相對增殖率(%)=(試驗(yàn)處理OD490 nm/對照處理OD490 nm)×100。

1.4.2 實(shí)時定量PCR法檢測酪蛋白基因表達(dá)量

將培養(yǎng)至第3代的BMECs，以2×105個/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板(Corning，3599)上，置于37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h后吸出各孔內(nèi)培養(yǎng)液，培養(yǎng)基換成無血清的BMECs誘導(dǎo)培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，添加含不同濃度蛋氨酸三肽的無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)1個培養(yǎng)孔，按照相對增殖率最佳的培養(yǎng)時間進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞總RNA按照組織/細(xì)胞總RNA提取試劑盒的方法進(jìn)行提取，總RNA的完整性和純度用1%的瓊脂糖凝膠電泳和酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。反轉(zhuǎn)錄PCR按照PrimeScriptRTMaster Mix試劑盒的方法進(jìn)行，得到的cDNA用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行實(shí)時定量PCR，反應(yīng)體系為20 μL，每個重復(fù)進(jìn)行3次PCR檢測。以本實(shí)驗(yàn)室常用的磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因，對CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3基因的表達(dá)量進(jìn)行測定，引物序列及參數(shù)見表1。實(shí)時定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5.0 ℃預(yù)變性30 s；95.0 ℃變性30 s；退火溫度下30 s；72.0 ℃延伸20 s，40個循環(huán)。熔解曲線程序?yàn)椋?0～95 ℃，每6 s升溫0.5 ℃，共51個循環(huán)，實(shí)時定量PCR結(jié)果采用2-△△Ct法進(jìn)行相對定量分析。

1.4.3 實(shí)時定量PCR法檢測小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)量

按照根據(jù)相對增殖率得到的最佳培養(yǎng)時間及根據(jù)酪蛋白基因表達(dá)量得到的適宜蛋氨酸三肽濃度對第3代接種于6孔板的BMECs進(jìn)行培養(yǎng)，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)1個培養(yǎng)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因，對小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體(PepT1和PepT2)基因的表達(dá)量進(jìn)行測定，引物序列及參數(shù)見表1。實(shí)時定量PCR的反應(yīng)程序及熔解曲線程序同1.4.2，實(shí)時定量PCR結(jié)果采用2-△△Ct法進(jìn)行相對定量分析。

表1 引物序列及參數(shù)

F：上游引物；R：下游引物。

F: forward primer； R: reverse primer.

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計，對相對增殖率、酪蛋白基因表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，同時一次線性和二次曲線回歸分析；小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的表達(dá)量進(jìn)行t檢驗(yàn)。P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1蛋氨酸三肽濃度與培養(yǎng)時間對BMECs相對增殖率的影響

由表2可知，添加不同濃度的蛋氨酸三肽培養(yǎng)細(xì)胞24 h時，相對增殖率隨著蛋氨酸三肽濃度的增加呈一次線性變化(P=0.101 2)，以50 μg/mL劑量組最高，回歸方程為Y=-0.003 47X+1.223 74，R2=0.646 1，式中X表示蛋氨酸三肽濃度，Y表示相對增殖率，回歸曲線擬合程度低；當(dāng)培養(yǎng)48 h時，隨著蛋氨酸三肽濃度的升高，相對增殖率呈現(xiàn)先降低后升高的二次曲線變化(P=0.276 2)，回歸方程為Y=0.000 1X2-0.014 1X+1.375 8，R2=0.723 8，式中X表示蛋氨酸三肽濃度，Y表示相對增殖率，即細(xì)胞培養(yǎng)48 h時，BMECs會由于蛋氨酸濃度的升高呈現(xiàn)先抑制后促進(jìn)生長的變化，但與回歸曲線擬合程度較低；當(dāng)培養(yǎng)72 h時，細(xì)胞也隨著蛋氨酸三肽濃度的升高呈現(xiàn)與48 h時相同的二次曲線變化趨勢(P=0.006 0)，回歸方程為Y=0.000 1X2-0.006 2X+1.052 4，R2=0.994 0，式中X表示蛋氨酸濃度，Y表示相對增殖率，即當(dāng)培養(yǎng)72 h時，BMECs會隨著蛋氨酸三肽濃度的升高呈現(xiàn)先抑制后促進(jìn)生長的變化。在培養(yǎng)基中加入50 μg/mL的蛋氨酸三肽培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，相對增殖率最強(qiáng)，最佳培養(yǎng)時間為24 h。

表2 蛋氨酸三肽濃度與培養(yǎng)時間對BMECs相對增殖率的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Values in the same column with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2蛋氨酸三肽濃度對BMECs酪蛋白基因表達(dá)量的影響

由表3可知，培養(yǎng)24 h后，隨著蛋氨酸三肽濃度的增加，BMECs內(nèi)CSN1S1、CSN1S2和CSN2基因的表達(dá)量都呈先增加后降低二次曲線趨勢變化，回歸方程分別為：Y=-0.000 9X2+0.119 4X-2.889 4，R2=0.729 0，P=0.271 0；Y=-0.000 5X2+0.074 0X-1.591 1，R2=0.916 5,P=0.083 5；Y=-0.001 3X2+0.156 6X-3.750 3，R2=0.887 2,P=0.112 8，式中X表示蛋氨酸三肽濃度，Y表示基因表達(dá)量；說明CSN1S1、CSN1S2和CSN2基因的表達(dá)量與蛋氨酸三肽濃度之間存在劑量依賴關(guān)系,但相關(guān)并不顯著(P>0.05)；而CSN3基因的表達(dá)量是隨著蛋氨酸三肽濃度的增加呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢，回歸方程為Y=0.000 7X2-0.084 5X+3.298 3，R2=0.921 1，P=0.078 9，式中X表示蛋氨酸三肽濃度，Y表示基因表達(dá)量。綜合來看，60 μg/mL對蛋氨酸三肽對酪蛋白基因表達(dá)的促進(jìn)作用較好。

2.3適宜濃度蛋氨酸三肽對BMECs中PepT1和PepT2基因表達(dá)量的影響

由表4可知，與對照處理相比，60 μg/mL的蛋氨酸三肽能顯著上調(diào)PepT1和PepT2的基因表達(dá)量(P<0.05)。

3 討 論

牛奶中90%的乳蛋白是由奶牛乳腺組織以血液中的游離氨基酸為原料合成的，但仍有10%是以氨基酸結(jié)合成小肽形式用于乳蛋白的合成[1，4]。小肽在被動物組織吸收利用的過程中主要依賴于其獨(dú)立的轉(zhuǎn)運(yùn)載體系統(tǒng)，它是通過氫離子(H+)和鈣離子(Ca2+)的逆濃度梯度進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)的，并且小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體具有轉(zhuǎn)運(yùn)速率快、吸收耗能低且不易飽和的優(yōu)點(diǎn)[16]，而氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體根據(jù)氨基酸種類不同有不同的轉(zhuǎn)運(yùn)載體及轉(zhuǎn)運(yùn)方式，且耗能多載體少[17]，因此動物組織對小肽的利用效率在理論上要高于游離氨基酸的利用效率。小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體主要存在于溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體15(solute carrier 15，SLC15)家族，其中PepT1和PepT2是泌乳動物轉(zhuǎn)運(yùn)小肽的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體，利用電子梯度逆濃度將大多數(shù)二肽、三肽等小肽以及許多擬肽物從胞外轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)[18-19]，PepT1是一種廣譜的，對底物起著低親合力、高容量的轉(zhuǎn)運(yùn)性能的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，而PepT2表現(xiàn)的特性恰恰與PepT1相反，呈現(xiàn)底物親合力高，低容量的性能[20]。崔艷[8]在BMECs培養(yǎng)的過程中，向培養(yǎng)基中添加蘇氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸(Thr-Phe-Phe)三肽，發(fā)現(xiàn)PepT1基因的表達(dá)顯著增強(qiáng)；同時Zhou等[21-22]通過抑制泌乳奶牛乳腺外植體中PepT2的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，發(fā)現(xiàn)乳蛋白合成量顯著減少，并且在體外培養(yǎng)的BMECs能攝取苯丙氨酸-苯丙氨酸二肽(Phe-Phe)促進(jìn)PepT2基因的表達(dá)并用于乳蛋白的合成，說明PepT1和PepT2在乳腺攝取小肽的過程中均發(fā)揮著重要的作用。

表3 蛋氨酸三肽濃度對BMECs酪蛋白基因表達(dá)量的影響

表4 適宜濃度蛋氨酸三肽對BMECs中PepT1和PepT2基因表達(dá)量的影響

相對增殖率是用來反映細(xì)胞活力和增殖的重要指標(biāo)。在本研究中發(fā)現(xiàn)，蛋氨酸三肽作為酪蛋白合成的前體物時對BMECs活力的調(diào)節(jié)作用呈濃度依賴關(guān)系。當(dāng)?shù)鞍彼崛奶砑雍?，隨著細(xì)胞培養(yǎng)時間的延長，出現(xiàn)不同的細(xì)胞增殖變化趨勢；在培養(yǎng)24 h時，細(xì)胞相對增殖率，即活力最高，這與二肽適宜培養(yǎng)時間不同[23]，可能是由于三肽中氨基酸殘基個數(shù)大于二肽，在進(jìn)入細(xì)胞后加速了細(xì)胞增殖代謝的過程，所以長時間的培養(yǎng)細(xì)胞可能導(dǎo)致細(xì)胞在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)營養(yǎng)不足，或因長時間培養(yǎng)的過程中細(xì)胞在培養(yǎng)板中生長過多，代謝產(chǎn)生一些不利于細(xì)胞增殖的物質(zhì)而使細(xì)胞的生長過程受到抑制。

以最佳培養(yǎng)時間培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)蛋氨酸三肽濃度為60 μg/mL時，CSN1S1和CSN2基因表達(dá)量最高；當(dāng)濃度達(dá)到70 μg/mL時，CSN1S2基因表達(dá)量最高；但CSN3基因呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，其原因可能是由于CSN3的主要作用是防止乳蛋白凝集沉淀[24]，所以在體外試驗(yàn)中CSN3基因出現(xiàn)了一定程度的下降。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中加入不同濃度蛋氨酸三肽培養(yǎng)24 h后，在濃度為60 μg/mL時CSN1S1和CSN2基因的表達(dá)量最高，而CSN3基因表達(dá)出現(xiàn)抑制，這可能是由于CSN3在合成過程中對蛋氨酸需要量較少，孫康玉[23]在培養(yǎng)BMECs的過程中用蛋氨酸二肽等量替代游離蛋氨酸或替代1/2游離蛋氨酸，CSN3基因表達(dá)也均出現(xiàn)抑制，本研究結(jié)果與其類似。

小肽的運(yùn)輸主要依賴于PepT1和PepT2 2種小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體，2種小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體都有顯著的底物特異性，同時具有多個跨膜結(jié)構(gòu)[25-26]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，適宜濃度的蛋氨酸三肽能促進(jìn)PepT1和PepT2基因的表達(dá)，證明BMECs能夠攝取和利用比二肽更長的肽鏈來合成乳蛋白及細(xì)胞增殖所需的骨架蛋白質(zhì)等，從而達(dá)到促進(jìn)BMECs增殖和酪蛋白合成的目的。然而，BMECs對小肽的具體利用機(jī)制以及酪蛋白合成中小肽與游離氨基酸的最優(yōu)添加比例，都有待于進(jìn)一步研究，同時其確切的機(jī)理仍需進(jìn)一步探討。

4 結(jié) 論

蛋氨酸三肽能夠調(diào)節(jié)BMECs的增殖，培養(yǎng)基中添加60 μg/mL蛋氨酸三肽培養(yǎng)24 h時對BMECs相對增殖率最高，同時可以促進(jìn)酪蛋白和2種小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的表達(dá)。證明蛋氨酸三肽可以通過這2種小肽載體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，并參與乳腺細(xì)胞中乳蛋白的合成。

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*Corresponding author, professor, E-mail: changjinao@sohu.com

(責(zé)任編輯 王智航)

Effects of Methionine Tripeptide on Expression Levels of Casein and Small Peptide Transporters Genes in Bovine Mammary Epithelial Cells

GUO Chunli DAN Ni CAO Qina Khas-Erdene AO Changjin*

(College of Animal Science， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010018， China)

This experiment aimed to study the effects of methionine tripeptide (Met-Met-Met) on expression levels casein and small peptide transporters genes in bovine mammary epithelial cells (BMECs). Using BMECs isolated with collagenase digestion method as the model, different concentrations [0 (control), 40, 50, 60, 70 and 80 μg/mL] of Met-Met-Met were added in culture medium in different treatments and cultured for 24, 48, and 72 h, respectively, and each treatment had 5 replicates with 1 culture pore per replicate. The experiment was repeated twice. Relative growth rate was measured to determine the optimal culture time. Different concentrations [0 (control), 40, 50, 60, 70 and 80 μg/mL] of Met-Met-Met were added in culture medium in different treatments and cultured for the optimal time, and each treatment had 3 replicates with 1 culture pore per replicate. The experiment was repeated for three times. Expression levels of casein genes were determined by real-time PCR to determine the optimal Met-Met-Met concentration. Using the optimal culture time and Met-Met-Met concentration to culture cells, and culture medium without Met-Met-Met was used for control. Each treatment had 3 replicates with 1 culture pore per replicate. The experiment was repeated three times. Expression levels of peptide transporter genes were examined. The results showed as follows: relative growth rate was the highest when cells were treated with Met-Met-Met for 24 h; with the suitable culturing time of 24 h, when adding 60 μg/mL Met-Met-Met, expression levels of αs1-casein and β-casein gens were the highest, meanwhile expression levels of small peptide transporter 1 and 2 genes were significantly higher than those in control treatment (P<0.05). To sum up, adding 60 μg/mL of Met-Met-Met can increase expression levels of casein and peptide transporter genes in BMECs.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(9)：3159-3166]

methionine tripeptide; bovine mammary epithelial cells; casein; small peptide transporters

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.09.018

2017-03-01

國家奶業(yè)“973計劃”項(xiàng)目(2011CB100803)

郭春利(1992—)，女，吉林長春人，碩士研究生，從事奶牛營養(yǎng)研究。E-mail： gclgcl02@foxmail.com

*通信作者：敖長金，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： changjinao@aliyun.com

S823

：A

：1006-267X(2017)09-3159-08