羅琳 周泠璇 劉婭

（石河子大學食品學院，石河子 832000）

畢赤酵母G5拮抗葡萄灰霉病機理初探

羅琳 周泠璇 劉婭

（石河子大學食品學院，石河子 832000）

針對新疆紅提葡萄中分離的生防菌株——畢赤酵母G5，以葡萄灰霉菌（Botrytis cinerea）為靶標菌，研究了G5對葡萄灰霉菌孢子及對葡萄果實內(nèi)5種關鍵酶活性的影響，初步探討了G5拮抗葡萄采后灰霉病的機理。采用離體（in vitro）實驗與活體（in vivo）實驗的方法對畢赤酵母菌G5拮抗葡萄灰霉病的機理進行探究。結果發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母菌株G5對葡萄灰霉菌孢子的萌發(fā)和菌絲生長均有抑制作用，對灰霉菌絲的抑制率最高為80.20%，對灰霉孢子抑制率達86.89%；兩者間存在營養(yǎng)競爭關系，有重寄生現(xiàn)象產(chǎn)生，拮抗菌自身并不分泌抗菌物質(zhì)。此外，該菌株能誘導果實體內(nèi)過氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶的酶活性，使其酶活性有顯著提高，說明畢赤酵母G5可以有效的誘導果實內(nèi)抗病相關酶的活性，增強對灰霉病的抑制效果。畢赤酵母G5拮抗葡萄灰霉病的機理主要包括營養(yǎng)競爭、誘導抗病性，是否有重寄生作用還需要進一步驗證。

葡萄灰霉?。簧锓乐?；畢赤酵母G5；拮抗機理

葡萄皮薄肉軟、水分含量多，營養(yǎng)價值高，深受國內(nèi)外消費者喜愛［1］。但貯運過程中易受到損傷，引起病原菌入侵導致腐爛，造成巨大經(jīng)濟損失［2，3］。據(jù)報道，每年我國由于采收、包裝、貯藏等技術原因，葡萄爛果損失率高達總產(chǎn)量的20%［4］。葡萄灰霉病是葡萄果實采后最大的病害之一［5］，目前采用的防治方法多為化學類抗菌劑，但隨著灰霉菌抗藥性的增強，防效有所下降，加之化學防治對環(huán)境和人體健康存在潛在危害，尋找安全、高效的防治方法已勢在必行。

生物防治因其低污染、低殘留、環(huán)境友好、安全性高等明顯優(yōu)于化學防治的優(yōu)勢，已成為果蔬采后病害防治的研究熱點，其中拮抗酵母菌具有適應果蔬采后貯藏條件、不產(chǎn)生抗菌素等優(yōu)勢，近20年來生防酵母菌的研究日益受到國內(nèi)外學者的關注［6］。Wisniewski等［7］認為理想的拮抗酵母菌應滿足以下需求：能穩(wěn)定遺傳，對病原菌有廣譜抑菌作用，在逆境下能良好生存，對營養(yǎng)物質(zhì)要求簡單，易于配制，對寄主及人體健康無危害等。至今已有多種拮抗酵母菌應用于桃、番茄、葡萄等果蔬病害的防治。如季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii）可防治葡萄灰霉?。?］、番茄根腐?。?］；季也蒙假絲酵母（Candida guilliermondi）可防治油桃灰霉病、桃灰霉?。?0］；羅倫隱球酵母（Ctyptoccus laurentii）可防治灰霉病、褐腐病、桃根腐病、櫻桃褐腐?。?1-12］。研究表明，目前，拮抗酵母的主要抗菌機理包括分泌抗菌素［13］、營養(yǎng)和空間競爭［14-16］、重寄生作用［17，18］及誘導作用［19］。

本實驗菌株為從新疆紅提葡萄中篩選出一株內(nèi)生生防菌株——畢赤酵母G5，前期拮抗實驗證明其對葡萄灰霉病有抑制作用。為明晰其拮抗葡萄灰霉病的機理，從拮抗菌對病原菌孢子萌發(fā)，拮抗菌與病原菌的營養(yǎng)競爭關系，重寄生作用及誘導酶活性等方面進行研究，旨為生防制劑的開發(fā)、研制、使用及提高生物防效等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料與試劑 紅提葡萄：新疆石河子143團采摘的紅提葡萄（Red Grape），大小成熟度一致、顆粒飽滿、無病蟲害。供試生防菌株：畢赤酵母G5（Pichia），分離自新疆紅提葡萄。供試病原菌株：葡萄灰霉菌（Botrytis cinerea），由北京市農(nóng)林科學院提供?；瘜W試劑均為分析純，購自天津市富宇精細化工有限公司。

1.1.2 儀器與設備 LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械有限公司）；MJX-1500型智能霉菌培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司）；THZ-98型恒溫振蕩器（太倉市華美生化儀器廠）；G560E型通用漩渦混勻器（北京科技有限公司）；OLRMPUS CX41型顯微鏡（北京悅馳恒業(yè)儀器科技有限公司）；SW-CG-1C V型微生物潔凈工作臺（蘇凈集團安泰公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）：蛋白胨 10 g，牛肉膏 3 g，氯化鈉 5 g，瓊脂 15 g，pH 7.2，蒸餾水1 000 mL；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）：蛋白胨 10 g，牛肉膏 3 g，氯化鈉 5 g，pH 7.2，蒸餾水 1 000 mL；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 拮抗酵母菌發(fā)酵液的制備 將拮抗酵母菌活化后挑取一環(huán)，接種于無菌的NB培養(yǎng)液中，28℃、170 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h，所得菌液即為發(fā)酵液。

1.2.2 病原菌孢子懸浮液的制備 用接種環(huán)在培養(yǎng)好的葡萄灰霉菌試管斜面上刮取適量孢子，轉移到0.85%的無菌生理鹽水中，用血球計數(shù)板計數(shù)，并用無菌生理鹽水調(diào)整至所需濃度，備用。

1.2.3 營養(yǎng)與空間競爭 葡萄灰霉菌菌絲生長抑制率的測定：采用生長速率法［20］檢測畢赤酵母菌G5對灰霉菌菌絲生長的影響。取畢赤酵母菌G5的發(fā)酵液、和空白NB培養(yǎng)液，用無菌水分別稀釋至5倍、50倍、500倍系列梯度濃度。然后每個梯度各取1 mL于平皿內(nèi)，倒入9 mL融化好的無菌PDA培養(yǎng)基，待凝固后在平板中央接種葡萄灰霉病菌菌餅（6 mm），將加入等量無菌水的培養(yǎng)基作為空白對照組，每處理重復3次。25℃培養(yǎng)7 d后測量菌落直徑，計算不同濃度的G5發(fā)酵液對葡萄灰霉菌菌絲的生長抑制率。

葡萄灰霉菌孢子萌發(fā)抑制率的測定：取酵母菌G5的發(fā)酵液，用無菌水分別稀釋至 5 倍、50 倍、500 倍系列梯度濃度。再取葡萄灰霉病菌孢子懸浮液（孢子濃度1×106CFU/mL）及上述不同濃度供試發(fā)酵液各10 μL，滴于凹玻片中，以5%葡萄糖溶液作為對照，混勻后25℃培養(yǎng)，每個處理重復3次，8 h后于光學顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)及萌發(fā)后芽管生長情況。

平板對峙實驗：采用平板對峙法［21］，同時以單獨接種灰霉菌菌餅的平板為對照，25℃培養(yǎng)7 d，測定菌落直徑［22］。每組3個，重復3次。

PDA混菌培養(yǎng)：將畢赤酵母菌G5和葡萄灰霉菌孢子分別制成濃度為104CFU/mL的菌懸液。分別吸取1 mL混合涂布于PDA平板上，25℃培養(yǎng)7 d后觀察平板內(nèi)菌落生長情況。

抑菌圈實驗［23］：用無菌打孔器在PDA培養(yǎng)基中心打一個孔，接入畢赤酵母菌，以中心線為軸，畢赤酵母菌兩邊分別打一個孔接入葡萄灰霉菌。25℃下培養(yǎng)5 d后觀察，以不接種畢赤酵母菌的平板為對照，每組3個，重復3次。

1.2.4 重寄生作用 將直徑6 mm的灰霉菌菌餅放于 PDA 平板中央，然后等距離3 cm處接畢赤酵母菌，25℃培養(yǎng)7 d，挑取病菌菌落邊緣的菌絲置于事先滴有無菌水的載玻片上，壓片后在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。以只接灰霉病菌的作對照，每組3個，重復3次。1.2.5 拮抗酵母菌處理對葡萄果實中酶活性的影響1.2.5.1 紅提葡萄果實的處理與取樣 將畢赤酵母菌G5和葡萄灰霉菌分別制成108CFU/mL和106CFU/mL的菌懸液。選擇新鮮飽滿無病害的紅提葡萄果粒作為試驗材料，洗凈并吸干多余水分后放入2%次氯酸鈉溶液中浸泡2 min，用無菌水清洗2遍，常溫晾干，備用。每組40粒。用滅過菌的打孔器在葡萄果實中間部位打一寬3 mm、深4 mm的孔，形成一個傷口，常溫下放置2 h自然晾干。將拮抗菌菌懸液分別接入不同組葡萄的傷口中，每孔注入20 μL，以接入20 μL無菌水作為對照組，放置2 h自然晾干后再各接入20 μL病原菌孢子懸浮液，放置2 h自然晾干后置于25℃條件下貯藏。

處理后分別在第1、2、3、4、5天取果實果肉進行相關酶活性的檢測。取果肉樣品時，應先輕輕刮去果實傷口，取病斑與完好組織交接部位的果肉。1.2.5.2 拮抗酵母菌處理對葡萄果實中酶活性的影響 參照《植物生理生化實驗》中所述方法進行酶液的制備［24］。取1 g果肉樣品，加入6 mL經(jīng)4℃預冷的0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.8，含1%PVP），在冰浴條件下研磨成勻漿，于4℃，10 000 r/min離心20 min。收集上清液作為粗酶液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

過氧化物酶（POD）：采用愈創(chuàng)木酚法［25］。多酚氧化酶（PPO）：采用鄰苯二酚比色法［26］。苯丙氨酸解氨酶（PAL）：參考劉郵洲［27］和申宏波等［28］的方法對葡萄果實的PAL活性進行測定。幾丁質(zhì)酶（CHI）：采用DNS法［28-30］。β-1，3-葡聚糖酶（GLU）：采用3，5-二硝基水楊酸法［31］。

2 結果

2.1 營養(yǎng)與空間競爭

通過對灰霉菌菌絲及其孢子萌發(fā)的研究，探討畢赤酵母菌G5對灰霉菌的抑制效果并判斷其拮抗機理是否包含分泌抑菌物質(zhì)。

通過表1、表2可看出，各梯度濃度的發(fā)酵液對葡萄灰霉菌的菌絲生長以及分生孢子的萌發(fā)和芽管的生長均有不同程度的抑制作用。對灰霉菌絲的抑制率最高至80.20%，對灰霉孢子抑制率達到86.89%。盡管隨著稀釋倍數(shù)的增大，抑制作用逐漸減弱，但是將發(fā)酵液原液濃度稀釋500倍時對灰霉菌菌絲仍有34.38%的抑制率，對分生孢子的抑制率達到46.67%。由此可見，拮抗酵母菌對葡萄灰霉孢子的萌發(fā)有著明顯的抑制作用。

表1 畢赤酵母菌G5對葡萄灰霉菌菌絲生長的抑制作用

表2 畢赤酵母菌G5對葡萄灰霉菌孢子萌發(fā)的影響

2.2 畢赤酵母菌對葡萄灰霉菌的抑制作用

畢赤酵母對葡萄灰霉菌抑制效果明顯（圖1），能有效的限制病原菌的生長蔓延。但是在PDA混菌培養(yǎng)過程中兩種微生物皆可在培養(yǎng)基上正常生長，兩種菌落之間沒有明顯的交界?？赏茰y，畢赤酵母能通過與病原菌競爭并消耗有限的營養(yǎng)來抑制病原菌生長，但是在營養(yǎng)充分的條件下并不能有效發(fā)揮抑制作用。抑菌圈實驗中無抑菌圈產(chǎn)生，說明產(chǎn)生抑菌物質(zhì)并不是畢赤酵母拮抗葡萄灰霉病菌的機理。

圖1 畢赤酵母菌G5對葡萄灰霉菌的抑制作用

2.3 畢赤酵母菌對葡萄灰霉菌的重寄生作用

圖2顯示，對照組葡萄灰霉菌菌落邊緣圓滑而整齊，菌落邊緣新生的菌絲比較稀疏，內(nèi)部的菌絲生長較茂密。實驗組葡萄灰霉菌菌落的邊緣同對照組一樣，圓滑而整齊，但菌絲的生長速度明顯變緩，生長量也明顯減少，而菌落較對照組厚且密。挑取兩組病原菌菌落邊緣的菌絲置于顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組的菌絲粗細均勻、舒展而飽滿，而實驗組的菌絲則粗細不均勻，部分菌絲有膨大、變形甚至出現(xiàn)斷裂的現(xiàn)象，發(fā)生了畸變。推測拮抗酵母菌能夠向體外分泌胞外水解酶，發(fā)生了重寄生現(xiàn)象，導致菌絲變形。

2.4 畢赤酵母菌處理對紅提葡萄果實中酶活性的影響

圖3是經(jīng)畢赤酵母菌誘導處理后的紅提葡萄果實及對照組的各類活性變化趨勢?？梢钥闯?，葡萄灰霉菌單獨接種的果實與誘導處理后的果實均可使酶活性提升。對照組果實的酶活性在貯藏前期略微上升，上升后活性開始呈下降趨勢。而經(jīng)過處理后的果實酶活性變化趨勢大體上與對照組一致，但其酶活性明顯始終高于對照組。果實在內(nèi)生拮抗酵母菌G5的誘導下，POD、PPO、PAL、GLU活性在第2天時達到酶活高峰，分別高于對照組29.32%、27.50%、51.57%、61.72%；CHI活性在第3 天達到酶活高峰，高于對照組121%。說明畢赤酵母菌G5可以誘導葡萄果實內(nèi)酶活性的提升。

3 討論

圖2 畢赤酵母菌G5對葡萄灰霉菌的重寄生作用

通過研究畢赤酵母對葡萄灰霉菌菌絲生長的影響、孢子萌發(fā)的影響、抑制作用、重寄生作用以及誘導果實酶活性5個方面的實驗，初步探討了酵母菌的拮抗機理。其中，畢赤酵母菌G5對葡萄灰霉菌的菌絲生長、孢子的萌發(fā)以及芽管的伸長具有強烈的抑制作用，使其發(fā)生形態(tài)上的畸變，證明畢赤酵母能有效抑制葡萄灰霉菌的生長。抑制實驗發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母能通過營養(yǎng)競爭拮抗葡萄灰霉菌，但在營養(yǎng)充分的條件下其畢赤酵母不能很好的抑制葡萄灰霉菌的生長。且畢赤酵母不通過分泌抗菌物質(zhì)對葡萄灰霉菌進行拮抗，抑菌圈實驗中并無抑菌圈生成。

圖3 貯藏期間紅提葡萄果實各種酶活性的變化

過氧化物酶是植物細胞內(nèi)的重要組成部分，對真菌病原菌孢子的萌發(fā)有直接抑制作用，并能誘導宿主植物產(chǎn)生一系列的防衛(wèi)反應。多酚氧化酶可以催化宿主植物細胞中木質(zhì)素及醌類物質(zhì)的形成，構成保護性屏蔽使植物細胞免受病原菌的侵害，從而提高宿主植物的抗性。苯丙氨酸解氨酶是苯丙烷類代謝途徑的關鍵酶，參與植物細胞中木質(zhì)素與植保素的合成，這二者均可對植物病原菌的入侵形成屏障，增加植物的抗病性。幾丁質(zhì)酶可以催化植物病原真菌細胞壁中的幾丁質(zhì)，使其水解生成N-乙酰葡萄糖胺，從而抑制植物病原真菌的生長，提高宿主植物抗病的能力。β-1，3-葡聚糖酶是植物過敏反應中合成的重要酶類，可以催化分解植物病原真菌菌絲尖端裸露的β-1，3-葡聚糖，使菌絲壁降解，從而使植物免受病原真菌的侵害。Droby等［32］研究發(fā)現(xiàn)假絲酵母在拮抗葡萄采后青霉菌過程中，可以使幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖的活性提升，進而誘導宿主產(chǎn)生抗性。Ippllito等［33］發(fā)現(xiàn)拮抗酵母菌可以誘導蘋果中幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶和過氧化物酶活性的增加。已有研究表明拮抗酵母菌可以提高酶的活性，從而誘導宿主產(chǎn)生抗性［34］。本研究中關于酶的結論與前人研究結果基本一致。

4 結論

分離自紅提葡萄表面的內(nèi)生拮抗畢赤酵母菌G5拮抗葡萄灰霉病的主要機理包括營養(yǎng)競爭、誘導抗性，是否發(fā)生重寄生作用還需要進一步實驗去證明。該菌株在拮抗過程中可以有效抑制葡萄灰霉孢子、菌絲的萌發(fā)和生長，提高葡萄果實內(nèi)酶的活性。

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（責任編輯 朱琳峰）

Preliminary Probe on Antagonistic Mechanisms of the Pichia pastoris G5 Against Botrytis cinerea

LUO Lin ZHOU Ling-xuan LIU Ya
（College of Food Science，Shihezi University，Shihezi 832000）

Considering the Pichia pastoris G5，a biocontrol strain isolated from red grape in Xinjiang and using Botrytis cinerea as target strain，we studied the effects of G5 on the spore of B. cinerea and the activities of five enzymes in the red grape fruit，and primarily explored the antagonistic mechanisms of G5 against B. cinerea by in vitro and in vivo experiment. Results showed that the G5 obviously inhibited the germination of B. cinerea spores and the growth of mycelium，and the rate of inhibiting mycelium maximally reached 80.20% and the rate of inhibiting spore germination was 86.89%. Nutritional competition existed between the G5 and B. cinerea. In the course of antagonism，the heavy parasitism phenomenon occurred. Experiment sindicated that G5 itself did not secrete antimicrobial substances. In addition，the strain induced and significantly increased the enzymes’ activities in fruit，such as peroxidase，polyphenol oxidase，phenylalanine ammonia lyase，chitinase，and β-1，3-glucanase. The inhibition mechanisms of G5 to B. cinerea include nutrition competition and inducible resistance；whether or not there is heavy parasitism needs to be further validated.

Botrytis cinerea；biological control；Pichia pastoris G5；antagonistic mechanism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0238

2017-03-28

兵團博士資金專項（2014BB006）

羅琳，女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏；E-mail：568674373@qq.com

劉婭，女，博士，教授，研究方向：食品生物技術；E-mail：441487042@qq.com