賈啟鵬申培磊張歡張勇，

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070）

CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)敲除CSN2基因奶山羊胎兒成纖維突變細(xì)胞的制備

賈啟鵬1申培磊2張歡1張勇1，2

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070）

旨在研究β-酪蛋白（β-casein，CSN2）對(duì)奶山羊泌乳性能的影響，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞（GFFs）CSN2基因，為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型構(gòu)建提供核供體。針對(duì)CSN2第二號(hào)、八號(hào)外顯子設(shè)計(jì)5個(gè)靶向CSN2基因sgRNA（T1、T2、T3、E1和E2），與PX330-eGFP載體連接，構(gòu)建PX330-eGFP-sgRNA敲除表達(dá)載體，經(jīng)T7E I酶切實(shí)驗(yàn)評(píng)估敲除效率；選擇第八號(hào)外顯子敲除效率最高sgRNA，構(gòu)建PX330-Neo-sgRNA敲除載體，將PX330-eGFP-sgRNA T 及PX330-eGFP-sgRNA E與PX330-Neo-sgRNA E組合轉(zhuǎn)染細(xì)胞，經(jīng)流式分選、G418藥篩獲得敲除CSN2基因細(xì)胞。Western blot測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞CSN2表達(dá)情況。測(cè)序結(jié)果表明各sgRNA均正確連入PX330表達(dá)載體中，T7E 1酶切實(shí)驗(yàn)表明sgRNA T1、sgRNA E2敲除效率最高達(dá)34.9%和25.9%；經(jīng)熒光定量PCR及免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明，eGFP+Neo轉(zhuǎn)染組CSN2敲除細(xì)胞比例顯著高于eGFP+eGFP轉(zhuǎn)染組（P<0.05）。綜上表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可有效應(yīng)用于奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞基因編輯，產(chǎn)生的突變細(xì)胞為制備CSN2基因敲除奶山羊提供核供體材料。

奶山羊；CRISPR/Cas9系統(tǒng)；敲除；β-酪蛋白

基因編輯技術(shù)在構(gòu)建動(dòng)物模型及研究基因功能等方面發(fā)揮重要作用。傳統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白是通過(guò)基因打靶技術(shù)將外源基因?qū)雱?dòng)物原核期受精卵獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，使重組蛋白在動(dòng)物乳腺中特異表達(dá)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者分別通過(guò)制備轉(zhuǎn)基因小鼠、奶山羊、奶牛等動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器獲得人溶菌酶（Human Lysozyme，HLZ）［1］、人抗胰蛋白酶（Human a1-antitrypsin，al-AT）［2］、人凝血IX因子（Human clotting factor IX，hFIX）［3］及人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA）［4］等重組蛋白。

然而，利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)外源蛋白難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，其中，重組蛋白表達(dá)量低是主要限制因素，究其原因可能是外源基因在動(dòng)物基因組中的隨機(jī)整合，受到鄰近染色體影響［5］或插入位點(diǎn)受到內(nèi)源性基因抑制引起［6，7］。而利用基因編輯技術(shù)將外源基因定點(diǎn)插入到乳蛋白啟動(dòng)子之后，利用乳蛋白上下游調(diào)控序列指導(dǎo)外源蛋白表達(dá)，成為制備高效穩(wěn)定動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的新方向［8］。Wright等［2］將外源基因定點(diǎn)整合到乳蛋白啟動(dòng)子之后，獲得轉(zhuǎn)基因綿羊乳汁中人抗胰蛋白酶表達(dá)量高達(dá)35 g/L。而Naruse等［9］將人類II型膠原蛋白基因插入到牛β-酪蛋白啟動(dòng)子表達(dá)載體后，構(gòu)建小鼠乳腺生物反應(yīng)器模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠在泌乳期外源蛋白表達(dá)量?jī)H在10-50 μL/mL。Marcelo等［10］研究發(fā)現(xiàn)乳蛋白啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的基因拷貝數(shù)對(duì)外源蛋白的表達(dá)也有很大影響，研究表明含有6-10個(gè)基因拷貝數(shù)的小鼠中，其乳汁中重組人GH蛋白的表達(dá)量達(dá)2.63 mg/mL。而較低拷貝數(shù)（2-3）的小鼠的表達(dá)量?jī)H為1 mg/mL；然而，雖然可以將外源基因定點(diǎn)整合到乳蛋白啟動(dòng)子之后，但不同動(dòng)物外源蛋白表達(dá)量相差較大，且大多處于較低水平。

近年來(lái)，一種成簇規(guī)律間隔回文段重復(fù)序列及鄰近相關(guān)基因（CRISPR/Cas9），在細(xì)菌［11］、動(dòng)物［12］、植物［13］以及人類細(xì)胞［14］上都表現(xiàn)出強(qiáng)大的基因編輯能力。同時(shí)，有研究表明敲除α-乳蛋白基因的小鼠乳汁變得黏稠，甚至無(wú)法泌乳哺乳后代，而利用基因打靶技術(shù)置換人α-乳蛋白基因后，小鼠泌乳機(jī)能恢復(fù)正常，人α-乳蛋白也有表達(dá)［15］。而在敲除小鼠β-酪蛋白基因后，小鼠泌乳及繁殖均未受到影響，只是乳汁中酪蛋白膠粒直徑減?。?6］，小鼠與大動(dòng)物之間畢竟存在較大差異，因此有必要探究β-酪蛋白對(duì)奶山羊泌乳性能的影響。為此，本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對(duì)奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞的β-酪蛋白基因進(jìn)行敲除，篩選高效敲除效率sgRNA，并獲得敲除CSN2基因的突變細(xì)胞，為制備CSN2基因敲除奶山羊提供核供體材料，為研究β-酪蛋白對(duì)動(dòng)物泌乳性能影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 HSW24型恒溫水浴鍋、THZ-82A型恒溫?fù)u床、電子天平PCR儀（Bio-Rad）、凝膠成像儀（Bio-Rad Universal Hood II）、熒光顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、高壓蒸汽鍋、渦旋振蕩儀。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞F2代（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)），限制性內(nèi)切酶BbsⅠ、T4連接酶（M0202L）均購(gòu)自美國(guó)NEB公司；一抗（Rabbit Anti-Beta casein）及二抗（Mouse Antirabbit-Lg G）均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，G418（新霉素）和胰蛋白酶購(gòu)自GBICO公司；脂質(zhì)體（LipofectamineTM2000）購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 靶位點(diǎn)sgRNA的選擇 參照奶山羊β-酪蛋白基因（ID：100860784），按照 “20N+NGG”原則在第二、八外顯子處設(shè)計(jì)5對(duì)特異識(shí)別靶序列DNA的sgRNA寡聚核苷酸鏈，分別在編碼鏈5'端添加CACC，非編碼鏈3'端添加AAAC，由上海金唯智公司合成，sgRNA序列見表1。

1.2.2 載體構(gòu)建 sgRNA寡聚核苷酸鏈經(jīng)程序性退火（95℃ 5 min自然降至室溫），連入含Bbs I酶切位點(diǎn)的膠回收產(chǎn)物PX330-eGFP（本實(shí)驗(yàn)室保存）載體中，通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證正確連入后，分別命名為PX330-eGFP-sgRNA T1、PX330-eGFP-sgRNA T2、PX330-eGFP-sgRNA T3。

1.2.3 敲除效率鑒定 培養(yǎng)奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞并將其分為PX330（陰性對(duì)照組）、PX330-eGFP-sgRNA T1/T2/T3和PX330-eGFP-sgRNA E1/E2，按照5 μg DNA與10 μL脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后經(jīng)流式分選獲綠色熒光細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取細(xì)胞基因組DNA，擴(kuò)增各靶點(diǎn)片段上下游共計(jì)685 bp（擴(kuò)增引物F：5'-TCAAAGACCCACTGAATA-3'；R：5'-ATGGCTGAGGTAGGTTTA-3'）及819 bp（擴(kuò)增引物F：5'-CTTTCTCCAACCGTCAT-3'；R：5'-TGCCTCCAATCTCCTAA-3'），經(jīng)凝膠成像鑒定條帶單一，PCR純化后，使用T7E I酶切檢測(cè)敲除效率，反應(yīng)體系：目的片段200 ng；NEB buffer 1 μL；95℃，5 min；95-85℃（-2℃/s）；85-25℃（-0.1℃/s）；12℃保存，然后加入T7E I酶 1 μL，37℃反應(yīng)20 min，2% 瓊脂糖凝膠電泳20 min。突變條帶百分比用Gel-Pro analyzer 凝膠成像軟件分析灰度值。

表1 設(shè)計(jì)的靶序列sgRNA的寡聚核苷酸序列

1.2.4 Western blot檢測(cè) 提取PX330-eGFP-sgRNA T質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，用5%脫脂奶粉封閉30 min，分別加入1∶300比例稀釋的一抗（Rabbit Anti-Beta casein）和1∶500比例稀釋的鼠抗兔抗體（Mouse Anti-rabbit-Lg G），室溫孵育2 h，TBST洗膜后，使用DAB顯色并拍照。

1.2.5 PX330-Neo-sgRNA質(zhì)粒構(gòu)建及共轉(zhuǎn)染 選擇第八外顯子處具高效敲除效率sgRNA，構(gòu)建PX330-Neo-sgRNA E1敲除載體，測(cè)序鑒定正確連入后，按照如下組合轉(zhuǎn)染細(xì)胞：

A方案：PX330-eGFP-sgRNA T和 PX330-eGFP-sgRNA E；B方案：PX330-eGFP-sgRNA T和PX330-Neo-sgRNA E。

人才的培養(yǎng)靠教育，教師占據(jù)教育的主導(dǎo)地位，建設(shè)一支人員精干、結(jié)構(gòu)合理、專兼結(jié)合的“雙師型”教師隊(duì)伍，是提高高職旅游專業(yè)教師教育教學(xué)質(zhì)量的重要保證。郭義祥認(rèn)為，解決的途徑有兩種，內(nèi)部培養(yǎng)和外部引進(jìn)。內(nèi)部培養(yǎng)指的是課任教師要在旅游專業(yè)上明確主攻方向，加強(qiáng)社會(huì)實(shí)踐和學(xué)習(xí)交流；外部引進(jìn)主要是聘任酒店以及旅行社一線高技能工作人員以及專家學(xué)者。

其中，A方案陽(yáng)性細(xì)胞基因組，按B方案轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，經(jīng)流式分選后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，加入800 μg/mL G418進(jìn)行藥物篩選，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞大量死亡時(shí)，降低G418濃度至200 μg/mL，直至出現(xiàn)單克隆細(xì)胞，停藥繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，提取細(xì)胞基因組，擴(kuò)增靶點(diǎn)上下游8 288 bp片段（擴(kuò)增引物F：5'-AAA GACCCACTGAATACTAAAGAGACCTCATTG-3'；R：5'-TGCCTCCAATCCTAAAGCTTACCAAAAG-3'），使用T7E I酶切鑒定大片段敲除效率。

1.2.6 熒光定量PCR 在CSN2第七號(hào)外顯子設(shè)計(jì)熒光定量PCR檢測(cè)引物（F：5'-ACAGCCTCCCACAAAA-CATC；R：5'-AAGACTGGACCAGAGGCAGA-3'），分析不同敲除載體組合轉(zhuǎn)染組細(xì)胞CSN2 mRNA表達(dá)情況，反應(yīng)體系為20.0 μL：上下游引物各0.5 μL、cDNA模板2.0 μL、2×QuantiNovaTMSYBR?Green PCR Mix 10.0 μL和ddH2O 7.5 μL。反應(yīng)程序如下：95℃ 2 min；95℃ 5 s，60℃ 10 s，72℃ 15 s，45個(gè)循環(huán)；60℃-94℃熔解曲線。

1.2.7 細(xì)胞免疫熒光染色 接種細(xì)胞于24孔板中，待其匯合度達(dá)30%-40%，經(jīng)固定及透析處理后，使用5%脫脂奶粉封閉30 min，加入1∶300稀釋一抗（Rabbit Anti-Beta casein），4℃過(guò)夜孵育，以1∶500稀釋二抗（Mouse Anti-rabbit-Lg G），避光作用2 h，DAPI染核并于熒光顯微鏡下觀察、拍照，使用Image J對(duì)熒光圖片進(jìn)行自動(dòng)熒光定量分析。

2 結(jié)果

2.1 PX330-eGFP-sgRNA載體構(gòu)建

使用各Oligo F與PX330-檢（R：5'-CGGGTACCTCTAGAGCCATT-3'）進(jìn)行菌液PCR，得一條大小為196 bp的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，將正確菌落送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與sgRNA序列完全匹配，表明sgRNA打靶載體構(gòu)建成功（圖1）。

2.2 敲除效率鑒定

按5 μg DNA與10 μL脂質(zhì)體混合轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后經(jīng)流式分選儀分選細(xì)胞，提取細(xì)胞基因組DNA，PCR擴(kuò)增靶點(diǎn)基因后送測(cè)序，使用Chromas觀察靶點(diǎn)處圖譜，結(jié)果（圖2）表明sgRNA T1、sgRNA T3 及sgRNA E1、sgRNA E2均發(fā)揮出切割作用，即峰圖靶點(diǎn)處出現(xiàn)不同程度的疊峰，sgRNA T2作用靶點(diǎn)圖譜未出現(xiàn)任何疊峰，可能是未發(fā)揮作用或發(fā)揮作用后經(jīng)過(guò)了正確的修復(fù)。

使用T7E I酶切鑒定各sgRNA敲除效率，突變條帶所占百分比用Gel-Pro analyzer 凝膠成像軟件分析灰度值，切出多條條帶可大致反映突變效率，其sgRNA 敲除效率分別為34.9%、1.7%、28.9%、2.9%和25.9%（圖3）。

圖1 Oligo退火產(chǎn)物連接PX330-eGFP菌落PCR電泳圖

單克隆測(cè)序結(jié)果與PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果相吻合，其中堿基突變范圍在2-31 bp之間，結(jié)果（表2）表明sgRNA T1和sgRNA E2具有較高敲除效率。

2.3 Western blot檢測(cè)

分別提取PX330-eGFP-sgRNA T轉(zhuǎn)染細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞CSN2表達(dá)情況，結(jié)果（圖4）顯示sgRNA T2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞CSN2有表達(dá)，與測(cè)序結(jié)果吻合，表明sgRNA T2 無(wú)效，而sgRNA T1與sgRNA T3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞CSN2未表達(dá)，表明sgRNA T1與sgRNA T3能有效敲除奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞CSN2基因。

圖2 奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞CSN2靶基因PCR產(chǎn)物測(cè)序圖譜

圖3 T7E I酶切測(cè)效圖

2.4 PX330-Neo-sgRNA載體構(gòu)建

使用Oligo-CSN2-E8-F1與PX330-檢-R進(jìn)行菌液PCR，得一條大小為191 bp特異性條帶（圖5），與預(yù)期結(jié)果一致，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證成功連入后，命名為PX330-Neo-sgRNA E1。

2.5 長(zhǎng)片段CSN2敲除細(xì)胞篩選

使用PX330-eGFP-sgRNA T1與PX330-Neo-sgRNA E1及PX330-eGFP-sgRNA E1兩兩組合（eGFP+ Neo，eGFP+ eGFP）轉(zhuǎn)染細(xì)胞（圖6）。使用T7E I酶切鑒定混合轉(zhuǎn)染sgRNA敲除效率，突變條帶所占百分比用Gel-Pro analyzer 凝膠成像軟件分析灰度值，其敲除效率分別為：16.2%和13%，擴(kuò)增目的基因后凝膠成像檢測(cè)（圖7）發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)一條非特異性條帶，說(shuō)明雙載體轉(zhuǎn)染奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞，能有效對(duì)CSN2基因大片段（最長(zhǎng)7 760 bp）進(jìn)行敲除（圖8）。

表2 奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞CSN2靶點(diǎn)處DNA序列的結(jié)構(gòu)示意圖

圖4 Western blot鑒定CSN2

圖5 Oligo退火產(chǎn)物連接PX330菌落PCR電泳圖

圖6 轉(zhuǎn)染及藥篩細(xì)胞圖（100×）

圖7 T7E I酶切測(cè)效圖

2.6 熒光定量PCR檢測(cè)

使用CSN2-mRNA-F/R引物進(jìn)行定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，兩種不同組合方式獲得的細(xì)胞 CSN2在mRNA水平上的表達(dá)存在明顯差異（圖9）。其中eGFP+Neo組合獲得的細(xì)胞CSN2在mRNA水平表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明eGFP+Neo組比eGFP+eGFP組能獲得更高的陽(yáng)性細(xì)胞率。

2.7 免疫熒光檢測(cè)

采用免疫熒光法對(duì)雙載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行染色（圖10），使用Image J圖像分析軟件對(duì)細(xì)胞CSN2表達(dá)情況進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果（圖11）表明eGFP+Neo組合細(xì)胞CSN2表達(dá)明顯少于eGFP+eGFP組（P<0.05）。說(shuō)明eGFP+Neo組合能提高突變細(xì)胞在正常細(xì)胞中的比例。

圖8 Cas9重組蛋白介導(dǎo)的GFFs大片段CSN2 基因敲除

圖9 各組細(xì)胞CSN2 mRNA表達(dá)比較

3 討論

圖 10 細(xì)胞熒光染色圖（100×）

圖 11 細(xì)胞CSN2表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖

CSN2是酪蛋白家族中的主要成員之一，約占動(dòng)物乳汁酪蛋白總量的80%，該蛋白能與其他酪蛋白結(jié)構(gòu)形成膠團(tuán)，影響動(dòng)物乳汁物理性質(zhì)［17］，對(duì)其在乳汁中高效表達(dá)的特性進(jìn)行深入研究，將有助于改善重組蛋白在動(dòng)物乳汁中高效特異性表達(dá)等問(wèn)題。早期研究基因功能的主要方法有同源重組（Homologous recombination，HR）、鋅指核酸酶（Zincfinger nucleases，ZFNs）及轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）技術(shù)等，因其存在諸多問(wèn)題，如打靶效率低、技術(shù)難度大及載體構(gòu)建復(fù)雜等，難以大范圍推廣使用。新型基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)借助在靶點(diǎn)處產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（Doublestrand breaks，DSB），通過(guò)非同源末端連接（Non-homologous end joining，NHEJ）修復(fù)機(jī)制修復(fù)DSBs，引發(fā)切割位點(diǎn)DNA堿基插入或缺失，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除的目的，該技術(shù)因簡(jiǎn)易、高效、低成本等優(yōu)勢(shì)［18，19］，已被成功應(yīng)用于小鼠、大鼠、斑馬魚、果蠅等多種模式動(dòng)物，包括基因功能［20］、遺傳疾病治療［21］等研究。

本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞CSN2基因靶位點(diǎn)處引入突變，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)發(fā)揮基因編輯的效率與靶序列sgRNA構(gòu)成有關(guān)［22，23］。本實(shí)驗(yàn)分別選擇5'-TN（19）NGG與5'-CN（19）NGG兩種sgRNA類型，通過(guò)T7E I酶切實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)sgRNA T1與sgRNA E1具有較高基因編輯效率，分別為34.9%和25.9%，該sgRNA類型為5'-TN（19）NGG，而sgRNA T2未表現(xiàn)出基因編輯作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明5'-TN（19）NGG類型sgRNA具有較高基因編輯效率，與前人報(bào)道類似［24］。相同類型sgRNA表現(xiàn)出不同的基因編輯效率，可能與sgRNA對(duì)靶序列的結(jié)合能力有關(guān)。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)靶位點(diǎn)編輯會(huì)引起多種形式突變，如堿基缺失、堿基增加或替換等［25，26］，本研究靶點(diǎn)突變類型主要為堿基缺失，部分為堿基替換。研究發(fā)現(xiàn)各sgRNA引起靶點(diǎn)部分堿基缺失數(shù)均為3的非整數(shù)倍，造成蛋白無(wú)法正常被翻譯，通過(guò)移碼突變實(shí)現(xiàn)CSN2基因真正意義的敲除。通常CRISPR/Cas9系統(tǒng)造成DSBs所引起的NHEJ，使我們無(wú)法獲得全部基因功能，例如，長(zhǎng)鏈非編碼區(qū)RNA（Long non-coding RNAs，lncRNA）功能［27］、框內(nèi)突變［28］等。本實(shí)驗(yàn)利用雙載體轉(zhuǎn)染方案，首次驗(yàn)證CRISPR/Cas9系統(tǒng)在奶山羊細(xì)胞水平長(zhǎng)片段基因編輯的有效性，敲除長(zhǎng)度長(zhǎng)達(dá)7 760 bp，通過(guò)T7E I酶切實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)eGFP+Neo組與eGFP+ eGFP組基因突變率分別為16.2%和13%，突變率處于較低水平，造成這一現(xiàn)象的原因有待進(jìn)一步研究，不過(guò)該方法有效降低假陽(yáng)性細(xì)胞，為全面深入研究CSN2基因?qū)δ躺窖蛎谌樾阅苎芯刻峁┪镔|(zhì)基礎(chǔ)。

在長(zhǎng)片段基因修飾轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備過(guò)程中，通常使用打靶早期胚胎獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，經(jīng)過(guò)復(fù)雜繁程序篩選突變個(gè)體，而本實(shí)驗(yàn)利用載體篩選特異性，將eGFP基因與含Neo基因的敲除載體結(jié)合，轉(zhuǎn)染奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞，挑陽(yáng)性單克隆細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，解決了制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物周期長(zhǎng)，篩選陽(yáng)性動(dòng)物繁瑣等問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)獲得敲除CSN2基因奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞，為制備敲除CSN2奶山羊提供材料。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)成功利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞CSN2基因靶位點(diǎn)處引入突變，其突變率最高可達(dá)34.9%，首次在奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)7 760 bp基因長(zhǎng)片段的敲除，驗(yàn)證該系統(tǒng)對(duì)奶山羊基因編輯的有效性，并優(yōu)化大片段陽(yáng)性細(xì)胞制備方案，獲得CSN2基因敲除的細(xì)胞為制備CSN2基因敲除奶山羊提供了核供體。

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（責(zé)任編輯 朱琳峰）

CRISPR/Cas9 System-mediated CSN2 Gene Knock-out for Preparation of Goat Fetal Fibroblasts Mutation Cells

JIA Qi-peng1SHEN Pei-lei2ZHANG huan1ZHANG Yong1，2
（1. College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070；2. College of Life Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070）

To study the effects of beta casein（CSN2）on lactation performance of goat，the CSN2 gene of goat fetal fibroblast（GFFs）were knocked out by CRISPR/Cas9 system for providing the nuclear donors for the construction of transgenic animal. Five sgRNA targeting sites（T1，T2，T3，E1，and E2）were designed for CSN2 targeting at second and eighth exons and ligated to vector PX330-eGFP，thus PX330-eGFP-sgRNA expression vector was constructed. The knockout efficiency was evaluated by T7E I enzyme digestion experiment. Moreover，the sgRNA with the high knock-out efficiency of eighth exons was selected for constructing the PX330-Neo-sgRNA expression vector. Then the PX330-eGFP-sgRNA T and PX330-eGFP-sgRNA E combined with PX330-Neo-sgRNA E were transfected into cells，and mutant cells with CSN2 knock-out were obtained by flow sorting and G418 screening. The expression of CSN2 in the transfected cell was measured by Western blot. Sequencing results showed that the sgRNA was correctly ligated to the PX330 expression vector，T7E I digestion experiments showed that the knock-out efficiency of sgRNA T1 and sgRNA E2 was 34.9% and 25.9%，respectively. The proportion of CSN2 knock-out cell in eGFP+Neo transfection group was significantly higher than that in eGFP+eGFP transfection group（P<0.05）. In summary，we draw the conclusion that CRISPR/Cas9 system would be efficiently applied to the gene editing of GFFS and the targeting mutation cell will be of the potential resourse of nuclear donor in generating CSN2 gene knock-out goat.

milk goat；CRISPR/Cas9 system；knock-out；β-casein

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0218

2017-03-21

蘭州市科技局創(chuàng)新人才重點(diǎn)項(xiàng)目（2015-RC-7）

賈啟鵬，男，碩士研究生，研究方向：獸醫(yī)產(chǎn)科；E-mail：jia_qipeng@126.com

張勇，男，博士生導(dǎo)師，研究方向：獸醫(yī)產(chǎn)科學(xué)和發(fā)育生物學(xué)；E-mail：zhychy@163.com