郭小倩，沈靜茹，沙 濤，章冰娜，舒亞玲，雷新友

(中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 分析化學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074)

高效液相色譜手性固定相法拆分山莨菪堿

郭小倩，沈靜茹*，沙 濤，章冰娜，舒亞玲，雷新友

(中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 分析化學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074)

以雙[-6-氧-(-3-脫氧檸檬酸單脂-4)]-β-環(huán)糊精鍵合全多孔型硅珠為HPLC手性固定相，以甲醇和三氟乙酸-三乙胺緩沖液為流動(dòng)相，探究流動(dòng)相比例、緩沖液濃度、緩沖液pH值、檢測(cè)波長(zhǎng)、色譜柱溫和流速等條件對(duì)山莨菪堿二個(gè)外消旋體拆分效果的影響。在最佳分離條件(三氟乙酸濃度2mmol/L，pH值4.1，V甲醇∶V緩沖液=50%∶50%，流動(dòng)相流速為0.5 mL/min，色譜柱溫20℃，檢測(cè)波長(zhǎng)235nm)下山莨菪堿混合物被拆分為二個(gè)外消旋體，實(shí)現(xiàn)了基線分離，Rs達(dá)4.20；并得到了四個(gè)對(duì)映異構(gòu)體拆分的結(jié)果。

山莨菪堿；手性分離；雙[-6-氧-(3-脫氧檸檬酸單酯-4)]-β-環(huán)糊精；高效液相色譜手性固定相

以環(huán)糊精(CD)及其衍生物作為手性選擇劑在高效液相色譜手性固定相中實(shí)現(xiàn)藥物拆分仍舊是目前非常重要的工具[1]。環(huán)糊精獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)，同時(shí)擁有疏水性空腔和親水性邊緣，對(duì)手性拆分十分有利[2]。 β-環(huán)糊精衍生物更是具有優(yōu)良的選擇性和廣泛的分離范圍[3]。山莨菪堿(Anisodamine)，含兩個(gè)手性中心，是一種作用于自主神經(jīng)系統(tǒng)的抗膽堿藥物[4]。在臨床方面，山莨菪堿對(duì)過(guò)敏性休克、急性腎炎導(dǎo)致的合并心力衰竭、突發(fā)闌尾炎、高血壓導(dǎo)致的腦部疾病甚至敵敵畏中毒等均取得了較好療效，另外對(duì)于治療美尼爾氏綜合征、炮震性耳聾、妊娠中毒癥、胰腺炎、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、顱腦外傷等疾患亦有不同程度的療效[5]。因其對(duì)多種疾患的良好治療效果，使得山莨菪堿對(duì)映體的分離研究十分必要[6]，Yang L M等人用ZORBAX Eclipse XDB-C18 柱將山莨菪堿拆分為兩個(gè)外消旋體，然后用Daicel 的CHIRALPAK AD-H柱(在5μm粒徑硅珠表面涂覆直鏈淀粉衍生物手性柱)在液相色譜中分離了山莨菪堿的兩對(duì)異構(gòu)體。本文用雙 [-6-氧-(3-脫氧檸檬酸單酯-4)]-β-CD鍵合硅珠手性HPLC固定相，實(shí)現(xiàn)了山莨菪堿外消旋體混合物的拆分，在一根HPLC手性柱上同時(shí)將山莨菪堿拆分為二個(gè)外消旋體，達(dá)到基線分離，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了山莨菪堿四個(gè)對(duì)映異構(gòu)體拆分的結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀UItimate3000(賽默飛世爾科技有限公司)，超聲波清洗器(寧波科生儀器廠，As3120型)；酸度計(jì)(上海偉業(yè)儀器廠，ZD-2型)；電磁攪拌器(上海華光儀器儀表廠，CJ-1型)；山莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究所)；其它試劑均為分析純。

1.2 樣品前處理及實(shí)驗(yàn)條件

配制濃度4.2×10-4mol/L山莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾。將市售99.5%三乙胺與三氟乙酸配制成不同pH值的緩沖溶液，并與甲醇按比例混合作為流動(dòng)相。流動(dòng)相分別用0.22μm水系膜和有機(jī)膜過(guò)濾，脫氣，備用。

色譜柱：自制雙[-6-氧-(-3-脫氧檸檬酸單脂-4)]-β-環(huán)糊精鍵合硅珠固定相HPLC手性柱(150 mm×Φ4.6mm)；甲醇與三氟乙酸(濃度2mmoL/L)緩沖液為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)235nm，流速0.5mL/min，進(jìn)樣量20μL，柱箱溫度20℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 探究緩沖液pH值變化對(duì)山莨菪堿分離情況的影響

以V甲醇∶V三氟乙酸-三乙胺=50%∶50%，在1.2的色譜條件下，山莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)品濃度為4.2×10-4mol/L，緩沖液pH值在3.0～6.7范圍變化。結(jié)果示例如圖1所示，pH值3.0時(shí)，山莨菪堿混合物二外消旋體有較好分離，在pH值為4.1時(shí)，水峰干擾??；隨著酸度減小，pH值達(dá)到6.0時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)分離出多個(gè)峰，存在多個(gè)對(duì)映體的分離。

a)pH值3.0；b)pH值4.1；c)pH值6.0

圖1 不同pH值條件下的HPLC圖

Fig.1 HPLC chromatograms under different pH conditions

2.2 探究流動(dòng)相配比變化對(duì)山莨菪堿分離情況的影響

以三氟乙酸-三乙胺緩沖液pH值為4.1，在1.2色譜條件下，山莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)品濃度為4.2×10-4mol/L，調(diào)節(jié)V甲醇∶V緩沖液分別為60%∶40%，50%∶50%，40%∶60%，30%∶70%，20%∶80%，拆分結(jié)果示例如圖2所示，結(jié)果顯示，緩沖體系中V甲醇∶V緩沖液的變化對(duì)分離結(jié)果影響較大，當(dāng)流動(dòng)相中甲醇比例較高，占60%時(shí)，有分離跡象，但峰形對(duì)稱(chēng)性不高，分離度不佳；隨著甲醇含量降至50%時(shí)，山莨菪堿二個(gè)外消旋體混合物達(dá)到較好分離，且峰形對(duì)稱(chēng)；隨著甲醇含量繼續(xù)降低，對(duì)映體的分離逐步實(shí)現(xiàn)。

圖2 不同流動(dòng)相配比條件下的HPLC圖

Fig.2 HPLC chromatograms under different mobile phase ratios

2.3 精密度和線性范圍

在山莨菪堿混合物二個(gè)外消旋體最佳分離條件下將濃度為4.2×10-4mol/L的山莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)進(jìn)樣7次，計(jì)算得到二個(gè)外消旋體的保留時(shí)間tR、峰面積A、峰高h(yuǎn)和分離度Rs各參數(shù)的RSD分別為0.16%、0.04%、1.42%、0.16%，1.76%、0.11%和1.82%，分離度RS值均在4.29至4.60之間，說(shuō)明二個(gè)外消旋體色譜峰保留時(shí)間的重現(xiàn)性最佳，峰面積重現(xiàn)性也優(yōu)于峰高的重現(xiàn)性，而且后峰各項(xiàng)參數(shù)的重現(xiàn)性都優(yōu)于前峰，說(shuō)明溶劑對(duì)前峰有一定影響，分離度的重現(xiàn)性也低于2%。 山莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度在2.10×10-4～1.05×10-3mol/L范圍內(nèi)，分別考察峰高、峰面積與濃度的線性關(guān)系，結(jié)果顯示前峰峰面積-濃度線性方程為y=2884x-2.518，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9894；前峰峰高-濃度線性方程為y=20038x-2.212，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9869；后峰峰面積-濃度線性方程為y=3911x-0.528，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9935；后峰峰高-濃度線性方程為y=23623x-3.629，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9955。說(shuō)明山莨菪堿二個(gè)外消旋體在該濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，后峰的線性關(guān)系優(yōu)于前峰。

2.4 對(duì)比試驗(yàn)

圖3 對(duì)比試驗(yàn)

Fig.3 The comparison spectrum在1.2的色譜條件下以V甲醇∶V緩沖液=20%∶80%，緩沖液pH值為4.1，用4.2×10-4mol/L山莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)品與溶劑水作對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示，圖3a為山莨菪堿的四個(gè)異構(gòu)體完全分離色譜圖，圖3b顯示溶劑(水)峰對(duì)山莨菪堿的分離干擾有限。

3 總結(jié)

使用自制的以雙[-6-氧-(3-脫氧檸檬酸單酯-4)]-β-環(huán)糊精為手性選擇劑的HPLC色譜柱，在Ultimate3000智能型高效液相色譜儀上對(duì)山莨菪堿的拆分結(jié)果是有效的，獲得了山莨菪堿混合物的二個(gè)外消旋體手性分離的最佳分離條件，考察精密度，各參數(shù)RSD均小于2%。在2.10×10-4～1.05×10-3mol/L范圍內(nèi)，山莨菪堿的二個(gè)外消旋體濃度與峰高和峰面積有線性相關(guān)性，在甲醇與緩沖液體積比為20∶80, 其他條件不變時(shí)，可實(shí)現(xiàn)山莨菪堿的四個(gè)對(duì)映異構(gòu)體的拆分，在一根色譜柱上同時(shí)實(shí)現(xiàn)了山莨菪堿二個(gè)外消旋體和四個(gè)對(duì)映異構(gòu)體的分離，為高效液相色譜手性固定相法拆分山莨菪堿提供了新方法。

[2] Xia L,Zhou Z M,Di X,et al.Enantiomeric separation in high-performance liquid chromatography using novel β-cyclodextrin derivatives modified by R-configuration groups as chiral stationary phases[J]. Talanta,2011,84(4):1080-1092.

[3] Li L,Zhang M,Wang Y,et al.Preparation of chiral oxazolinyl-functionalized β-cyclodextrin-bonded stationary phases and their enantioseparation performance in high-performance liquid chromatography[J].Journal of separation science,2016,39(21):4136-4146.

[4] Bai S,Fu X,Gu X,et al.Intracoronary administration of different doses of anisodamine in primary percutaneous coronary intervention: protective effect in patients with ST-segment elevation myocardial infarction[J].Coronary Artery Disease,2016,27(4):302-310.

[5] Eisenkraft A,Falk A.Possible role for anisodamine in organophosphate poisoning[J].British Journal of Pharmacology,2016,173(11):1719-1727.

[6] Yang L M,Xie Y F,Chen H Z,et al.Diastereomeric and enantiomeric high-performance liquid chromatographic separation of synthetic anisodamine[J].Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis,2007,43(3):905-909.

(本文文獻(xiàn)格式：郭小倩，沈靜茹，沙 濤，等.高效液相色譜手性固定相法拆分山莨菪堿[J].山東化工,2017,46(7):110-111,114.)

Separate Anisodamine Enantiomers by the Chial High Performance Liquid Chromatography Stationary Phase

GuoXiaoqian，ShenJingru*，ShaTao，ZhangBingna，ShuYaling，LeiXinyou

(Key Laboratory of Analytical Chemisty of the State Ethnic Affair Commission, College of Chemistry and Materials Science, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

Anisodamine enantiomers have been separated by a chiral chromatographic column with bis-[6-oxygen-(3-deoxycitric acid monoester-4)]-β-cyclodextrin. High performance liquid chromatography (HPLC) was used to explore the optimum resolution conditions of anisodamine racemic mixture. The optimum conditions: detection wavelength 235nm, pH4.1, trifluoroacetic acid concentration is 2.0mmol/L, Vmethanol∶ Vbufferis 50%∶50%, the flow rate is 0.5mL/min, and the temperature of column is 20℃. Under this condition, the anisodamine racemic mixtures have been separated andRsis 4.20，and a HPLC method for four enantiomorphism isomers separation results has been developed.

anisodamine;enantioseparation;bis-[6-oxygen-(3-deoxycitric acid monoester-4)]-β-cyclodextrin; HPLC chiral stationary phase

2017-01-08

中央高校基金資助項(xiàng)目(CZW14053)

郭小倩(1990—)，女，湖北荊州人，碩士研究生，主要從事手性藥物拆分研究。

O657.7+2

A

1008-021X(2017)07-0110-02