謝紅艷，萬(wàn)魯長(zhǎng)，黃春燕，劉國(guó)霞，Jean-Fran?ois Picimbon，宮志遠(yuǎn)*

(1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，農(nóng)業(yè)部廢棄物基質(zhì)化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省農(nóng)業(yè)面源污染防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250100)

煙粉虱MED隱種氣味結(jié)合蛋白基因BtabOBP2和BtabOBP4的cDNA克隆及原核表達(dá)

謝紅艷1，萬(wàn)魯長(zhǎng)1，黃春燕1，劉國(guó)霞2，Jean-Fran?ois Picimbon2，宮志遠(yuǎn)1*

(1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，農(nóng)業(yè)部廢棄物基質(zhì)化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省農(nóng)業(yè)面源污染防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250100)

采用RT-PCR和RACE技術(shù)成功克隆煙粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)氣味結(jié)合蛋白(odorant binding protein, OBP)基因BtabOBP2和BtabOBP4的cDNA全長(zhǎng)。BtabOBP2(GenBank 登錄號(hào)：AIS71883)和BtabOBP4(GenBank 登錄號(hào)：AIS71884)的cDNA序列全長(zhǎng)分別為1107 bp和874 bp，完整開(kāi)放閱讀框(ORF)分別為744 bp和429 bp，分別編碼247和142氨基酸，BtabOBP4有6個(gè)保守的半胱氨酸，屬于典型OBP，而BtabOBP2除了具有典型OBP的6個(gè)半胱氨酸，增加了3個(gè)保守的半胱氨酸，屬于Plus-C OBP。將得到的BtabOBP2和BtabOBP4重組到原核表達(dá)載體pET30a(+)，轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。采用親和層析和凝膠過(guò)濾層析純化融合蛋白，并進(jìn)行Western blot 分析。結(jié)果顯示，BtabOBP2和BtabOBP4融合蛋白在大腸桿菌中均有可溶性表達(dá)，Western blot 結(jié)果證實(shí)所表達(dá)的融合蛋白確實(shí)為目的蛋白。BtabOBP2融合蛋白在SDS-PAGE中的表觀分子量比預(yù)測(cè)的分子量大了6.53 kDa，用重組腸激酶切掉6×His標(biāo)簽后，目的蛋白的表觀分子量與預(yù)測(cè)分子量相近，偏差降低，說(shuō)明6×His標(biāo)簽是造成融合蛋白表觀分子量偏差的原因。本研究明確了煙粉虱氣味結(jié)合蛋白基因BtabOBP2和BtabOBP4的核苷酸、氨基酸序列特征，并成功進(jìn)行了原核表達(dá)和純化，為進(jìn)一步研究這兩個(gè)OBP基因的分子結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。

煙粉虱；氣味結(jié)合蛋白；基因克隆；原核表達(dá)；純化

昆蟲靈敏的嗅覺(jué)是其生存與繁衍的關(guān)鍵，在昆蟲覓食、尋找配偶、交配、產(chǎn)卵、躲避捕食者等行為中發(fā)揮重要作用(Larssonetal., 2004)。昆蟲對(duì)化學(xué)信號(hào)的感受主要通過(guò)嗅覺(jué)感受器內(nèi)的可溶性蛋白結(jié)合并運(yùn)輸外界疏水性的氣味分子通過(guò)淋巴液到達(dá)嗅覺(jué)神經(jīng)樹突膜上的嗅覺(jué)受體，將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為神經(jīng)電信號(hào)并傳向中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起昆蟲的行為反應(yīng)。參與昆蟲嗅覺(jué)識(shí)別的相關(guān)功能蛋白包括氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)、嗅覺(jué)受體(olfactory receptors, ORs)、氣味降解酶(odorant degrading enzymes, ODEs)和感覺(jué)神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins, SNMPs)等(Vogtetal., 1985, 2009; Wanneretal., 2004)，其中氣味結(jié)合蛋白是昆蟲專一性識(shí)別外界氣味物質(zhì)的關(guān)鍵作用因素(Vogt and Riddiford, 1981)。昆蟲OBPs是一類水溶性小分子量酸性蛋白，其典型特征是在二級(jí)序列中存在6個(gè)保守的半胱氨酸，分別交叉形成3個(gè)二硫鍵以對(duì)蛋白的三維結(jié)構(gòu)起支撐作用(Pelosietal., 2006)。昆蟲中第一個(gè)OBP是1981年在多音天蠶Antheraeapolyphemus觸角中被發(fā)現(xiàn)，此后多種OBPs在雙翅目、膜翅目、直翅目、同翅目等昆蟲中陸續(xù)被鑒定(Pelosi and Maida, 1995; Zhangetal., 2009; Zhouetal., 2010)。

煙粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)屬于半翅目Hemiptera粉虱科Aleyrodidae，是一種世界性重要農(nóng)業(yè)害蟲，其寄主范圍廣，通過(guò)直接刺吸植物汁液、分泌蜜露誘發(fā)霉污病、傳播植物病毒等方式危害植物(Jones, 2003; De Barroetal., 2011)。煙粉虱是一個(gè)至少由36個(gè)隱種組成的物種復(fù)合體(Huetal., 2011；劉銀泉和劉樹生，2012)，其中MED (Mediterranean)隱種(同“Q型煙粉虱”)和MEAM1 (Middle East-Asia Minor 1)隱種(同“B型煙粉虱”)入侵性最強(qiáng)、危害最大，MED隱種在中國(guó)大部分地區(qū)已經(jīng)取代MEAM1隱種成為優(yōu)勢(shì)種(Panetal., 2011; Leeetal., 2013)。煙粉虱主要依靠化學(xué)防治，使其已對(duì)多種化學(xué)殺蟲藥劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，而且大量使用化學(xué)藥劑還加劇了環(huán)境污染和對(duì)非靶標(biāo)生物的殺傷作用，急需開(kāi)發(fā)更為有效的無(wú)公害防治技術(shù)。通過(guò)干擾靶標(biāo)昆蟲的嗅覺(jué)識(shí)別來(lái)對(duì)其進(jìn)行有效控制的技術(shù)在許多害蟲的防治中已經(jīng)得到應(yīng)用(Lealetal., 2003; Sunetal., 2011)。煙粉虱對(duì)不同寄主植物上的取食和產(chǎn)卵有明顯的選擇性(林克劍等，2008；張永軍等，2003)，這種寄主選擇性與不同寄主植物揮發(fā)物質(zhì)差異密切相關(guān)。研究表明，1,8-桉樹腦對(duì)煙粉虱MEAM1隱種有顯著吸引作用(曹鳳琴等，2008)，野生番茄中的姜烯、姜黃烯、p-傘化烴和α-松油烯對(duì)煙粉虱MED隱種有趨避行為(Bleekeretal., 2009)。氣味結(jié)合蛋白OBPs在煙粉虱對(duì)寄主植物揮發(fā)性物質(zhì)的識(shí)別結(jié)合過(guò)程中具有重要作用，是設(shè)計(jì)嗅覺(jué)引誘劑的良好靶標(biāo)。目前，煙粉虱OBPs相關(guān)的報(bào)道較少。王然等(2016)克隆了煙粉虱MED隱種的氣味結(jié)合蛋白基因OBP8，原核表達(dá)重組蛋白，并分析了其與植物揮發(fā)物的結(jié)合特性。張嵐(2011)從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中預(yù)測(cè)了煙粉虱的4條OBPs序列，多為序列片段，且未做試驗(yàn)驗(yàn)證。本研究根據(jù)已報(bào)道的煙粉虱OBP基因序列片段信息設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR和RACE技術(shù)對(duì)煙粉虱OBP2和OBP4基因的cDNA全長(zhǎng)序列進(jìn)行了克隆和分析，并構(gòu)建表達(dá)載體，進(jìn)行了原核表達(dá)和蛋白純化，為進(jìn)一步研究OBPs的結(jié)構(gòu)和生理功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

煙粉虱最初從山東壽光和濟(jì)南田間的茄子上采集，基于線粒體細(xì)胞色素氧化酶I基因(mitochondrial cytochrome oxidase I,mtCOI)鑒定生物型后(Chuetal., 2011)，在人工氣候箱內(nèi)以棉花GossypiumhirsutumL.(品種：魯棉研21)為寄主進(jìn)行飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度26℃，相對(duì)濕度60%-80%，光周期16L ∶8D。

1.2 主要試劑

SMARTer RACE cDNA Amplification Kit購(gòu)自Clontech公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、預(yù)染蛋白Marker 10-170 kDa(26616)購(gòu)自Fermentas公司；pEASY-T1 Cloning Kit、Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA ligase、限制性內(nèi)切酶BamHI 和XhoI、Trizol、DL2000 DNA Marker、Kanamycin、X-Gal、IPTG等均購(gòu)自Takara公司；所用引物由Invitrogen公司合成；表達(dá)載體pET30a(+)為本實(shí)驗(yàn)室保存。DNA膠回收試劑盒、HRP-DAB底物顯色試劑盒購(gòu)自北京天根生物科技有限公司；Pierce BCA 蛋白定量分析試劑盒購(gòu)自Thermo公司。

1.3 煙粉虱OBPs基因的克隆

取60頭煙粉虱MED隱種成蟲，用Trizol法提取總RNA，并用DNaseⅠ除去殘留的基因組DNA，經(jīng)Eppendorf核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA的質(zhì)量和濃度，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一鏈。同時(shí)按照SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 操作手冊(cè)，合成3′和5′ RACE-ready cDNA 第一鏈。根據(jù)GenBank中的煙粉虱OBP基因序列片段(登錄號(hào)分別為：JN088199和JN088200)設(shè)計(jì)并合成引物(表1)。

3′和5′ RACE PCR 反應(yīng)條件均為：94℃變性3 min，接著進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件為94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 1 min，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用DNA凝膠回收試劑盒回收純化，測(cè)定濃度。純化后的片段與pEasy T1載體連接，再轉(zhuǎn)化到Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，然后涂布在含有Kanamycine/X-gal/IPTG的LB平板上，37℃培養(yǎng)16 h。挑取白色單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。挑選陽(yáng)性克隆送往山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心進(jìn)行測(cè)序。序列測(cè)定采用測(cè)序儀ABIPRISMTM3730XL Sequencer(Perkin Elmer)進(jìn)行，反應(yīng)試劑為BigDye 3.1 Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Perkin Elmer)。將RACE獲得的序列進(jìn)行拼接，得到目的基因的全長(zhǎng)cDNA序列，用在線ORF Finder software(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf/gorf.html)分析開(kāi)放閱讀框，設(shè)計(jì)特異性引物(表1)驗(yàn)證基因。

1.4 序列分析

利用在線Expasy對(duì)序列進(jìn)行翻譯(http://web.expasy.org/translate/)，并預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)(http://web.expasy.org/protparam/)。運(yùn)用在線工具SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)其信號(hào)肽，通過(guò)NCBI中的BLAST進(jìn)行氨基酸序列的同源搜索和比對(duì)。用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)，采用MEGA 5.0通過(guò)Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 原核表達(dá)

根據(jù)煙粉虱BtabOBP2和BtabOBP4成熟肽(不含信號(hào)肽)的編碼序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(表1)，為了便于將目的基因克隆到表達(dá)載體上，上游引物引入BamHI(GGATCC)酶切位點(diǎn)，下游引物引入Xho I(CTCGAG)酶切位點(diǎn)。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，PCR 反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性3 min; 94℃變性30 s, 61℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 35 個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。目的片段回收、純化后，連接到pEASY-T1 載體，再轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR和雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆，將正確的菌液測(cè)序，測(cè)序正確后提取質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI，XhoI雙酶切后，回收目的片段，與經(jīng)同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pET30a(+)相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取酶切和測(cè)序鑒定正確的單克隆于5 mL LB中(含50 μg/mL Kanamycine)37℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日以1 ∶100的比例轉(zhuǎn)接到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600=0.6，加入不同終濃度的IPTG(0.5，1.0，1.5，2.0 mmol/L)，誘導(dǎo)溫度37℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，加入IPTG時(shí)作為取樣的0時(shí)間點(diǎn)，分別在誘導(dǎo)的2和5 h取樣。8000 r/min離心10 min收集菌體，用15% SDS-PAGE電泳分析目的蛋白的表達(dá)情況。

為檢查融合蛋白的可溶性，向誘導(dǎo)后收集的大腸桿菌菌體中加裂解液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑, pH 8.0)，于冰上超聲破碎后，12000 r/min離心10 min收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

表 1 試驗(yàn)中所用引物Table 1 Primers used in this study

注：下劃線表示酶切位點(diǎn)。Note: The restriction site is underlined.

1.6 融合蛋白純化

以優(yōu)化的誘導(dǎo)條件大量誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，加裂解液超聲破碎，12000 r/min離心10 min，將含融合蛋白的上清液泵入Ni-NTA親和柱，用含不同濃度咪唑(20，25，30，100，250和500 mmol/L)的洗脫緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，分部收集。SDS-PAGE電泳檢測(cè)收集的蛋白樣品，將含目的蛋白的組分合并，用3 kDa的超濾管(Millipore)濃縮后，用AKTA purifier UPC-900(GE 公司)進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析(層析柱為Superdex 75 10/300 GL)，進(jìn)一步去除雜蛋白，并將含咪唑的洗脫緩沖液置換成50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)。SDS-PAGE電泳檢測(cè)分部收集的蛋白樣品，將含融合蛋白的組分合并，超濾濃縮。用Pierce BCA 蛋白定量分析試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按比例加入重組腸激酶，切除融合蛋白位于氨基末端的6×His標(biāo)簽，酶切后的蛋白再次過(guò)親和層析柱。純化后的目的蛋白經(jīng)超濾濃縮，測(cè)定濃度后，-70℃保存，備用。

1.7 Western Blot 鑒定

融合蛋白經(jīng)15% SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離，然后經(jīng)半干式轉(zhuǎn)膜儀將蛋白從膠轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。用封閉液(TBST+5%脫脂奶粉)封閉過(guò)夜，TBST洗膜后，加入鼠anti-His 單克隆抗體(用含有0.5%脫脂奶粉的TBST溶液按1 ∶1200的比例稀釋)，室溫反應(yīng)2 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。然后加入TBST(含0.5%脫脂奶粉)稀釋的羊抗鼠IgG-HRP(1 ∶3000)，室溫反應(yīng)2 h，用TBST再洗膜3次，每次10 min。用HRP-DAB底物顯色試劑盒鑒定表達(dá)產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙粉虱BtabOBP2和BtabOBP4基因的cDNA克隆與序列分析

本研究設(shè)計(jì)特異性引物采用RACE技術(shù)，獲得了煙粉虱2個(gè)OBP基因的全長(zhǎng)cDNA序列，分別命名為BtabOBP2和BtabOBP4，并提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)分別為AIS71883和AIS71884。BtabOBP2和BtabOBP4的cDNA全長(zhǎng)分別為1107 bp和874 bp，5′端分別有111 bp和81 bp的非編碼區(qū)，3′端有252 bp和364 bp的非編碼區(qū)，且都有poly A尾。完整開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度分別為744 bp和429 bp，編碼247個(gè)氨基酸和 142個(gè)氨基酸。由在線軟件SignalP 預(yù)測(cè)，2個(gè)OBP基因的N末端分別有22個(gè)氨基酸和19個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的信號(hào)肽(圖1)，BtabOBP2和BtabOBP4成熟蛋白的理論分子量分別為25.03 kDa和13.79 kDa，預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)分別為8.21和8.72。利用DNAMAN軟件對(duì)BtabOBPs和其它昆蟲同源序列進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)(圖2)，結(jié)果顯示， BtabOBP4氨基酸序列中有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基，屬于典型OBP。BtabOBP2與BtabOBP4同源性很低(8.50%)，BtabOBP2氨基酸序列中有14個(gè)半胱氨酸殘基，其中9個(gè)是保守的，除了具有典型OBP的6個(gè)保守的半胱氨酸，增加了3個(gè)半胱氨酸，屬于Plus-C OBP。用MEGA 5.0 通過(guò)Neighbor-Joining法構(gòu)建煙粉虱OBPs與其它昆蟲OBPs系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，bootstrap值為1000。從進(jìn)化樹上可以看出，BtabOBP2和BtabOBP4分別在兩個(gè)大的分支上，但都與同翅目稻飛虱OBPs的進(jìn)化關(guān)系較近。

A

B

圖1 煙粉虱BtabOBP2 (A)和BtabOBP4 (B)的核苷酸及氨基酸序列

注：下劃線部分為信號(hào)肽，方框?yàn)楸Ｊ氐陌腚装彼帷ote: Underlined is signal peptide, and square frame is conserved cysteines.

圖2 煙粉虱BtabOBP2和BtabOBP4與其它昆蟲OBPs氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Amino acid sequence alignment of BtabOBP2 and BtabOBP4 from Bemisia tabaci with OBPs from other insects注：藍(lán)色陰影表示50%以上同源性，黑色陰影表示100%同源性，OBPs來(lái)源及GenBank登錄號(hào)如下。Note: The blue shadow indicates > 50% identity, black shadow indicates 100% identity. The origin of OBPs and their GenBank accession numbers were as follows: BtabOBPs, 煙粉虱 Bemisia tabaci (BtabOBP2: AIS71883; BtabOBP4: AIS71884); ApisOBPs, 豌豆蚜 Acyrthosiphon pisum (ApisOBP6: NP_001153532.1; ApisOBP8: NP_001153534.1); AlinOBPs, 苜蓿盲蝽 Adelphocoris lineolatus (AlinOBP7: ACZ58085.1; AlinOBP12: ACZ58083.1); AalbOBP4, 白紋伊蚊 Aedes albopictus (AFC60566.1); AgosOBPs, 棉蚜 Aphis gossypii (AgosOBP6: AGE97636.1; AgosOBP8: AGE97638.1); AlucOBPs, 綠盲蝽 Apolygus lucorum (AlucOBP1: ADD84665.1; AlucOBP5: AEA07663.1; AlucOBP6: AEA07664.1); CquiOBP, 致倦庫(kù)蚊 Culex quinquefasciatus (XP_001843376.1); DcitOBP, 柑橘木虱 Diaphorina citri (ABG81983.1); DmojOBP, 果蠅 Drosophila mojavensis (XP_001998267.1); LstrOBP3, 灰飛虱 Laodelphax striatella (AEQ19909.1); LlinOBP21, 美國(guó)牧草盲蝽 Lygus lineolaris (AHF71051.1); MperOBP, 桃蚜 Myzus persicae (ACI30682.1); NlugOBP1, 褐飛虱 Nilaparvata lugens (ACI30679.1); RproOBP6, 長(zhǎng)紅錐蝽 Rhodnius prolixus (CAX63265.1); SaveOBP8, 麥長(zhǎng)管蚜 Sitobion avenae (ACX32010.2); SfurOBP7, 白背飛虱 Sogatella furcifera (AHB59659.1); TcasOBP, 赤擬谷盜 Tribolium castaneum (XP_972220.1).

2.2 煙粉虱BtabOBP2和BtabOBP4重組蛋白的表達(dá)、純化和鑒定

SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，BtabOBP4融合蛋白在19 kDa左右有特異性蛋白條帶，和預(yù)期的一致。BtabOBP2融合蛋白在37 kDa左右有特異性蛋白條帶，比預(yù)期的30.47 kDa的分子量大6.53 kDa，偏差達(dá)21%。未插入目的基因的空質(zhì)粒和未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET30a-BtabOBP2和pET30a-BtabOBP4轉(zhuǎn)BL21(DE3)的菌液在相應(yīng)的位置都沒(méi)有產(chǎn)生特異性條帶(圖4)。BtabOBP2和BtabOBP4融合蛋白在上清和包涵體中都有表達(dá)(圖4)，且在上清中表達(dá)量較高。

用Ni-NTA親和層析柱純化上清中的融合蛋白，再用凝膠過(guò)濾層析柱進(jìn)一步純化、脫鹽后，超濾管濃縮。以鼠anti-His單克隆抗體為一抗，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行Western blot 分析，BtabOBP2和 BtabOBP4融合蛋白在相應(yīng)的位置都有單一非彌散性免疫反應(yīng)帶(圖4-B)，表明所表達(dá)的融合蛋白確實(shí)為目的蛋白。為驗(yàn)證BtabOBP2融合蛋白在SDS-PAGE中的表觀分子量偏大與6×His標(biāo)簽有關(guān)，用重組牛腸激酶切去6×His標(biāo)簽，再進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果切掉His標(biāo)簽的BtabOBP2在SDS-PAGE中的表觀分子量為24 kDa左右，比推導(dǎo)的理論分子量25.68 kDa小了1.68 kD，偏差降低至6.5%(圖4-A，泳道7)。

2.3 誘導(dǎo)表達(dá)條件的篩選

為使BtabOBP2和BtabOBP4大量可溶性表達(dá)，我們對(duì)融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的條件進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)IPTG濃度對(duì)目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)影響不大。BtabOBP4在37℃下誘導(dǎo)5 h的表達(dá)量略少于誘導(dǎo)2 h的表達(dá)量，而誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)BtabOBP2的表達(dá)影響不明顯。篩選出的最佳誘導(dǎo)條件為：溫度為37℃，誘導(dǎo)時(shí)間為2 h，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速為180 rpm，IPTG濃度：BtabOBP2為2 mmol/L，BtabOBP4為1 mmol/L。

圖3 煙粉虱BtabOBP2和BtabOBP4與其它昆蟲氣味結(jié)合蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of BtabOBP2 and BtabOBP4 of Bemisia tabaci and OBPs from other different insect species注：OBPs來(lái)源。Note: Origin species of OBPs: NribOBP2, 萵苣衲長(zhǎng)管蚜 Nasonovia ribisnigri; RpadOBP2, 禾谷縊管蚜 Rhopalosiphum padi; MvicOBP2, 巢菜修尾蚜 Megoura viciae; AglyOBP2和AglyOBP6, 大豆蚜 Aphis glycines; PsalOBP2, 柳粉毛蚜 Pterocomma salicis；其它同圖2,others same to Fig.2。

圖4 pET30a-BtabOBP2和pET30a-BtabOBP4融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化(A)及其Western blot(B)Fig.4 Expression, purification (A)and Western blot (B)of the recombinant proteins pET30a-BtabOBP2 and pET30a-BtabOBP4注：A: M, 蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量; 1, 空載體經(jīng)誘導(dǎo)的BL21(DE3)菌體; 2-8, 分別為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET30a-BtabOBP2和pET30a-BtabOBP4的菌體; 3-9, 分別為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET30a-BtabOBP2和pET30a-BtabOBP4的菌體; 4-10, 分別為純化后的pET30a-BtabOBP2和pET30a-BtabOBP4; 5-11, 分別為pET30a-BtabOBP2和pET30a-BtabOBP4經(jīng)超聲破碎后的上清; 6-12, 分別為pET30a-BtabOBP2和pET30a-BtabOBP4經(jīng)超聲破碎后的沉淀; 7, 腸激酶切掉6×His標(biāo)簽后的pET30a-BtabOBP2; B:1-2, 分別為帶6×His標(biāo)簽的pET30a-BtabOBP2和pET30a-BtabOBP4的Western印記雜交。Note: A: M, Protein molecular weight marker; 1, Induced BL21(DE3)bacteria within pET30a(+)vector; 2-8, Expressed product of pET30a-BtabOBP2 and pET30a-BtabOBP4 without IPTG induction, respectively; 3-9, Expressed product of pET30a-BtabOBP2 and pET30a-BtabOBP4 with IPTG induction; 4-10, Purified pET30a-BtabOBP2 and pET30a-BtabOBP4 protein; 5-11, Supernatant of pET30a-BtabOBP2 and pET30a-BtabOBP4 after sonication; 6-12, Pellet of pET30a-BtabOBP2 and pET30a-BtabOBP4 after sonication; 7, pET30a-BtabOBP2 with 6×His tag excised by enterokinase. B: 1-2, 6×His Western blot of pET30a-BtabOBP2 and pET30a-BtabOBP4.

3 結(jié)論與討論

昆蟲中OBPs按照保守半胱氨酸的數(shù)量和位置分為5種類型：典型OBP、Plus-C OBP、Dimer OBP、Minus-C OBP及非典型OBP。目前已有屬于8個(gè)目的40種昆蟲的OBP得到了分離和克隆(Pelosietal., 2006)。本研究利用RACE技術(shù)，成功獲得了煙粉虱氣味結(jié)合蛋白BtabOBP2和BtabOBP4的cDNA全長(zhǎng)，其中BtabOBP4有6個(gè)保守的的半胱氨酸，符合C1-X15-39-C2-X3-C3-X21-44-C4-X7-12-C5-X8-C6的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(X代表每個(gè)半胱氨酸之間間隔的氨基酸殘基數(shù))，并且第2個(gè)和第3個(gè)半胱氨酸之間有3個(gè)氨基酸，第5個(gè)和第6個(gè)半胱氨酸之間有8個(gè)氨基酸， BtabOBP4屬于典型OBP。BtabOBP2氨基酸序列中有14個(gè)半胱氨酸殘基，與其它昆蟲同源序列的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，其中9個(gè)是保守的，除了具有典型OBP的6個(gè)半胱氨酸C1-C6，增加了3個(gè)半胱氨酸，在C4和C5之間增加了C4a，在C6后面緊挨著一個(gè)脯氨酸P，后面有兩個(gè)半胱氨酸C6a和C6b，在C5和C6之間仍然有8個(gè)氨基酸，C4a和C5之間有9個(gè)氨基酸，BtabOBP2屬于Plus-C OBP。大多數(shù)昆蟲目之間的 OBPs 氨基酸序列同源性很低，甚至在昆蟲屬之間的同源性低于20% (Zhouetal., 2010)。黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中有51個(gè)OBP基因，其中39個(gè)典型OBP的氨基酸序列同源性僅為10%-15% (Graham and Davies, 2002)。本研究中，BtabOBP2與BtabOBP4的同源性非常低，為8.50%。

重組蛋白異源表達(dá)，獲得與天然OBPs一致的活性重組OBPs，進(jìn)行體外的配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)是目前普遍用于研究OBPs功能的方法。本研究構(gòu)建表達(dá)載體, 對(duì)BtabOBP2和BtabOBP4進(jìn)行了原核表達(dá)。本研究在37℃下對(duì)IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)條件的篩選和優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)BtabOBP2和BtabOBP4都有可溶性表達(dá)，IPTG終濃度對(duì)蛋白表達(dá)量影響較少，BtabOBP4隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白表達(dá)量越少，可能與表達(dá)過(guò)程中對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用有關(guān)(Vassilevskietal., 2008)。

本研究中，原核表達(dá)的BtabOBP4融合蛋白在SDS-PAGE中的表觀分子量為19 kDa左右，與計(jì)算出的理論分子量19.23 kDa相符。而BtabOBP2融合蛋白在SDS-PAGE中的表觀分子量為37 kDa左右，與軟件推導(dǎo)的理論分子量30.47 kDa相差6.53 kDa，偏差達(dá)21%，這可能是由于6×His標(biāo)簽造成的偏差(唐威華等，2000)。許多研究者發(fā)現(xiàn)His-tag融合蛋白在SDS-PAGE中表現(xiàn)出的分子量大于其應(yīng)有的分子量(Harwood, 1994; Niu and Guiltinan, 1994; DeMaria and Brewer, 1996; Kim and Chung, 1997)。唐威華等(2000)研究一個(gè)水稻蛋白P73與His-tag融合表達(dá)時(shí)(P73-His)，發(fā)現(xiàn)該融合蛋白在SDS-PAGE中的表觀分子量約為33 kDa，與計(jì)算出的理論分子量19.1 kDa相差很大。然后對(duì)其進(jìn)行C末端氨基酸順序測(cè)定、電噴霧質(zhì)譜分析，結(jié)果證實(shí)其實(shí)際分子量與理論值一致。P73-His融合蛋白經(jīng)酶切去除包括His-tag在內(nèi)的載體蛋白后，其在SDS-PAGE中表觀分子量的偏差大大降低，證實(shí)His-tag是造成P73-His融合蛋白表觀分子量偏大的原因之一，推測(cè)可能是由于組氨酸是堿性氨基酸，帶有正電荷，而His-tag中含有連續(xù)6個(gè)組氨酸，帶有較強(qiáng)的正電荷，降低了蛋白在SDS-PAGE中的泳動(dòng)速率，導(dǎo)致了表觀分子量的變大。本研究中，與pET30a(+)空載體和誘導(dǎo)前相比，BtabOBP2融合蛋白在37 kDa處有明顯較粗的條帶，且Western blot 分析表明該位置的帶確實(shí)是融合His-tag的目的蛋白。用腸激酶切除His-tag后，BtabOBP2蛋白在SDS-PAGE中的表觀分子量為24 kDa左右，與推導(dǎo)的理論分子量相差1.68 kDa，偏差由21%降低至6.5%。因此BtabOBP2融合蛋白在SDS-PAGE中的表觀分子量偏差是His-tag造成的。而SDS-PAGE中表觀分子量偏差的原因除了His-tag作用之外，還與蛋白本身有關(guān)(唐威華等，2000)，BtabOBP4與BtabOBP2屬于不同類型的OBPs，BtabOBP4融合蛋白在SDS-PAGE中的表觀分子量與推導(dǎo)的理論分子量相符。本研究對(duì)煙粉虱BtabOBP2和BtabOBP4基因的克隆和原核表達(dá)，為其結(jié)構(gòu)和功能研究奠定了基礎(chǔ)，對(duì)了解煙粉虱的嗅覺(jué)機(jī)制具有重要意義。

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cDNAcloningandprokaryoticexpressionofodorantbindingproteingenesBtabOBP2andBtabOBP4fromtheBemisiatabaciMEDcrypticspecies

XIE Hong-Yan1, WAN Lu-Zhang1, HUANG Chun-Yan1, LIU Guo-Xia2, Jean-Fran?ois Picimbon2, GONG Zhi-Yuan1*

(1. Key Laboratory of Wastes Matrix Utilization, Ministry of Agriculture, Shandong Provincial Key Laboratory of Agricultural Non-Point Source Pollution Control and Prevention, Institute of Agricultural Resources and Environment, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China; 2. Biotechnology Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China)

The full-length cDNAs of two odorant binding protein genesBtabOBP2 andBtabOBP4 fromBemisiatabaci(Gennadius)were cloned by using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)and rapid amplification of cDNA ends (RACE). The full-length cDNA sequences ofBtabOBP2 (GenBank accession No. AIS71883)andBtabOBP4 (GenBank accession No. AIS71884)are 1107 bp and 874 bp, which contain 744 bp and 429 bp open reading frame encoding 247 and 142 amino-acid residues, respectively. The deduced amino acid sequence of BtabOBP4 contains six typical conservative cysteine residues, which are the hallmark of typical OBPs. Besides the six typical conservative cysteines, BtabOBP2 contains 3 more conservative ones and BtabOBP2 belongs to Plus-C OBP.BtabOBP2 andBtabOBP4 were then constructed into the pET30a(+)/BL21(DE3)prokaryotic expression vector and expressed with the induction of IPTG. The recombinant proteins were purified by affinity chromatography and gel filtration chromatography and analyzed by western blot. The results showed that recombinant proteins of BtabOBP2 and BtabOBP4 were expressed as soluble form inEscherichiacoli. The results of western blot confirmed that the expressed recombinant proteins were the target proteins. The molecular weight of BtabOBP2 recombinant protein in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was 6.53 kDa higher than that of the value calculated from its amino acid sequence deduced from the encoding cDNA. After a 43 amino acid peptide including the 6×His tag in N-terminal was excised from the recombinant protein by digestion with the recombinant enterokinase, the deviation of molecular weight of this protein determined by SDS-PAGE was reduced, which indicated that the 6×His tag caused the deviation of the molecular weight. In this study, the sequence characteristics of nucleotides and amino acids ofBtabOBP2 andBtabOBP4 were clarified. BtabOBP2 and BtabOBP4 recombinant proteins were successfully expressed and purified, which lay the foundations for studying the molecular structures and functions of BtabOBP2 and BtabOBP4.

Bemisiatabaci; odorant binding protein (OBP); gene cloning; prokaryotic expression; purification

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研基金(2015YQN36)；山東省博士后創(chuàng)新項(xiàng)目專項(xiàng)資金(201203025)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程(CXGC2017A01)山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系食用菌創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(SDAIT-07-01)

謝紅艷，女，1980年生，山東淄博人，博士，助理研究員，研究方向?yàn)槔ハx生化與分子生物學(xué)，E-mail：hyxieswan@163.com

*通訊作者 Author for correspondence，E-mail: sdgzy2656@126.com

Received：2016-08-26；接受日期 Accepted：2016-10-25

Q963;S433.39

：A

1674-0858(2017)04-0752-10

謝紅艷，萬(wàn)魯長(zhǎng)，黃春燕,等.煙粉虱MED隱種氣味結(jié)合蛋白基因BtabOBP2和BtabOBP4的cDNA克隆及原核表達(dá)[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，2017,39(4):752-761.