郭建文，李冬梅，田新會，杜文華

(1.草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)研究中心，甘肅蘭州 730070； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅蘭州 730070； 3.甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，甘肅蘭州 730070)

小黑麥雜交F1代真假雜種的ISSR標記鑒定及遺傳多樣性分析

郭建文1,2，李冬梅1,2，田新會3，杜文華1,2

(1.草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)研究中心，甘肅蘭州 730070； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅蘭州 730070； 3.甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，甘肅蘭州 730070)

為了給ISSR標記技術應用于小黑麥雜種鑒定提供參考，利用ISSR標記對小黑麥品系P1和P2有性雜交得到的F1代群體進行分子鑒定，同時結合田間表型調查結果對F1代群體進行遺傳多樣性分析。結果表明，66個雜交F1代單株中，52個為真雜種，其中，5個單株無主莖、未結實，1個生長后期死亡。14條ISSR引物對46個正常結實真雜種擴增的多態(tài)性條帶百分率為61.19%，其中，UBC822的多態(tài)性條帶百分率為100%，UBC808和UBC815的多態(tài)性條帶百分率均為75%。F1代群體和父母本的遺傳相似系數(shù)為0.62～0.94，說明雜交后代產(chǎn)生了豐富的遺傳變異。聚類分析將雜交F1代群體和父母本在閾值0.748處分為3大類群，第1類群包括1份材料(父本，P1)，第2類群包括1份材料(母本，P2)，第3類包括46個雜交F1代單株；雜交F1代與父母本的遺傳距離較遠，先與母本聚為一類，之后與父本聚為一類。田間調查結果表明，7個性狀中，除株高偏向于父本外，分蘗數(shù)、有效分蘗數(shù)、穗長、小穗數(shù)、穗粒數(shù)和穗粒重均偏向于母本，與父本的差距較大，這與ISSR分析結果基本相吻合。

小黑麥；雜交F1代；雜種鑒定；遺傳多樣性；ISSR

小黑麥(Triticale Wittmack)是由小麥屬(Triticum)和黑麥屬(Secale)植物經(jīng)有性雜交和雜種染色體加倍而形成的新物種。小黑麥按用途分為糧用型、飼用型和糧飼兼用型，具有一定的生態(tài)修復功能[1]，在鹽堿地修復中突顯出較高的生態(tài)及經(jīng)濟價值[2]。在我國安徽、新疆、甘肅、黑龍江、河北、四川、江蘇等地均有種植。小黑麥根據(jù)倍性分為十倍體、八倍體、六倍體和四倍體，飼用型小黑麥大多為六倍體[3]。小黑麥為自花授粉植物，父母本性狀優(yōu)劣和親緣關系遠近對雜交F1代表現(xiàn)和雜種優(yōu)勢有很大影響[4]，同時，育種技術也有一定作用[5]。

植物品種的純度測試大多數(shù)以觀測表觀形態(tài)特征為主，具有簡單直觀、經(jīng)濟方便等優(yōu)點，但表觀形態(tài)特征受環(huán)境影響較大，觀測工作量大，周期長[6]。而且，隨著骨干親本的集中使用，相近品種之間的形態(tài)學差異也越來越小，因此，利用形態(tài)學特征對品種進行鑒定也越來越難[7]。隨著SSR、ISSR、SLAF和RAPD等分子標記技術的逐漸完善和DNA指紋技術的發(fā)展，為品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試，提供了新方法[7]。周 強等[8]利用SSR標記對小麥的主要矮稈基因進行了分子鑒定；黃成志等[9]為提高雜交水稻鑒定效率，通過SSR分子標記鑒定了種子的真?zhèn)闻c純度；林春晶等[10]總結了DNA分子標記技術對雜交種純度鑒定的應用及特點；羊杏平等[11]研究表明，ISSR和RAPD標記對西瓜雜交種的純度檢測具有重要意義。ISSR標記是基于SSR發(fā)展起來的一種新型分子標記技術，具有無需預先知道基因組序列信息、快速、穩(wěn)定、多態(tài)性豐富、重復性強及成本低等優(yōu)點[12-13]，已被廣泛應用于植物種質資源鑒定和親緣關系分析[14-16]。

目前，國內外對小黑麥的研究較多，但大都集中在常規(guī)育種[17-18]、飼草產(chǎn)量及品質[19-20]和種子產(chǎn)量[21-22]等方面，尚未有雜交F1代群體雜種鑒定等方面的研究報道。本研究擬對小黑麥2個新品系有性雜交得到的F1代群體進行ISSR分析，以甄別真假雜種，同時結合田間表型調查結果對F1代群體進行遺傳多樣性分析，為ISSR標記技術應用于小黑麥雜種鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地為甘肅省臨洮縣農(nóng)校農(nóng)場(103°87′E，35°37′N)，海拔1 892 m，降水量562 mm，無霜期153 d，年平均氣溫7.0 ℃(最高氣溫為34.6 ℃，最低氣溫為-29.5 ℃)，有灌溉條件，土壤為黑麻土，有機質含量2.52%，pH 7.66，有效氮47.13 mg·kg-1，有效磷3.47 mg·kg-1，有效鉀174.95 mg·kg-1。

1.2 試驗材料

父本(P1)和母本(P2)為甘肅農(nóng)業(yè)大學利用常規(guī)育種技術和系譜法選育形成的性狀穩(wěn)定的六倍體小黑麥品系(AABBRR)。父本抗銹病，株高較高，但分蘗數(shù)較少，單株生物量較低；母本分蘗數(shù)多，單株生物量較高，但感銹病，株高矮。66個雜交F1代單株為P2和P1經(jīng)有性雜交得到的66粒F0代種子點播而得，編號為1-1～1-66。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗材料種植及管理

將父母本和F0代種子于2014年3月8日種植于臨洮縣農(nóng)校農(nóng)場的雜交后代圃中，行長1 m，每行播種30粒種子，行距20 cm，播種深度3～4 cm。播種前施尿素109 kg·hm-2，過磷酸鈣3 015 kg·hm-2。試驗期間及時中耕除草，拔節(jié)期和抽穗期各灌水1次。

1.3.2 小黑麥雜交F1代全基因組DNA提取

小黑麥F1代群體出苗后20 d插竹竿做好標記，然后分別剪取父母本和66個雜交F1代單株的幼嫩葉片約2 g。剪取時用酒精和蒸餾水擦拭葉片表面灰塵，以減少雜質污染，用錫箔紙包裝標記后置于液氮中速凍，儲存于-80 ℃冰箱中備用?；蚪MDNA提取方法參照改進CTAB法[23]。用1%瓊脂糖凝膠對DNA質量進行檢測，并用紫外分光光度計測定DNA濃度。最后將DNA稀釋為50 ng·μL-1，置于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.3 ISSR引物的篩選及ISSR-PCR反應

本研究所用ISSR引物為項目組前期從適于禾本科植物ISSR-PCR反應的64條引物中篩選出的、適宜于小黑麥多樣性分析的譜帶清晰穩(wěn)定、重復性好、多態(tài)性高的14條引物(表1)[24]。反應體系(20 μL)：2 μL 10×PCR buffer(不含Mg2+)，1.9 mmol·L-1Mg2+，0.2 mmol·L-1dNTPs，TaqDNA聚合酶2 U，引物0.65 μmol·L-1，ddH2O 12.8 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，52～56 ℃(依引物不同而不同)退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物保存于4 ℃，并于24 h內電泳檢測。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，凝膠成像儀上觀察并照相保存圖像。

1.3.4 小黑麥雜交F1代田間表型鑒定

于成熟期，對父母本及其F1代群體進行田間表型測定。測定時，從F1代群體中選擇正常結實的46個真雜種單株，并按照田間標記，給每個單株掛好標牌，然后從父母本中分別隨機選取10個單株。將上述單株連根拔起，帶回實驗室，測定株高、分蘗數(shù)、有效分蘗數(shù)、穗長、小穗數(shù)、穗粒數(shù)和穗粒重。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

小黑麥父母本和雜交F1代ISSR電泳圖譜中的每一個條帶代表一個引物的結合位點。按照電泳圖譜中相同遷移位置上條帶的有無進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，有條帶的賦值為“1”，無條帶的賦值為“0”，建立數(shù)據(jù)表格。人工讀帶的原則：只記錄容易分辨的條帶，忽略模糊不清的條帶。同一引物在F1代單株中不同遷移位置的條帶總數(shù)，即為該引物的擴增總條帶數(shù)，每個單株在同一遷移位置都出現(xiàn)的條帶位點數(shù)即為共有條帶數(shù)，多態(tài)性比率=(總條帶數(shù)-共有條帶數(shù))/總條帶數(shù)×100%。

利用POPGENED[25]計算遺傳相似性系數(shù)、多態(tài)性比率和遺傳距離(遺傳距離=1-遺傳相似性系數(shù))。用NTsys-2軟件[25]對統(tǒng)計結果進行聚類分析，生成親緣關系聚類樹狀圖。根據(jù)F1代與父母本的遺傳距離選擇合適的閾值進行分類[6,26]。

2 結果與分析

2.1 小黑麥雜交F1代單株ISSR-PCR鑒定結果

利用14條ISSR引物分別對小黑麥雜交F1代和父母本基因組DNA進行PCR擴增，結果發(fā)現(xiàn)，52株雜交后代單株具有父本特征帶，其中39株僅具備父本特征帶，13株雜交后代同時具備父本和母本的特征帶。說明66個小黑麥雜交F1代單株中，52個為真雜交種，14個(編號為1-10、1-18、1-28、1-29、1-30、1-33、1-35、1-36、1-47、1-48、1-49、1-50、1-65、1-66)為假雜交種。52個真雜種中，單株1-23在生長后期死亡，單株1-58、1-59、1-60、1-63、1-64無主莖、未結實，因此進行多樣性分析和表型鑒定時，上述6個單株未作為試驗材料。

2.2小黑麥雜交F1代真雜種的ISSR-PCR多態(tài)性分析

14條引物對46個F1代真雜種和父母本的擴增片段大小不同，250～2 000 bp之間均有分布。其中，引物UBC822對試驗材料的擴增圖譜見圖1。從電泳圖中可以看出，小黑麥雜交F1代和父母本材料擴增條帶清晰，多態(tài)性較好。

小黑麥雜交F1代真雜種和父母本ISSR分析所用引物最佳退火溫度及擴增結果見表1。14條引物擴增出清晰可辨的條帶共110條，其中多態(tài)性條帶68條，平均多態(tài)性條帶4.86條，多態(tài)性條帶比率為61.19%；各引物擴增出的總條帶數(shù)不同，在5～12條之間，多態(tài)性條帶數(shù)在3～9條之間，多態(tài)性比率在37.50%～100%之間。

M：核酸分子量標準DL2000；P1：父本；P2：母本；1～46：小黑麥雜交F1代單株。

表1 小黑麥雜交F1代和父母本ISSR分析所用引物信息和擴增結果Table 1 Primer sequences and amplified results of ISSR analysis on triticale F1 generation and their parents

2.3 小黑麥雜交F1代真雜種的遺傳相似性分析

以小黑麥46個F1代真雜種單株和父母本的擴增條帶為原始數(shù)據(jù)矩陣，得到遺傳相似系數(shù)。從相似性矩陣(表略)看，遺傳相似系數(shù)的變化范圍為0.62～0.94，其中父母本的遺傳相似系數(shù)為0.68，雜種1-6與父本的遺傳相似系數(shù)最小(0.62)，雜種1-13和雜種1-51的遺傳相似系數(shù)最大(0.94)；雜交后代與父本的遺傳相似系數(shù)介于0.62～0.76之間，與母本的遺傳相似系數(shù)介于0.63～0.78之間。說明供試F1代材料間的遺傳差異大，具有豐富的遺傳多樣性，為選育小黑麥新品種奠定了良好的基礎。

2.4 小黑麥雜交F1代真雜種的聚類分析

根據(jù)ISSR擴增得到的遺傳相似系數(shù)矩陣，用NTsys-2軟件按UPGMA法對小黑麥F1代真雜種和父母本進行聚類分析，構建ISSR聚類分析樹狀圖(圖2)。從樹狀圖看出，小黑麥46個F1代真雜種單株和父母本的遺傳距離在0.70～0.94之間，在遺傳距離為0.748處將48份材料分為3大類，第1類群包括1份供試材料，為父本(P1)，第2類群包括1份供試材料，為母本(P2)，第3類包括46個F1代單株。46份雜種F1代先聚集成一類，后與母本(P2)聚為一類，最后與父本(P1)聚在一起，說明46個F1代單株的表型性狀大多偏向于母本。

2.5 小黑麥雜交F1代的表型鑒定結果

田間調查結果(表2)表明，46個F1代正常結實真雜種單株的株高、分蘗數(shù)、有效分蘗數(shù)、穗長、小穗數(shù)、穗粒數(shù)和穗粒重均有一定程度的分離，各個性狀的均值均高于父母本，表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢。7個性狀中，除株高偏向于父本外，其他性狀偏向于母本，與父本的差距較大。

3 討 論

雜交或輻射誘變后代變異植株或突變體的檢測，大多是通過形態(tài)變化來確定，但形態(tài)變化容易受環(huán)境影響，有很多假雜種難以及時去除，不易準確鑒定雜交后代性狀的變異，從而影響選擇效果[27]。喬燕春等[28]利用RAPD標記對枇杷雜交F1代進行了鑒定，認為雜交后代中有父本特征帶或后代中出現(xiàn)新帶型則為真雜種。張平湖等[29]和韓 燕等[30]分別利用SSR標記和SNP標記對花生雜交F1代進行了鑒定，認為雜交F1代花生如果具有父母本的特征帶型即為真雜種。劉俊睿等[31]利用SSR標記對小豆雜交F1代進行了鑒定，認為F1代如果具有父母本特征帶則為真雜種。本試驗利用ISSR標記，通過比對F1代66個單株與父母本特征條帶的差異，證明52個單株具有父本的1條或多條特征帶，為真雜交種。

圖2 小黑麥雜交F1代和父母本的聚類樹狀圖

表2 小黑麥雜交F1代單株與父母本農(nóng)藝性狀的比較Table 2 Comparison of the agronomic characteristics between F1 generation of triticale and their parents

F1代各性狀值為46個F1代單株的平均值，父母本各性狀值為10個單株的平均值。

Data for the F1generation were the average of 46 plants of F1generation, and data for the parents were the average of 10 plants.

如果小黑麥父母本基因型純合，則F1代群體不存在遺傳多樣性。本研究對F1代進行分子鑒定時發(fā)現(xiàn)確實存在遺傳多樣性，從而說明父母本的基因型并沒有完全純合。合適的ISSR分子標記引物可以將親緣關系比較近的材料區(qū)分開，并進行聚類[27]。劉永財?shù)萚32]利用8條ISSR引物共獲得新麥草84個擴增位點，其中多態(tài)性位點72個，多態(tài)性比率85.7%。馬艷明等[33]研究表明，11條ISSR引物的多態(tài)性信息含量變化范圍較大(60.1%～94.1%)，具有較強的品種區(qū)分能力，是研究小麥遺傳多樣性的有效分子標記技術之一。與此相似，本試驗用14條ISSR引物對小黑麥46個雜交F1代真雜種單株和父母本進行親緣關系分析表明，14條引物擴增的多態(tài)性條帶百分率為61.19%。說明ISSR標記用于研究小黑麥雜交F1代群體的遺傳多樣性時具有較高的多態(tài)性。

本研究得出，小黑麥46個F1代真雜種單株和父母本的遺傳相似系數(shù)變化范圍較大，為0.62～0.94，說明小黑麥雜交F1代具有較豐富的遺傳變異性[34]。雜種1-6與父本的遺傳相似系數(shù)最小，具有較大的雜種優(yōu)勢，出現(xiàn)優(yōu)良變異的概率很大[35]。本試驗父母本的遺傳相似系數(shù)為0.68，高于部分雜交后代和親本的相似系數(shù)，這可能與父母本間的親緣關系有關。父本P1為JRCT61和JRCT400雜交選育形成的小黑麥品系，母本P2為DH265和AT315雜交選育的小黑麥品系，上述4個小黑麥品種均引自澳大利亞，他們可能具有一定親緣關系，這有待于進一步查證。

ISSR聚類分析樹狀圖表明，46個雜交F1代單株離母本的親緣關系較近，這與田間表型鑒定結果相吻合，說明本試驗ISSR鑒定和田間表型鑒定結果的一致性較好[34]。

本研究為小黑麥遺傳圖譜構建的前期工作，后期通過對小黑麥草產(chǎn)量和種子產(chǎn)量相關QTL定位，可以明確優(yōu)異性狀在染色體上的具體位置，為基因克隆和轉基因等分子輔助育種奠定基礎[36]。

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PurityIdentificationandGeneticDiversityStudiesontheF1HybridGenerationofTriticale

GUOJianwen1,2，LIDongmei1,2，TIANXinhui3，DUWenhua1,2
(1.Key Laboratory of Grassland Ecosystem, Ministry of Education/Sino-U.S.Centers for Sustainable Development of Grassland and Animal Husbandry, Lanzhou, Gansu 730070, China; 2.College of Grassland Science, Gansu Agricultural University, Lanzhou, Gansu 730070, China; 3.College of Plant Protection, Gansu Agricultural University, Lanzhou, Gansu 730070, China)

In order to provide reference for the mutation identification and selection of parents, ISSR markers were used to identify the hybrid F1generation of new triticale lines P1and P2.Besides, the genetic diversity of F1population was studied based on the field investigation results.The results showed that, among 66 F1plants, 52 were true hybrids, and 46 plants were used as the experimental materials in this study because the rest of six plants did not grow normally.The amplification percentage was 61.19% for 46 F1hybrid plants while using 14 ISSR primers, among which, amplification percentage was 75% for the primer UBC808 and UBC815, and 100% for the primer UBC822.For 46 F1plants and their parents, the genetic similarity coefficient ranged from 0.62 to 0.94, which proved that the hybrid offspring produced abundant genetic variation.Cluster analysis showed that the 46 F1plants and their parents were classified into 3 categories, which were male parent, female parent and their F1generation, respectively.The F1generation was firstly clustered with the female and then with the male, which demonstrated that the F1population had closer relationship with the female parent than that with the male parent.The results of field investigation showed that the F1population was significantly different from male parent in seven traits, such as the number of tillers and effective tillers, spike length, the number of spikelet and seeds, and grain weight per spike, except plant height, which is consistent with the results of ISSR analysis.

Triticale; F1hybrid generation; Purity identification; Genetic diversity; ISSR

時間：2017-08-08

網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170808.0911.010.html

2016-11-09

2017-05-31

國家自然科學基金項目(31360577)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金項目(CARS-40-09B)

E-mail：724318633@qq.com(郭建文)；1058197897@qq.com(李冬梅，與第一作者同等貢獻)

杜文華(E-mail:duwh@gsau.edu.cn)

S512.4；S330

： A

：1009-1041(2017)08-1031-07