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        菌毒敵液、強力消毒靈液等六種消毒藥以及黃連、甘草、黃柏三種中藥不同提取法對實驗室空氣菌的敏感程度的探究

        2017-09-16 10:28:49張正瑩
        中獸醫(yī)學(xué)雜志 2017年4期
        關(guān)鍵詞:安全柜超純水黃柏

        張正瑩,吳 潤

        (1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),甘肅省蘭州市730000;2.景泰縣畜牧獸醫(yī)局,甘肅省白銀市730400)

        菌毒敵液、強力消毒靈液等六種消毒藥以及黃連、甘草、黃柏三種中藥不同提取法對實驗室空氣菌的敏感程度的探究

        張正瑩1,2,吳 潤1

        (1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),甘肅省蘭州市730000;2.景泰縣畜牧獸醫(yī)局,甘肅省白銀市730400)

        為了驗證菌毒敵液、強力消毒靈液等六種消毒藥以及黃連、甘草、黃柏三種中藥不同提取法對實驗室空氣菌的敏感程度,本實驗采用微管-平板法測定了菌毒敵液、強力消毒靈液等六種消毒藥以及黃連、甘草、黃柏三種中藥不同醇提物和水提物對實驗室空氣菌的最小抑菌濃度(MIC),表明消毒藥品較中藥對實驗室細菌的抑制作用效果好,黃連醇提物對實驗室細菌的抑制作用明顯,甘草、黃柏的水提物對實驗菌的抑制作用不明顯。綜合經(jīng)濟效益和滅菌效果的綜合考慮,中藥滅菌可值得研究。

        醇提物;最小抑菌濃度;水提物;消毒藥

        早在20世紀50年代我國醫(yī)藥工作者即開始了中藥抑菌作用與抑菌成分研究,并發(fā)現(xiàn)許多具有抗菌作用的中藥。常規(guī)的藥敏實驗方法:有①紙片瓊脂擴散法;②試管稀釋法;③平板稀釋法;④打洞法;⑤挖溝法;⑥微量稀釋法等。然而這些方法也存在著其缺陷或局限性,因此我們應(yīng)根據(jù)實際情況選擇較合適的方法。試管稀釋法是一個比較好的方法,但具有實驗工作量大,操作繁瑣,一個系列稀釋度含藥培養(yǎng)基只能測一種菌,營養(yǎng)要求高的菌無法培養(yǎng)等弊端;打洞法同紙片擴散法,存在藥物擴散問題,又沒有中藥標(biāo)準紙片,實驗結(jié)果難以控制;平板稀釋法只需制兩個系列稀釋度含藥平板,一個稀釋度可同時測多種細菌,操作簡便,結(jié)果準確,是一種比較理想的方法,但是必須注意細菌之間交叉感染的問題;微量稀釋法準確可靠,重復(fù)性好,且簡便易行,但是結(jié)果不易觀察,加顯色劑以后不適用于需要加血的培養(yǎng)基。

        根據(jù)以往的研究,傅文棟[1]對常見的抗菌抗中草藥的主要有效成分進行了列表,對此做出了總結(jié),如金銀花為綠原酸、異綠原酸、新綠原酸;黃連為小檗堿、黃連堿、巴馬亭。盧芳國[2]等研究了12個中藥復(fù)方的抗菌作用,發(fā)現(xiàn)由麻黃、杏仁、甘草、黃芩、魚腥草等組成的方劑抑菌效果最為明顯。楊勇[3]等對黃連中4種主要的生物堿的抑菌活性進行了研究發(fā)現(xiàn)小檗堿的抑菌活性最大,且4種黃連生物堿對G+菌的抑制活性大于G-菌和酵母菌。鄔蘇曉[4]等人研究發(fā)現(xiàn)黃柏抑菌效果較好,MIC為125mg/mL。中草藥在其他國家也是有所應(yīng)用的,WHO曾經(jīng)做出過這樣的估計,全球使用中藥的人數(shù)占全世界人口的65%-80%。

        在中藥體外抑菌實驗的研究中,一方面證實了其具有抑菌作用,另一方面也試圖發(fā)現(xiàn)其中的有效抑菌成分。到現(xiàn)在為止,發(fā)現(xiàn)有效地抑菌成分很多,而且有很多已經(jīng)直接或經(jīng)過改造后投入使用。從20世紀50年代起我國醫(yī)藥工作者開始了對中藥抑菌作用與抑菌成分的研究,發(fā)現(xiàn)了很多有抗菌作用的中藥和其抗菌的主要成分,抗菌成分是很復(fù)雜的,它主要包括有生物堿、有機酸、萜類、黃酮、醌類等。

        實驗部分

        1 材料

        1.1 藥品

        名稱 生產(chǎn)廠家金碘王(聚維酮碘溶液) 農(nóng)大潤農(nóng)生物科技有限公司中農(nóng)衛(wèi)康消毒劑 哈爾濱中農(nóng)華大獸藥有限公司菌毒敵 湖南大乘醫(yī)藥化工有限公司強力消毒靈 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院中獸疫研究所藥廠威特格瑞 臨洮威特藥業(yè)有限公司燒堿 浩潤化工甘草 景泰縣同濟大藥房黃柏 景泰縣同濟大藥房黃連 景泰縣同濟大藥房

        1.2 細菌 實驗室空氣菌

        1.3 試劑

        營養(yǎng)瓊脂,生產(chǎn)廠家:青島市高科技園海博生物科技有限公司

        革蘭氏染液,生產(chǎn)廠家:青島市高科技園海博生物科技有限公司

        普通肉湯培養(yǎng)基,生產(chǎn)廠家:杭州微生物試劑有限公司

        1.4 儀器

        儀器 型號 生產(chǎn)廠家生物安全柜 BSC-1300IIA2 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司壓力蒸汽滅菌器 WG-C35N.L 威海威高生物技術(shù)有限公司電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 DHG-9053A上海齊欣科學(xué)儀器有限公司電子天平 FA2104N 上海精密科學(xué)儀器有限公司超純水儀 OKP-S010 上海淶科儀器有限公司冰箱 BCD-256DT 青島海爾股份有限公司電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9052上海齊欣科學(xué)儀器有限公司

        2 方法

        2.1 培養(yǎng)基的制備

        2.1.1 普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備

        30g營養(yǎng)瓊脂加入1000mL超純水,高壓滅菌121℃,15min。放入生物安全柜,當(dāng)營養(yǎng)瓊脂溫度降到55℃左右時澆平板2-3cm厚。待平板內(nèi)瓊脂凝固后,冷藏備用[5]。

        2.1.2 普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的制備

        30g普通肉湯加入1000mL超純水,高壓滅菌121℃,15min。放入生物安全柜,紫外線消毒降溫到室溫冷藏備用。

        2.2 試驗藥液的制備

        2.2.1 菌毒敵液在生物安全柜內(nèi)取10mL滅菌超純水加20uL菌毒敵原液將其作1:500倍稀釋到畜禽房舍及器具消毒濃度,冷藏備用。

        2.2.2 中農(nóng)衛(wèi)康消毒劑 在生物安全柜內(nèi)取10mL滅菌超純水加20uL菌毒敵原液將其作1:500倍稀釋到畜禽房舍及器具消毒濃度,冷藏備用。

        2.2.3 金碘王(聚維酮碘溶液)在生物安全柜內(nèi)取10mL滅菌超純水加10uL菌毒敵原液將其作1:1000倍稀釋到養(yǎng)殖場常規(guī)消毒濃度,冷藏備用。

        2.2.4 威特格瑞液 在生物安全柜內(nèi)取10mL滅菌超純水加0.01g菌毒敵原液將其作1:1000倍稀釋到養(yǎng)殖場常規(guī)消毒濃度,冷藏備用。

        2.2.5 強力消毒靈液 在生物安全柜內(nèi)取10mL滅菌超純水加0.01g菌毒敵原液將其作1:1000倍稀釋到飼養(yǎng)場所器具消毒濃度,冷藏備用。

        2.2.6 燒堿溶液在生物安全柜內(nèi)稱取0.3g燒堿,加滅菌超純水10mL將其配成3%消毒濃度,冷藏備用。

        2.2.7 醇提取 將黃連、黃柏、甘草粉碎,分別準確稱取10g,放入燒杯內(nèi),加入 70%乙醇100mL,用超聲波提取30min,提取3次,然后加熱濃縮,濃縮液放入恒溫干燥箱中干燥成藥膏,再用蒸餾水溶解配成1g/mL的藥液,4℃冰箱保存?zhèn)溆肹11]。

        2.2.8 水提取 將黃連、黃柏、甘草粉碎,分別準確稱取10g,放入錐形瓶中,加入適量的蒸餾水侵泡2-3h,用超聲波作用30min,然后用水煎20min,每種藥煎2-3次后濃縮成藥膏,用蒸餾水稀釋到1g/mL的藥液,4℃冰箱保存?zhèn)溆肹5]。

        2.3 菌種的準備

        取澆好的一個營養(yǎng)瓊脂平板打開放置在實驗室,24小時后挑取菌落并用普通營養(yǎng)肉湯做增菌培養(yǎng),放置恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)18-24h候得原菌液。取試管分別對原菌液用生理鹽水進行二倍比稀釋,用移液器從8號管中取20μL菌液注入平板上,重復(fù)做3個平板,并用L棒將其涂勻,培養(yǎng)18-24h查菌落數(shù),得出原菌液的細菌濃度。將原菌液或稀釋后的菌液用生理鹽水稀釋到所需濃度106cfu/mL[6],4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

        2.4 各藥液對試驗菌的最小抑菌濃度(MIC)的測定

        在生物安全柜內(nèi),采用微管-平板法。每種藥物12支EP管,每個EP管內(nèi)加入500μL的肉湯,向第1支EP管里加入500μL配好的藥液,混勻,從中吸取500μL加入第2支EP試管[5],依次類推,直至第11支試管,棄去500μL,12號EP管做陰性對照。1-12號EP管內(nèi)加入20μL菌液,37℃培養(yǎng)18-24h后,將其分別接種到平板上[13],37℃再培養(yǎng)18-24h后,得試驗藥物對實驗菌的MIC[7][8]。

        3 試驗結(jié)果

        通過試驗[8],可以得出菌毒敵液、中農(nóng)衛(wèi)康消毒劑、金碘王(聚維酮碘溶液)、威特格瑞液、強力消毒靈液和燒堿溶液的最小抑菌濃度的MIC,記錄于表2。

        藥名 MIC(g/mL)菌毒敵液 1/500*8中農(nóng)衛(wèi)康消毒劑 1/500*16金碘王(聚維酮碘溶液) 1/500*2威特格瑞液 1/500*128強力消毒靈液 1/500*128燒堿溶液 1/500*256甘草醇提物 1/32甘草水提物 1/8黃連醇提物 1/64黃連水提物 1/16

        黃柏醇提物 1/32黃柏水提物 1/8

        4 結(jié)論

        燒堿溶液對試驗菌的抑制作用明顯,強力消毒靈液和威特格瑞液對實驗室細菌的抑制作用相當(dāng),對試驗菌的抑制作用僅次于燒堿,其它消毒藥對某些實驗室細菌的抑制作用不明顯。其中三種中藥的醇提物都比水提物對實驗菌的抑制作用強,這三種中藥其中黃連醇提物對實驗菌的抑制作用最強,黃連和黃柏的水提物對實驗菌的抑菌作用較小。此結(jié)論為實驗室消毒等工作具有指導(dǎo)意義。

        [1]傅文棟.中草藥及其有效成分體外抗菌抗病毒研究進展[J].中國獸醫(yī)雜志,2006(5):66-67.

        [2]盧芳國,朱應(yīng)武,田道法.12個中藥復(fù)方體外抗菌作用的研究[J].湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2004,24(4):9.

        [3]楊勇,葉小利,李學(xué)剛.4種黃連生物堿的抑菌作用[J].時珍國醫(yī)國藥,2007,18(12):3013-3014.

        [4]鄔蘇曉,肖正中,李淑儀等.中草藥制劑對豬鏈球菌和大腸桿菌的體外抑菌效果[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,(05):183-184.

        [5]王宏軍,周鐵忠,劉孝剛等.協(xié)同指數(shù)法篩選銀翹天甘組方的最佳劑量配比[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2011,32(1):58-62.

        [6]蘆亞君,程 寧.3種中藥方劑逆轉(zhuǎn)大腸桿菌耐藥性的實驗觀察[J].西北藥學(xué)雜志,2007,22(6):309.

        [7]HyunAeKwon,Yong-JunKwon,Dong-YeulKwon,eta.l Evalua-tion ofantibacterialeffectsofa combination ofCoptidisRhizoma,MumeFructus,and Schizandrae Fructus against Salmonella[J].InternationalJournal ofFoodMicrobiology.2008,127:180.

        [8]劉厚,何林,周克元.抗生素敏感試驗方法學(xué)的研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊,2005,26(9):628-634.

        S853.74

        B

        1003-8655(2017)04-0010-03

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