劉永波，舒相華，白華毅，陶 楊，謝相悅，吳常月，張 雪，李 鑫，凌萬(wàn)旭，何 錦，宋春蓮

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201；2.昆明偉牧得生物科技有限公司，昆明，650201）

云南10種中草藥水煎劑對(duì)豬源大腸桿菌體外抑菌實(shí)驗(yàn)

劉永波1，舒相華1，白華毅1，陶 楊1，謝相悅1，吳常月1，張 雪1，李 鑫1，凌萬(wàn)旭2，何 錦2，宋春蓮1

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201；2.昆明偉牧得生物科技有限公司，昆明，650201）

為了研究云南省10種中草藥水煎劑對(duì)豬源大腸桿菌的體外抑菌作用，用兩次煎煮法將黃芩、黃連、黃柏、當(dāng)歸、板藍(lán)根、燈盞花、馬蹄香、茯苓、白頭翁、巖坨等10種云南主產(chǎn)中藥材制成生藥濃度為1g/ml的水煎液，用牛津杯法測(cè)定抑菌圈，試管法測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)。結(jié)果顯示當(dāng)歸、黃連、黃芩、白頭翁水煎劑體外抑菌效果較好，抑菌圈分別為18、17、16、12cm；MIC分別為250mg/ml、62.5mg/ml、125mg/ml、500mg/ml。該實(shí)驗(yàn)所選10種中藥材除茯苓和馬蹄香外，其余中藥材水煎液對(duì)豬源大腸桿菌皆有不同程度的體外抑菌效果。該研究對(duì)臨床應(yīng)用中草藥防治豬大腸桿菌病及篩選效果良好的抑菌中草藥物進(jìn)行抗菌獸藥研發(fā)有一定的指導(dǎo)意義。

中草藥；水煎劑；豬源大腸桿菌；抑菌圈；最小抑菌濃度

大腸桿菌（Escherichia coli），又名大腸埃希氏菌，是腸桿菌科(Ecnterobacteriaceae)埃希氏菌屬(Escherichia)的代表菌，需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌，是人和動(dòng)物腸道中的正常棲居菌，在一定條件下可引起腸道外感染。某些血清型菌株的致病性強(qiáng)，引起腹瀉，統(tǒng)稱(chēng)致病性大腸桿菌[1]。豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的豬的一種傳染病。主要表現(xiàn)為腸炎、腸毒血癥等多種臨床癥狀。豬場(chǎng)飼養(yǎng)環(huán)境不良、消毒不規(guī)范及豬自身的免疫力低下是誘發(fā)該病的重要因素。豬大腸桿菌病主要表現(xiàn)為仔豬黃痢、仔豬白痢和豬水腫病[2]。大腸桿菌的血清型眾多，疫苗免疫效果不佳，臨床多采用抗菌藥物進(jìn)行治療，由于近年來(lái)抗菌藥物的大量不規(guī)范應(yīng)用，該病的抗藥性問(wèn)題日漸嚴(yán)重[3]，研發(fā)新型非化學(xué)抗菌藥物迫在眉睫。

中草藥具有副作用小、價(jià)格低廉、低耐藥性、低殘留等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用中草藥研發(fā)新型抗菌獸藥及飼料添加劑成為近年的來(lái)熱門(mén)研究課題[4]。云南地形地貌復(fù)雜，氣候多樣，中草藥資源豐富，素有“植物王國(guó)、藥材之鄉(xiāng)”的美稱(chēng)[5]。本研究通過(guò)對(duì)黃芩、黃連、黃柏、當(dāng)歸、板藍(lán)根、燈盞花、馬蹄香、茯苓、白頭翁、巖坨等10種云南省主產(chǎn)中草藥水煎劑對(duì)豬源大腸桿菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，測(cè)定抑菌圈和最小抑菌濃度(MIC)，為獸醫(yī)臨床合理使用中草藥防治豬大腸桿菌病和篩中草藥進(jìn)一步研發(fā)抗菌獸藥提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 供試藥品

供試中草藥為：黃連(澄江)、黃芩(昆明)、黃柏(瀘西)、當(dāng)歸(曲靖)、茯苓(瀘西)、燈盞花(騰沖)、馬蹄香(保山)、板藍(lán)根(瀘西)、巖陀(大理)、白頭翁(昆明)，各藥材均為實(shí)地采購(gòu)，括號(hào)內(nèi)備注為采購(gòu)地點(diǎn)。供試菌為豬大腸桿菌ATCC29522，購(gòu)于廣東省菌種保藏中心

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑、耗材

LB液體培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、平板技術(shù)培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、牛肉膏、蛋白胨、革蘭氏染色試劑盒、細(xì)菌復(fù)蘇液、一次性無(wú)菌平皿(90mm)、牛津杯(6*8*10mm)、一次性移液管(10ml)、一次性吸管(1ml)、離心管(4ml)

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺(tái) （SW-CJ-1F，蘇凈集團(tuán)安泰公司）、恒溫水浴鍋 (HH-2，邦西儀器科技有限公司)、恒溫氣浴振蕩器(CHA-S，常州智博瑞儀器制造有限公司)、電子天平(HTP312,上?；ǔ彪娮觾x器有限公司)、恒溫生化培養(yǎng)箱(SPX-150，上海申賢恒溫設(shè)備廠)、立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-30KBS，上海申安醫(yī)療器械廠)、電熱恒溫干燥箱(DHG-9240A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、電冰箱(BCD-222HE3B，美菱股份有限公司綿陽(yáng)冰箱制造廠)

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 中草藥水煎液的制備

分別稱(chēng)取上述十種中藥各50g于1000ml砂鍋中，加500ml蒸餾水，浸泡2h，先大火加熱至沸騰，后文火煎煮1h，紗布過(guò)濾至100ml燒杯中；再加入300ml蒸餾水，煎煮方法同上，合并兩次煎煮液，于電熱恒溫干燥箱干燥至50ml。將中藥水煎液移至 100ml規(guī)格錐形瓶中，121℃滅菌20min，用已滅菌的蒸餾水重新定容至50ml，即得生藥濃度為1g/ml中藥水煎液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?/p>

2.2 供試菌液的制備

2.2.1 向凍干菌種加入復(fù)蘇液，制成細(xì)菌懸浮液，用已滅菌生理鹽水50倍稀釋?zhuān)靡淮涡缘喂芪∵m量均勻涂布于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，置于37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h

2.1.2 挑取單個(gè)菌落在麥康凱培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，37℃培養(yǎng) 16h，

2.1.3 挑取單個(gè)菌落接種于LB液體培養(yǎng)基試管，置于恒溫氣浴振蕩器37℃培養(yǎng)10h，4℃冰箱保存?zhèn)溆?/p>

2.3 中藥水煎液抑菌圈測(cè)定

2.3.1 配制普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂于兩個(gè)藍(lán)口瓶，分別編號(hào)為1和2。121℃高壓滅菌20min，置于45℃水浴鍋，用一次性10ml規(guī)格移液管于1號(hào)藍(lán)口瓶中分兩次共吸取20ml至每個(gè)平板，冷卻凝固。(該步驟在無(wú)菌室按照無(wú)菌操作規(guī)程完成)

2.3.2 用2號(hào)藍(lán)口瓶中的普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂稀釋供試菌液濃度至105-106CFU/mL，用5mL一次性移液管分別吸取5mL菌液于已冷卻的普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上，冷卻凝固

2.3.3 將已滅菌的牛津杯用鑷子均勻地置于已凝固的普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，每個(gè)平板放4個(gè)牛津杯。

2.3.4 用一次性吸管吸取各中藥水煎液于牛津杯中，每個(gè)平板設(shè)兩孔陰性對(duì)照，將已高壓滅菌的LB液體培養(yǎng)基用一次性吸管加至陰性對(duì)照孔，兩對(duì)照孔和兩中藥水煎液孔分別呈對(duì)角設(shè)置。

2.3.5 將平板置于37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，每個(gè)平板抑菌圈大小為兩孔抑菌圈之和的均值。抑菌圈判定標(biāo)準(zhǔn)為：抑菌圈直徑小于10mm為耐藥，10-15 mm為中度敏感，大于15 mm為高度敏感[6]。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2.3.6 分別在抑菌圈內(nèi)及圈外挑菌進(jìn)行革蘭氏染色。

2.4 中藥水煎液MIC測(cè)定

2.4.1 依據(jù)各中藥水煎液抑菌圈檢測(cè)結(jié)果，選取黃連、當(dāng)歸、黃芩、白頭翁做MIC測(cè)定

2.4.2 按無(wú)菌操作規(guī)程分別將黃連、當(dāng)歸、黃芩、白頭 翁 配 制 成 500mg/ml、250mg/ml、125mg/ml、62.5mg/ml、31.25mg/m濃度的水煎劑

2.4.3 將已稀釋好的各中藥不同濃度的水煎劑各取1ml于4ml規(guī)格已滅菌離心管內(nèi)，各中藥水煎劑分別設(shè)一孔陰性對(duì)照，加1ml已滅菌LB普通液體培養(yǎng)基

2.4.4 向每個(gè)離心管內(nèi)加50ul細(xì)菌濃度為105-106CFU/ml的豬大腸桿菌菌液

2.4.5 將離心管置于37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。分別觀察各離心管細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況。以不顯示渾濁，管內(nèi)液體清亮的為無(wú)菌落生長(zhǎng)，該試管的藥液稀釋度為該中藥水煎液對(duì)豬大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)。每種中藥水煎劑實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 中藥水煎液抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 牛津杯法測(cè)定各中草藥水煎劑對(duì)豬大腸桿菌抑菌圈結(jié)果Table1 The bacteriostatic circle of Chinese herbal medicine Water Decoction against swine Escherichia coli which was determined bythe oxford cup method

由表1可知，當(dāng)歸水煎液對(duì)豬大腸桿菌具有明顯的抑制作用，其次為黃連、黃芩、白頭翁水煎液。挑取抑菌圈內(nèi)進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下視野可見(jiàn)無(wú)菌或幾個(gè)零星散在菌落，表明抑菌圈內(nèi)藥物可以抑制豬大腸桿菌的生長(zhǎng)繁殖。茯苓水煎三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)組平板上皆未出現(xiàn)明顯的抑菌圈，表明該藥物水煎液對(duì)豬大腸桿菌無(wú)抑殺作用，即豬大腸桿菌對(duì)其耐藥。黃柏、板藍(lán)根、巖坨、馬蹄香、燈盞花水煎液抑菌圈內(nèi)雖然革蘭氏染色為無(wú)菌，但抑菌圈直徑皆小于10ml，可判定為對(duì)豬大腸桿菌耐藥。據(jù)上結(jié)果，選取當(dāng)歸、黃連、黃芩、白頭翁進(jìn)行MIC測(cè)定。

3.2 中藥水煎液MIC實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 各中藥水煎劑對(duì)豬大腸桿菌M IC測(cè)定結(jié)果Table1 Determination result of Escherichia coli MIC in Escherichia coli by Decoction of various Chinese herbal medicines

由表2可知，黃連水煎劑對(duì)大腸桿菌抑菌效果最顯著，其MIC為62.5mg/ml，其次為黃芩和白頭翁，分別為125mg/ml和250mg/ml，當(dāng)歸的抑菌效果最不明顯，為500mg/ml，該結(jié)果與抑菌圈測(cè)定結(jié)果不一致。

4 討論

4.1 本實(shí)驗(yàn)所用10種中藥材皆為實(shí)地購(gòu)買(mǎi)，這就避免了因在中藥市場(chǎng)所購(gòu)藥材導(dǎo)致的質(zhì)量瑕疵及產(chǎn)地有誤等因素。所選10種中藥材皆為云南省主產(chǎn)藥材，其中黃芩、黃連、白頭翁在臨床上已被廣泛應(yīng)用于抗菌藥或抗菌飼料添加劑，尤其是黃芩近年來(lái)被廣泛用作飼料添加劑用于防治細(xì)菌性疾病，且已有大量報(bào)道黃芩臨床抗菌效果切實(shí)有效[7]。

4.2 中藥水煎劑為我國(guó)最傳統(tǒng)，使用最廣泛，且最早的藥物劑型，因其制備簡(jiǎn)單、奏效迅速，尤其適應(yīng)于中醫(yī)辨證治療原則，能夠根據(jù)患畜臨床需要配伍藥方或加減藥量，進(jìn)而起到增強(qiáng)藥效的作用，為我國(guó)中獸醫(yī)寶貴的經(jīng)驗(yàn)財(cái)富。但是傳統(tǒng)的煎煮方法，沒(méi)有統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，而且中藥煎煮涉及到藥材的浸泡、加水量、火候控制、煎煮時(shí)間、煎煮容器等因素的影響，操作雖然簡(jiǎn)單，在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中常出現(xiàn)水煎劑溶解不充分、藥效不穩(wěn)定等缺點(diǎn)[8]。

4.3 用牛津杯法測(cè)定中藥水煎劑對(duì)豬大腸桿菌的抑菌圈，水煎劑為生藥濃度1g/ml時(shí)，當(dāng)歸水煎劑的抑菌圈可達(dá)到17mm，說(shuō)明該濃度下當(dāng)歸水煎液對(duì)豬大腸桿菌體外有很強(qiáng)的抑殺作用，其對(duì)大腸桿菌的抑菌效果顯著高于黃芩、黃連、白頭翁及其他中草藥水煎劑。而測(cè)定當(dāng)歸水煎液對(duì)豬大腸桿菌MIC卻顯示3個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)結(jié)果皆為500mg/ml，其對(duì)大腸桿菌的抑殺效果低于黃芩和黃連水煎液，該結(jié)果與牛津杯法測(cè)定抑菌圈的結(jié)果不一致。可能因?yàn)楦髦兴幩逡涸谄桨迳系臄U(kuò)散能力強(qiáng)弱不同，當(dāng)歸水煎液在平板上擴(kuò)散能力較強(qiáng)，且在其擴(kuò)散范圍內(nèi)能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，所以可形成較大的抑菌圈，且圈內(nèi)革蘭氏染色顯示無(wú)菌。雖然黃芩、黃連的水煎液對(duì)豬大腸桿菌的抑殺作用可能高于當(dāng)歸水煎液，但其在平板上的擴(kuò)散能力低于當(dāng)歸水煎液，所以其形成的抑菌圈小于當(dāng)歸水煎液。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，不能僅以單一的牛津杯法、打孔法在平板上形成的抑菌圈大小來(lái)直接判定某種中藥材水煎液或其他有效成分的體外抑菌效果，還需結(jié)合其他方法加以判定。

4.4 本試驗(yàn)所選的10種中草藥除馬蹄香、茯苓和板藍(lán)根3中草藥水煎液對(duì)大腸桿菌體外抑菌效果不理想外，其他7種中草藥水煎劑對(duì)豬大腸桿菌都有不同程度的抑制作用，尤其是黃連、黃芩、當(dāng)歸和白頭翁對(duì)豬源大腸桿菌有較強(qiáng)的體外的抑菌作用。該結(jié)果對(duì)臨床應(yīng)用中草藥防治豬大腸桿菌病及篩選效果良好的抑菌中草藥物進(jìn)行抗菌獸藥研發(fā)有一定的指導(dǎo)意義。但本實(shí)驗(yàn)所用水煎液都經(jīng)過(guò)高壓滅菌，高溫可能對(duì)中藥有效成分有較大影響，且中草藥成分復(fù)雜[9]，抗菌機(jī)制尚不清楚，抑菌有效成分復(fù)雜，而且中草藥受體外與體內(nèi)環(huán)境的影響較大，中藥體內(nèi)抑菌作用也可能是通過(guò)提高機(jī)體免疫力達(dá)到抑菌目的，而不是直接的抑殺作用，因此選擇中草藥進(jìn)行獸藥研發(fā)時(shí)不能單單依據(jù)體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行篩選[10]。

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S853.71

B

1003-8655（2017）04-0013-03

云南省重點(diǎn)新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)專(zhuān)項(xiàng)《云南地區(qū)主產(chǎn)中藥材豬用中獸藥飼料添加劑研發(fā)及應(yīng)用》(2016BC014)；

劉永波(1989-)，河南人，男，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物疫病防控及中藥免疫學(xué)，757259269@qq.com.

宋春蓮(1972-)，云南晉寧人，女，講師，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物組織胚胎學(xué)及疫病防控技術(shù)，Tel:13888001944，E-mai1:466569879@qq.com.