曾上敏，秦斯民，曹華玲

(廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520)

HPLC法同時(shí)測(cè)定風(fēng)濕定片中甘草酸和歐前胡素的含量

曾上敏，秦斯民，曹華玲

(廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520)

建立HPLC同時(shí)測(cè)定風(fēng)濕定片中甘草酸和歐前胡素含量的方法。采用反相高效液相色譜法，色譜柱為Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.05%甲酸水溶液，梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為25℃。甘草酸在0.92～18.4 μg·mL-1(r=0.9996)，歐前胡素在0.496～9.92 μg·mL-1(r=0.9998)范圍具有良好的線性關(guān)系；平均回收率甘草酸為98.5%，RSD為2.97%(n=6)；歐前胡素為99.4%，RSD為1.20%(n=6)。本方法準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，可用于風(fēng)濕定片的質(zhì)量控制。

風(fēng)濕定片；HPLC；甘草酸；歐前胡素

風(fēng)濕定片是由八角楓、白芷、徐長(zhǎng)卿、甘草4味中藥組成，具有散風(fēng)除濕，通絡(luò)止痛之功效。用于風(fēng)濕阻絡(luò)所致的痹病，癥見(jiàn)關(guān)節(jié)疼痛；風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，肋神經(jīng)痛，坐骨神經(jīng)痛見(jiàn)上述證候者[1]。2015年版中國(guó)藥典(一部)對(duì)風(fēng)濕定片中徐長(zhǎng)卿的主要成分丹皮酚進(jìn)行了含量測(cè)定，鑒別采用薄層鑒別法[1]。同時(shí)，也有文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC法測(cè)定風(fēng)濕定片中毒藜?jí)A的含量[2]。白芷和甘草也是該制劑的主要成分，藥典中未對(duì)白芷和甘草的主要成分歐前胡素和甘草酸進(jìn)行含量測(cè)定[3-4]，也未見(jiàn)國(guó)內(nèi)有采用HPLC法對(duì)風(fēng)濕定片中歐前胡素和甘草酸的含量進(jìn)行單獨(dú)或同時(shí)測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道。為更全面評(píng)價(jià)風(fēng)濕定片的質(zhì)量，本研究建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定風(fēng)濕定片中甘草酸和歐前胡素2個(gè)有效成分含量的方法，為風(fēng)濕定片的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

LC-15C高效液相色譜儀(日本島津公司，包括LC-15C雙元泵， SPD-15C紫外檢測(cè)器，SIL-10AF自動(dòng)進(jìn)樣器，LC-solution工作站。Mettler AE-240電子分析天平；超純水器(Millipore)；超聲波清洗器(KQ-400DB，昆山市超聲儀器有限公司)。

甘草酸銨對(duì)照品(批號(hào)：110731-201619，含量以93.0%計(jì)，每1mg甘草酸銨相當(dāng)于0.9795mg甘草酸)、歐前胡素(批號(hào)：110826-201415)，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；風(fēng)濕定片(陜西君碧莎制藥有限公司，批號(hào)為20110801、20111001、20120601)；乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純，水為超純水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil -C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.05%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫0～10min，35%A；10～15min，35%A→45%A；15～20min，45%A→55%A；20～30min，55%A。流速：1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取甘草酸銨及歐前胡素對(duì)照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含甘草酸及歐前胡素分別為0.46 mg·mL-1、0.248 mg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品10片，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉0.20 g，置于50 mL量瓶中，加75%甲醇適量超聲處理30min，冷卻，定容至至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得[5-6]。

2.4 陰性對(duì)照品溶液制備

按處方比例模擬制作缺白芷或甘草的陰性對(duì)照品，按2.3項(xiàng)下方法制得陰性對(duì)照品溶液。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

A：對(duì)照品 B：樣品 C：缺甘草陰性對(duì)照品；D缺白芷陰性對(duì)照品

按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液10 μL進(jìn)樣。在此條件下，甘草酸和歐前胡素的理論板數(shù)大于4000，樣品、對(duì)照品、陰性對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖1。

3.2 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5、1、2、5、10 mL，置25 mL量瓶中，分別甲醇稀釋至刻度，搖勻，制備成甘草酸濃度為0.92、1.84、3.68、9.20、18.4μg·mL-1及歐前胡素濃度為0.496、0.992、1.984、4.96、9.92μg·mL-1系列混合對(duì)照品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以濃度C(μg.mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程：甘草酸Y=2.2066×105C-8.6503×104，r=0.9996，在0.92～18.4 μg·mL-1內(nèi)有良好線性關(guān)系；歐前胡素Y=1.02128×105C+5.4336×104，r=0.9998，在0.496～9.92 μg·mL-1內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

3.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，甘草酸和歐前胡素峰面積的RSD分別為1.08%和0.96%，表明儀器精密度良好。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品6份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按 2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，甘草酸和歐前胡素平均含量分別為2.1646 mg·g-1和0.2876 mg·g-1，RSD分別為1.29%和1.12%，表明方法重復(fù)性良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取0、2、4、6、8、12、24 h供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果甘草酸和歐前胡素峰面積RSD分別為1.45%和1.35%，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.6 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取6份風(fēng)濕定片(批號(hào)20110801)樣品置于50 mL量瓶中，每份約0.1 g，分別加入一定量的甘草酸銨和歐前胡素對(duì)照品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 風(fēng)濕定片中甘草酸和歐前胡素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.7 樣品測(cè)定

分別精密稱取0.2 g三批風(fēng)濕定片樣品，每批3份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，對(duì)三批風(fēng)濕定片中甘草酸和歐前胡素進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 三批風(fēng)濕定片中甘草酸和歐前胡素的含量

4 討論

4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用紫外掃描發(fā)現(xiàn)甘草酸在250 nm和360 nm有最大紫外吸收，歐前胡素最大吸收波長(zhǎng)有300、254、248 nm，選擇254 nm進(jìn)行檢測(cè)時(shí)兩種化合物的峰面積及峰高值均較大且各峰峰形良好，基線平穩(wěn)，分離較好，因此選擇254 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

4.2 流動(dòng)相的選擇

在流動(dòng)相的選擇中，選擇了甲醇-水、甲醇-0.05%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液乙腈-水、乙腈-0.05%甲酸水溶液及乙腈-0.1%甲酸水溶液系統(tǒng)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.05%甲酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)目標(biāo)化合物色譜峰對(duì)稱性好且基線平穩(wěn)，因此最終確定以乙腈-0.05%甲酸水溶液為流動(dòng)相[7-8]。

4.3 提取方法的選擇

在提取方法的選擇上，以《中國(guó)藥典》2015年版一部甘草和白芷[含量測(cè)定]項(xiàng)下樣品的提取條件為參考，分別對(duì)提取超聲時(shí)間及提取溶劑進(jìn)行優(yōu)化[9-10]?？疾炝?0%甲醇、75%甲醇、甲醇及50%乙醇、75%乙醇、無(wú)水乙醇分別在超聲15min、30min、45min及60min對(duì)2個(gè)成分的影響，當(dāng)采用75%甲醇作為提取溶劑，超聲30min是提取效率較高[11-12]，再延長(zhǎng)提取時(shí)間兩種化合物的量并沒(méi)有明顯差異，因此選擇提取條件為75%甲醇超聲提取30min。

本研究采用高效液相色譜法，建立了同時(shí)測(cè)定風(fēng)濕定片中甘草酸和歐前胡素含量的方法，該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，為評(píng)價(jià)風(fēng)濕定片的質(zhì)量提供依據(jù)。

[1]中國(guó)藥典委員會(huì).中國(guó)藥典一部[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2015:686-687.

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(本文文獻(xiàn)格式：曾上敏，秦斯民，曹華玲 .HPLC法同時(shí)測(cè)定風(fēng)濕定片中甘草酸和歐前胡素的含量[J].山東化工,2017,46(11):98-100,103.)

Simultaneous Determination of Glycyrrhizic Acid and Imperatorin in Fengshiding Tablets by HPLC

ZengShangmin,QinSimin,CaoHualing

(Guangdong Food and Drug Vocational College,Guangzhou 510520,China)

To establish a method for determinate Glycyrrhizic acid and Imperatorin in Fengshiding Tablets by HPLC simultaneously.The Diamonsil-C18(250 mm×4.6 mm, 5μm) chromatographic column was used with a mobile phase of acetonitrile-0.05% formic acid by gradient elution, the detection wavelength was at 254 nm, the column temperature was 25℃, and the flow rate was 1.0 mL·min-1.The linear ranges of Glycyrrhizic acid and Imperatorin were 0.92～18.4 μg·mL-1(r=0.9996), 0.496～9.92 μg·mL-1(r=0.9998) respectively. Average recoveries of two components were 98.5% with RSD 2.97% and 99.4% with RSD 1.20% respectively.The method was simple, sensitive and repeatable, could be used for the quality control of Fengshiding Tablets.

Fengshiding tablets; HPLC; glycyrrhizic acid; imperatorin

2017-03-31

曾上敏(1988—)，男，助教，從事藥物制劑方面的研究。

O657.7

A

1008-021X(2017)11-0098-03