饒大偉，伍 嬌，陳儀軒，楊 坤

(四川大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院 資源與環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065)

萬古霉素修飾磁性納米粒子用于富集分離細(xì)菌的研究

饒大偉，伍 嬌，陳儀軒，楊 坤*

(四川大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院 資源與環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065)

利用溶劑熱合成法制備Fe3O4磁性納米粒子，并以N-膦羧甲基)亞氨基二乙酸(PMIDA)為橋連接Fe3O4和萬古霉素從而形成Fe3O4-PMIDA-Van 體系用以富集并檢測(cè)致病菌，文中介紹了兩種不同的Fe3O4磁粒表面修飾方法， 采用紅外和Zeta電勢(shì)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行表征，并研究了其對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌(E.coli)和革蘭氏陽(yáng)性菌腸球(Enterococcus)的吸附作用。最后通過 PCR檢測(cè)的方法也確定磁粉富集菌體的有效性及。結(jié)果表明，該磁性納米顆粒能在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)樣品中細(xì)菌的富集,并且對(duì)菌體的吸附平衡可以用Langmuir吸附等溫性進(jìn)行描述，其對(duì)E. coli和Enterococcus的理論濃縮倍數(shù)分別高達(dá)2200和4000倍。

磁性納米粒子；菌體富集；PMIDA；萬古霉素

近年來，雖已經(jīng)開發(fā)出眾多精密的生物傳感器和分析方法用于致病菌的檢測(cè)[1-5]，但現(xiàn)今致病菌檢測(cè)方面的研究多重視檢測(cè)方法和設(shè)備(微設(shè)備或生物傳感器)的開發(fā)，卻忽視了樣品制備過程的重要性[6]。目前的檢測(cè)手段在檢測(cè)低濃度的 致病菌時(shí)，所需的富集培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，難以達(dá)到即時(shí)檢測(cè)的目的。

磁性納米粒子是近年發(fā)展起來的一種新型材料，由于具有超順磁性，在環(huán)境中能達(dá)到快速分離的作用而在生物技術(shù)領(lǐng)域被越來越多的研究學(xué)者關(guān)注。萬古霉素是一種糖肽類廣譜抗生素，它對(duì)細(xì)菌有吸附作用主要是萬古霉素與革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁表面末端D-Ala-D-Ala[7]部分，通過氫鍵來完成與革蘭氏陽(yáng)性菌的結(jié)合。因此為了結(jié)合以上兩種優(yōu)勢(shì)，通過文獻(xiàn)調(diào)研，我們發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷酸分子(磷酸化合物、含磷化合物、次磷酸化合物及其衍生物)與金屬氧化物、羥化物、磷酸鹽相互之間有著強(qiáng)烈親和作用[8]，因此我們選擇PMIDA(雙甘膦)—廉價(jià)的磷酸偶聯(lián)劑作為中間媒介，該分子中含有 1個(gè)磷酸基團(tuán)和 2個(gè)羧基，當(dāng)磷酸基團(tuán)和納米粒子形成緊密連接時(shí)，另一端的羧基與萬古霉素的亞氨基和氨基在EDC和NHS催化下反應(yīng)形成酰胺鍵，從而將 Fe3O4磁性納米顆粒與萬古霉素成功地結(jié)合在一起，形成Fe3O4-PMIDA-Van 體系。事實(shí)上，通過抗生素與致病菌之間的結(jié)合力來吸附菌體已經(jīng)有很多的報(bào)道，而本論文優(yōu)勢(shì)在于合成方法簡(jiǎn)單、快速，成本低，并且也取得了可觀的吸附效果，其對(duì)E. coli和Enterococcus的理論濃縮倍數(shù)分別高達(dá)2200和4000倍。

1 磁性Fe3O4-PMIDA-Van吸附菌體原理

圖1展示了在磁性納米粒子表面連接PMIDA以及萬古霉素的全過程。其中PMIDA是一種廉價(jià)的膦酸偶聯(lián)劑，有機(jī)膦酸分子(膦酸化合物、含磷化合物、次磷酸化合物和他們的衍生物)與金屬氧化物、羥化物、碳酸鹽、磷酸鹽的有強(qiáng)烈親和作用[8]該分子中含有1個(gè)磷酸基團(tuán)和2個(gè)羧基。當(dāng)磷酸基團(tuán)與納米粒子緊密相連時(shí)，另一端的-COOH使納米粒子間產(chǎn)生靜電排斥，這使得鐵磁流體異常穩(wěn)定，然后在EDC和NHS的催化下，PMIDA上的-COOH與表面含有-NH2的萬古霉素發(fā)生?；磻?yīng)，從而連接到MNP-PMIDA體系上。得到萬古霉素修飾的磁性納米顆粒Fe3O4-PMIDA-Van。其原理合成圖如圖1。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑與儀器

聚乙二醇 2000、聚乙二醇 6000、三氯化鐵(FeCl3·6H2O)、無水乙酸鈉、無水乙醇、氫氧化鈉，以上幾種藥品均為分析純，購(gòu)買于成都市科龍化工試劑廠；N-(膦?；谆?亞氨基二乙酸(PMIDA)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、N-3二甲基氨丙基-N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，以上藥品也同為分析純，購(gòu)買于合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，鹽酸去甲基萬古霉素(Van)、瓊脂糖購(gòu)買于biosharp公司，LB肉湯、營(yíng)養(yǎng)肉湯購(gòu)買于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。實(shí)驗(yàn)用水均為無菌水。

傅里葉變換紅外光譜儀，Z eta電位儀，ABI Veriti梯度PCR儀 9902(Applied Biosystems),多功能水平電泳槽 EPS600(Tanon)；凝膠成像儀 JY04S-3E(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)。

2.2 (Fe3O4-PMIDA-Van)復(fù)合納米粒子的合成

2.2.1 Fe3O4磁性納米粒子的表面活化

采用溶劑熱法制備取Fe3O4粒子，將FeCl3· 6H2O(2.7 g，10 mmol)，無水乙酸鈉(3.6 g)和聚乙二醇(1.0 g)加入乙二醇溶液(40 mL)中，待完全溶解，然后加入反應(yīng)釜中，在200 ℃下反應(yīng)8 h；將上步驟所得產(chǎn)物洗滌干燥處理后，取50 mg該粒子分散在1 mL去離子水中，加入NaOH(183 mg)，PMIDA(250 mg)，水浴條件下用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲探頭超聲15 min(5s開/5s關(guān)，2 %，20 ℃),然后于搖床27℃保溫振蕩8 h后。分離洗滌出粒子，然后分散在1 mL MES(110 mmol/L，pH值=5)緩沖液中，得到表面活化磁粉(Fe3O4-PMIDA)。

2.2.2 萬古霉素修飾表面活化的Fe3O4磁性納米粒子(Fe3O4-PMIDA-Van)

方法一：向以上分散在MES(110 mmol/L，pH值=5)緩沖液中的表面活化磁粉Fe3O4-PMIDA中加入EDC(33 mg)和NHS(9.99 mg)，于冰浴條件下用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)探頭超聲3 min(2%， 5 s 開/5 s 關(guān)， 20 ℃)后，搖床27 ℃保溫振蕩1 h。然后用MES(110 mmol/L，pH值=5)緩沖液洗滌3次，重新分散于1 mL的MES(110 mmol/L，pH值=5)緩沖液中，加入萬古霉素(50 mg)，于27 ℃搖床保溫振蕩24 h。反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水洗滌，得到萬古霉素修飾的磁性納米顆粒(Fe3O4-PMIDA-Van)。

方法二：稱取向1 mL MES(110 mmol/L，pH值=5)緩沖液中加入萬古霉素(15 mg)和 EDC(15 mg)，再加入分散于MES(110 mmol/L，pH值=5)緩沖液中Fe3O4-PMIDA混合液1 mL，于冰水浴條件下用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲(2%，5 s 開/5 s 關(guān)，20 °C)15min后。再將以上反應(yīng)液于普通超聲20 min，放于27℃搖床中保溫振蕩反應(yīng) 24 h。

2.3 Fe3O4-PMIDA-Van與菌體的吸附平衡實(shí)驗(yàn)

取20 μL Fe3O4-PMIDA-Van懸浮液與1mL不同細(xì)胞濃度的細(xì)菌稀釋液(用高壓滅菌蒸餾水制備)在管式旋轉(zhuǎn)器上在室溫下溫育10min后，使用強(qiáng)磁鐵將磁性顆粒與液相分離。記錄吸附前(和磁分離后)的液相在600nm的光密度(OD)值，通過適當(dāng)稀釋在線性范圍內(nèi)檢測(cè)所有光密度?；谖胶痛欧蛛x前后的懸浮液中的細(xì)菌量的差計(jì)算吸附細(xì)菌的量。對(duì)于大腸桿菌，顯示600 nm處的1 OD等同于2.5×1010CFU/mL，對(duì)于腸球菌，1OD = 6.4×109CFU/mL。通過將觀察數(shù)據(jù)擬合到Langmuir方程獲得吸附等溫線：

(1)

其中：

q：每毫升磁球中吸附的菌體數(shù)(CFU/mL)；c: 吸附平衡液相濃度(CFU/mL)；kd：解離常數(shù)(CFU/mL)；qmax：最大吸附量(CFU/mL)。

2.4 菌體的PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)了12 h的細(xì)菌培養(yǎng)物，通過高壓滅菌的蒸餾水將大腸桿菌稀釋成50至5×106CFU/mL，腸球菌稀釋成的細(xì)菌稀釋梯度1至105CFU/mL，每個(gè)菌體濃度的體積為3.6 mL，在添加Fe3O4-PMIDA-Van之前，①?gòu)拿總€(gè)管各自取90 μL樣品于新試管，再向每只試管中加入10 μL 0.25 mol/L的NaOH溶液用于隨后的PCR擴(kuò)增；②向每只試管中加入20 μL(Fe3O4-PMIDA-Van)磁粉，吸附10 min后，取出上清液90 μL，加入10 μL 0.25 mol/L的已滅菌的NaOH溶液裂解菌液；③向上述步驟②小心地除去剩余的上清液后，回收每個(gè)管中的顆粒-細(xì)菌聚集體，并重懸于20μL的0.025 mol/L NaOH中；另外，20μL Fe3O4-PMIDA-Van懸浮液加入3.6 mL以上稀釋所用的高壓滅菌過的蒸餾水中，經(jīng)過以上同樣的處理方式來作為陰性對(duì)照。將以上三組菌液放于75 ℃中保溫10min，使其裂解出DNA，使用強(qiáng)磁體從顆粒-細(xì)菌聚集體樣品和陰性對(duì)照中除去磁性顆粒，小心轉(zhuǎn)移上清液到干凈的離心管，液體樣品用作隨后PCR擴(kuò)增的模板。分別使用β-酰胺類抗生素的抗性基因Bla-TEM[9](FOR [5'-CATTTCCGTGTCGCCCTTATTC-3']和REV [5'-CGTTCATCCAT AGTTGCCTGAC-3'])和多粘菌素類抗性基因mcr-1[10](FOR [5'-CGGTCAGTCCGTTTGTTC-'3]和REV [5'- CTTGGTCGGTCTGTAGGG-3'])兩個(gè)特異性引物對(duì)來擴(kuò)增腸球菌和大腸桿菌選定的基因序列。其中Bla-TEM引物的PCR反應(yīng)條件為94℃ 5min的初始變性，35個(gè)循環(huán)的94℃ 30s，60℃ 30s和72℃ 48s，最后在72℃延伸5min終止反應(yīng)。mcr-1引物的PCR反應(yīng)條件為94℃ 15min的初始變性，33個(gè)循環(huán)的94℃ 30s，60℃ 90s和72℃ 48s，最后在72℃延伸5min終止擴(kuò)增。相應(yīng)的PCR產(chǎn)物大小為800bp和309bp。擴(kuò)增產(chǎn)物通過GelRed染色的瓊脂糖凝膠電泳(1.5%(w / v)瓊脂糖)檢查。

3 結(jié)果與討論

3.1 表征

通過FTIR檢測(cè)Fe3O4-PMIDA-Van磁性粒子表面上的官能團(tuán)，結(jié)果顯示在圖2中。圖2A為Fe3O4的紅外圖譜，中心在594 cm-1的特征峰可以歸因于Fe-O的伸縮振動(dòng)。3400 cm-1出現(xiàn)的峰值為Fe3O4表面羥基的特征峰；相比于2A，2B在1050 cm-1左右出現(xiàn)了較明顯的新吸收峰，推測(cè)為PMIDA叔胺結(jié)構(gòu)C-N的振動(dòng)吸收峰。并且B的整體吸收峰強(qiáng)度比A要有所增強(qiáng)，推測(cè)一方面為摻入新分子后Fe3O4納米粒子的晶化率降低，另一方面為連接的PMIDA分子含有羥基和強(qiáng)電負(fù)性O(shè)原子，易在Fe3O4納米粒子表面形成氫鍵，使化學(xué)鍵的極化程度增大，紅外吸收峰強(qiáng)度增強(qiáng)；在修飾上萬古霉素后，圖2C中1224.87 cm-1和1188.92 cm-1，推測(cè)為芳基醚與脂肪基醚C-O-C的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，1040 cm-1為它們的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰；1641 cm-1處的較強(qiáng)峰和1550 cm-1附近的較弱峰推測(cè)分別為酰胺基Ⅰ帶中C=O伸縮振動(dòng)和N-H彎曲振動(dòng)與酰胺基Ⅱ帶C-N伸縮振動(dòng)和N-H彎曲振動(dòng)，上述結(jié)果表明，PMIDA成功的將萬古霉素修飾到Fe3O4上形成Fe3O4-PMIDA-Van體系。而Zeta電勢(shì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(如表1)也印證了以上的結(jié)果，F(xiàn)e3O4的Zeta電勢(shì)為22.7 mV，主要是由于該用10 mmol/L的鹽酸活化因此表現(xiàn)正電荷，而Fe3O4-PMIDA的Zeta電勢(shì)-11.8 mV主要為修飾上PMIDA后，表面帶有的-COO-顯示出電負(fù)性， Fe3O4-PMIDA-Van的Zeta電勢(shì)42.5 mV，可能是由于修飾上萬古霉素表面的-NH2表現(xiàn)出正電勢(shì)。以上結(jié)果都是在蒸餾水中測(cè)量。

表1 Fe3O4，F(xiàn)e3O4-PMIDA和Fe3O4-PMIDA-Van(方法二)的電勢(shì)

圖2 Fe3O4，F(xiàn)e3O4-PMIDA和Fe3O4-PMIDA-Van的紅外圖譜

Fig.2 Infrared spectra of Fe3O4,Fe3O4-PMIDA and Fe3O4-PMIDA-Van

3.2 細(xì)菌濃度的定量分析過程

我們觀察到兩種方法制備的Fe3O4-PMIDA-Van顆粒對(duì)大腸桿菌和腸球菌的吸附平衡很好的符合了Langmuir(公式1)模型。兩種方法制備Fe3O4-PMIDA-Van顆粒對(duì)兩種細(xì)菌的吸附參數(shù)總結(jié)在表2中，在吸附等溫線的基礎(chǔ)上，使用質(zhì)量守恒分析來檢查磁性細(xì)菌濃縮過程，可以估計(jì)其濃度程度。當(dāng)菌液被稀釋到低濃度時(shí)(比如c≤105)，c值會(huì)比kd值小2個(gè)數(shù)量級(jí)，即c值相對(duì)于kd極小，可理解為kd+ c =kd，則Langmuir方程就可以被簡(jiǎn)化為：

(2)

而質(zhì)量平衡可以表達(dá)為：

c0V1=cV1+qVs

(3)

c0：原始菌液的濃度(CFU/mL)；V1：樣品溶液的體積(mL)；Vs：加入磁球的體積(mL)。

聯(lián)立等式(2)、(3)，可得：

(4)

所以，濃縮比q/C0可表達(dá)為：

(5)

其大小主要取決于磁球?qū)?xì)菌的吸附特性(qmax/kd)和固液兩相的比(V1/Vs)，

而當(dāng)V1/Vs趨近于無窮大時(shí)，理論最大濃縮比q/c0=qmax/kd。

圖3 方法一對(duì)大腸桿菌吸附數(shù)據(jù)擬合吸附等溫線

圖4 方法一對(duì)腸球菌的吸附數(shù)據(jù)擬合吸附等溫線

圖5 法二對(duì)大腸桿菌和腸球菌的吸附數(shù)據(jù)擬合吸附等溫線

由圖3～5的數(shù)據(jù)處理可知，F(xiàn)e3O4-PMIDA對(duì)兩種菌的理論最高濃縮比分別約為12倍和4倍，可見其對(duì)于細(xì)菌幾乎不存在吸附作用。而由方法一制得的Fe3O4-PMIDA-Van對(duì)大腸桿菌和腸球菌均表現(xiàn)出吸附作用。其中對(duì)大腸桿菌的理論最高濃縮倍數(shù)約2200倍，對(duì)腸球菌測(cè)理論最高濃縮倍數(shù)近1500倍，即方法一制得的Fe3O4-PMIDA-Van對(duì)大腸桿菌的吸附選擇性強(qiáng)于腸球菌(表2)。而由方法二制得的Fe3O4-PMIDA-Van只對(duì)腸球菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的吸附作用，理論最高濃縮比高達(dá)約4000倍；而對(duì)大腸桿菌的理論最高濃縮比僅約為500倍，方法二制得的Fe3O4-PMIDA-Van對(duì)腸球菌的吸附選擇性強(qiáng)于大腸桿菌(表3)。

表2 方法一 Fe3O4-PMIDA-Van對(duì)細(xì)菌吸附朗繆爾等溫線參數(shù)

表3 方法二 Fe3O4-PMIDA-Van對(duì)細(xì)菌吸附朗繆爾等溫線參數(shù)

3.3 磁性吸附及PCR-Gel檢測(cè)

使用方法一制備的Fe3O4-PMIDA-Van(Ⅰ)磁粉對(duì)大腸桿菌的水性樣品進(jìn)行磁性濃縮，隨后進(jìn)行PCR檢測(cè)。通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，如圖6所示。如凝膠中所示，在凝膠中都沒有看到非特異性產(chǎn)物，說明引物設(shè)計(jì)和PCR條件是比較合理的。從前7個(gè)樣品(泳道1至7)，可以看出對(duì)于大腸桿菌，無磁性濃度的PCR擴(kuò)增的檢測(cè)限為約106CFU / mL。接下來的六個(gè)樣品(泳道8至14)代表用Fe3O4-PMIDA-Van(Ⅰ)吸附后收集的上清液。測(cè)試的任何上清液中都沒有檢測(cè)到細(xì)菌，顯然，通過Fe3O4-PMIDA-Van(Ⅰ)的大腸桿菌捕獲效率非常高，在磁性濃縮(凝膠上的泳道15至21)后，分別將大腸桿菌的PCR擴(kuò)增的檢測(cè)限提高至104和103CFU / mL。而且比較前六個(gè)泳道和泳道15之間的條帶強(qiáng)度，細(xì)菌濃度變化是顯而易見的。

使用方法二制備的Fe3O4-PMIDA-Van(Ⅱ)磁粉對(duì)腸球菌的水性樣品進(jìn)行磁性濃縮后進(jìn)行PCR，通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，如圖7所示。從前7個(gè)樣品(泳道1至7)和接下來的用Fe3O4-PMIDA-Van(Ⅱ)吸附后收集的上清液的7個(gè)樣品(泳道8至14)測(cè)試中都沒有檢測(cè)到細(xì)菌，原因是原始樣品的濃度稀釋較低，未達(dá)到 PCR擴(kuò)增檢測(cè)不到的水平，但是，通過Fe3O4-PMIDA-Van(Ⅱ)磁性濃縮(凝膠上的泳道15至21)后，出現(xiàn)了兩條較強(qiáng)條帶，細(xì)菌濃度變化也是顯而易見的。

其中1-6、8-13分別為原始菌液、磁粉吸附原始菌液之后上清液，15-20為吸附菌液的磁粉菌體，而7，14，21分別陰性對(duì)照

圖6 Fe3O4-PMIDA-Van(Ⅰ)PCR分析

Fig.6 PCR analysis of Fe3O4-PMIDA-Van(Ⅰ)

其中1-6、8-13分別為原始菌液、磁粉吸附原始菌液之后上清液，15-20為吸附菌液之后的磁粉菌體，而7，14，21分別陰性對(duì)照

圖7 Fe3O4-PMIDA-Van(Ⅱ)PCR分析

Fig.7 PCR analysis of Fe3O4-PMIDA-Van(Ⅱ)

4 討論

以上的結(jié)果表示：方法一制得的Fe3O4-PMIDA-Van磁粒的細(xì)菌吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此法制得的磁粒對(duì)大腸桿菌的吸附選擇性強(qiáng)于腸球菌；而方法二的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)腸球菌的吸附選擇性強(qiáng)于大腸桿菌。方法一是先通過將已經(jīng)制得的Fe3O4-PMIDA用EDC與其PMIDA結(jié)構(gòu)中的羧基反應(yīng)生成一種不穩(wěn)定的脲衍生物中間物，再用NHS與該不穩(wěn)定中間產(chǎn)物反應(yīng)生成更穩(wěn)定的酯化物而增強(qiáng)碳二亞胺交聯(lián)產(chǎn)物的穩(wěn)定性[10-11]，防止其自身重排成相應(yīng)的穩(wěn)定的脲的副產(chǎn)物的方法獲得Fe3O4-PMIDA活化后的中間體，再用萬古霉素中的氨基和亞氨基進(jìn)攻該中間體的O-異酰基脲結(jié)構(gòu)形成酰胺交聯(lián)最終生成Fe3O4-PMIDA-Van磁粒。而方法二是先將EDC與萬古霉素溶解于MES緩沖液并混合一段時(shí)間，再將實(shí)驗(yàn)制得的Fe3O4-PMIDA加入混合液中以與方法一相同的原理進(jìn)行反應(yīng)，只是其中沒有加入NHS。

針對(duì)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們有如下猜測(cè)：

方法一制得的Fe3O4-PMIDA-Van磁粒對(duì)大腸桿菌的吸附選擇性強(qiáng)于腸球菌可能是因?yàn)槿f古霉素的氨基與亞氨基主要集中在吸附革蘭氏陽(yáng)性菌的活性部位內(nèi)部，而在萬古霉素以固體形式溶解于已經(jīng)充分活化的Fe3O4-PMIDA分散液時(shí)，該部位內(nèi)的氨基與亞氨基與活化的中間體發(fā)生快速反應(yīng)，導(dǎo)致大部分萬古霉素以單分子的形式連接在磁粒表面且其活性部位因結(jié)構(gòu)變化喪失活性。同時(shí)，以此方式連接的萬古霉素朝向外側(cè)的配糖基可能與革蘭氏陰性菌表面的尚未探究清晰的不知名的受體相結(jié)合導(dǎo)致該法制得的磁粒對(duì)大腸桿菌的吸附選擇性強(qiáng)于腸球菌；而據(jù)報(bào)道EDC也可用于活化磷酸酯基團(tuán)[12]，故推測(cè)過量的EDC使得PMIDA與Fe3O4所成的亞磷酸酯鍵斷裂，最終導(dǎo)致該實(shí)驗(yàn)方案難以獲得完整的Fe3O4-PMIDA-Van磁粒，這也可能是造成方法一中實(shí)驗(yàn)重復(fù)率較低的原因。

根據(jù)查閱的文獻(xiàn)可知萬古霉素吸附革蘭氏陽(yáng)性菌的原理為萬古霉素的N端(N-甲基亮氨酸)、B-羥基氯代酪氨酸、天冬氨酸以及對(duì)羥基苯基甘氨酸中的4個(gè)NH聚合成簇與D-Ala-D-Ala的C-端羧基陰離子形成氫鍵,且N端N-甲基亮氨酸折疊形成一個(gè)疏水的腔體,加強(qiáng)了該氫鍵作用力[13]，而本實(shí)驗(yàn)方法二所制備的磁粉對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的非常良好的吸附作用原因可能有：1)在萬古霉素溶解于MES緩沖溶液中，通過自身含有的大量氫鍵進(jìn)行了自組裝形成雙聚體；同時(shí)，在EDC的催化作用下，萬古霉素可能通過自身具有的羧基和氨基進(jìn)行分子間的酰胺化反應(yīng)形成二聚體甚至是多聚體。1998年，Williams[14]通過進(jìn)一步的研究表明萬古霉素二聚體的形成可大大提高萬古霉素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的吸附作用，并且形成二聚體的萬古霉素按照方法一里的方式連接在Fe3O4-PMIDA上后因不以單分子形式存在致使吸附部位仍具有活性，而配糖基中的氨基用于與其它萬古霉素分子的羧基進(jìn)行酰胺連接或背靠背形成雙聚體的話可能導(dǎo)致配糖基無法用于吸附革蘭氏陰性菌的未知受體，最終導(dǎo)致方法二制得的Fe3O4-PMIDA-Van磁粒對(duì)革蘭氏陰性菌吸附能力大大減弱[14-15]；2)方法二中EDC可能首先與萬古霉素反應(yīng)消耗了一定量。并且在Fe3O4-PMIDA加入后，由于反應(yīng)的難易程度，EDC可能選擇與羧基先進(jìn)行反應(yīng)進(jìn)而催化Fe3O4-PMIDA與萬古霉素的酰胺化反應(yīng)，沒有足夠的時(shí)間和濃度繼續(xù)催化Fe3O4-PMIDA亞磷酸酯基斷裂，使完整Fe3O4-PMIDA-Van形成的可能性大大增加；3)據(jù)報(bào)道，由于萬古霉素的過度使用,細(xì)菌糖蛋白合成啟動(dòng)子C-端(D-Ala-D-Ala)經(jīng)自身修飾部分變成D-Ala-D-Lactate,即以酯鍵代替酰胺鍵。酰胺鍵與酯鍵的轉(zhuǎn)換不僅導(dǎo)致一個(gè)氫鍵的減少,而且D-Ala-D-Lactate的酯氧原子與萬古霉素的對(duì)羥基苯基甘氨酸的羰氧原子之間的排斥作用使萬古霉素與胞壁酰五肽作用大大減弱。對(duì)于該類萬古霉素耐藥革蘭氏陽(yáng)性菌而言，EDC可能與萬古霉素的對(duì)羥基苯基甘氨酸的羧基進(jìn)行反應(yīng)生成不穩(wěn)定的脲衍生物中間物，而方法二中并未加入NHS，不穩(wěn)定的脲衍生物中間物進(jìn)而自身重排成相應(yīng)的穩(wěn)定的脲的副產(chǎn)物，該脲副產(chǎn)物中包含的許多酰胺鍵的-NH-可能與D-Ala-D-Lactate的酯氧原子形成氫鍵，提高萬古霉素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性耐藥菌的吸附能力。

5 結(jié)論

本篇文章運(yùn)用了一種簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)、對(duì)環(huán)境友好的合成方法，用PMIDA在磁性納米粒子表面引入活性集團(tuán)，再在EDC和NHS催化下與萬古霉素連接，形成Fe3O4-PMIDA-Van體系，用以吸附革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽(yáng)性菌腸球菌，通過實(shí)驗(yàn)和理論分析表明，經(jīng)修飾后的磁性納米粒子富集菌體稀釋液，可以將PCR檢測(cè)靈敏度提高兩到三個(gè)數(shù)量級(jí)。此種磁性納米粒子用在菌體的磁性分離中，可用于在短時(shí)間內(nèi)提高樣品中的菌濃度，大大縮短檢測(cè)時(shí)間，總體上，我們的研究表明本方法制備的磁粉和PCR檢測(cè)提供了一種吸引人的替代免疫磁性分離/PCR改進(jìn)農(nóng)業(yè)和食品生物技術(shù)應(yīng)用的病原體檢測(cè)。

[1] Lazcka O,Del Campo F J,Munoz F X.Pathogen detection: a perspective of traditional methods and biosensors[J].Biosens Bioelectron,2007,22:1205-1217.

[2] Palchetti I,Mascini M.Electroanalytical biosensors and their potential for food pathogen and toxin detection[J].Anal Bioanal Chem,2008,391:455-471.

[3] Morris B A,Sadana A.A fractal analysis of pathogen detection by biosensors[J].Biophys Chem,2005,113:67-81.

[4] Kim D K,Yoo S M,Park T J,et al.Plasmonic properties of the multispot copper-capped nanoparticle array chip and its application to optical biosensors for pathogen detection of multiplex DNAs[J].Anal Chem,2011,83:6215-6222.

[5] Cho I H,Irudayaraj J.In-situ immuno-gold nanoparticle network ELISA biosensors for pathogen detection[J].Int J Food Microbiol,2013,164:70-75.

[6] Brehm-Stecher B,Young C,Jaykus L A,et al.Sample preparation: the forgotten beginning[J].J Food Prot,2009,72:1774-1789.

[7] Walsh C. Microbiology-deconstructing vancomycin[J]. Science,1999,284(5413):442-443.

[8] Mutin P H,Guerrero G,Vioux A.Hybrid materials from organophosphorus coupling molecules[J].Journal of Materials Chemistry,2005,15(35-36):3761-3768.

[9] Liu Y Y,Wang Y,Walsh T R,et al. Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: a microbiological and molecular biological study[J].Lancet Infectious Diseases,2016,16(2):161-168.

[10] Lee J M,Edwards H H L,Pereira C A,et al.Crosslinking of tissue-derived biomaterials in 1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimide(EDC)[J]. J Biomed Med,1996,7(9):531-541.

[11] Olde D L H,Dijkstra P J,Van Luyn M J,et al.Cross-linked of dermal sheep collagen using a water-soluble carbodiimde[J].Biomaterials,1996,17(8):765-773.

[12] 喻 平,胡泉源,祁小云,等.EDC在有機(jī)合成中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].廣州化工,2011(8):9-11,23.

[13] Pearce C M,Gerhard U,Williams D H.Ligands whichbind weakly to vancomycin:studies by13C NMR spectroscopy[J].Journal of the Chemical Society,1995,12(1):159-162.

[14] Dancer R J,Try A C,Sharman G J,et al.Binding of a vancomycin group antibiotic to a cell wall analogue from vancomycin-resistant bacteria[J].Chemical Communications,1996,12:1445-1446.

[15] Konrad Bleicher,Mengfen Lin,And M J S,et al.Diffusion edited NMR: screening compound mixtures by affinity NMR to detect binding ligands to vancomycin[J].Journal of Organic Chemistry,1998,63(23):8486-8490.

(本文文獻(xiàn)格式：饒大偉，伍 嬌，陳儀軒，等.萬古霉素修飾磁性納米粒子用于富集分離細(xì)菌的研究[J].山東化工,2017,46(11):42-46.)

Vancomycin-modified Magnetic Nanoparticles and the Endowed Bacteria Enrichment Capacity

RaoDawei,WuJiao,ChenYixuan,YangKun*

(College of Chemical Engineering,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

In this study,magnetic Fe3O4nanoparticles were synthesized by solvent thermal synthesis method,followed by modifying the surface of Fe3O4nanoparticles containing hydroxyl using phosphonomethyl iminodiacetic acid,thus the formation of Fe-O-P bonds tightly fixed to the magnetic surface of the nanoparticles to successfully introduce -COOH. The s
Table surface functionalized nanoparticles were further linked with vancomycin (Van) for the enrichment of bacteria.Then the shape and structure of Fe3O4-PMIDA-Van Composite Nanoparticles were characterized by using a transmission electron microscope (TEM) .The adsorption capacity of the Van modified MNPs to gram-negative (E. coli) and gram-positive (Enterococcus)bacteria were determined,respectively. These result demonstrated that surface modified nanoparticles exhibited high affinity to bacteria,which could realize fast enrichment of bacteria from samples .And adsorption isotherms were obtained by fitting observed data to the Langmuir equation. In the case of bacteria concentration with the MNPs,the theoretical highest concentration ratio were calculated to be 2300 and 1300 for E. coli and Enterococcus,respectively.

magnetic nanoparticles;bacteria enrichment;PMIDA;Van

2017-04-07

國(guó)家自然科學(xué)基金(11375123)

饒大偉(1990—)，男，碩士在讀，主要從事化學(xué)與生物工程研究；*通訊作者：楊 坤，副教授。

TQ138.1

A

1008-021X(2017)11-0042-05