呂麗卿，劉曉玥

（北京三元種業(yè)科技股份有限公司飼料分公司，北京 101105）

高效液相色譜檢測技術(shù)在飼料分析中的應用和重要作用

呂麗卿，劉曉玥

（北京三元種業(yè)科技股份有限公司飼料分公司，北京 101105）

高效液相色譜檢測技術(shù)作為飼料成分檢測手段已被廣泛應用和認可，其涉及的檢測領域涉及飼料中營養(yǎng)物質(zhì)和非營養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、氨基酸、藥物殘留、真菌毒素和三聚氰胺等。在飼料國家標準中高效液相色譜法是應用最廣泛的檢測技術(shù)，可見此技術(shù)在儀器分析中發(fā)揮著重要的作用，具有很廣闊的應用前景。

高效液相色譜；飼料；營養(yǎng)物質(zhì)；非營養(yǎng)物質(zhì)；分析；應用

高效液相色譜法目前是飼料檢測中應用最廣泛的一項檢測技術(shù)，隨著飼料行業(yè)在中國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈中的不斷提升，預混料生產(chǎn)企業(yè)也都要求具備此檢測設備，如何讓它的能力發(fā)揮出來，是全體飼料檢測工作者的責任和使命。

1 高效液相色譜技術(shù)介紹

1.1 高效液相色譜發(fā)展歷程

液相色譜定義是二十世紀早期由俄羅斯植物學家Mikhail S·茨維特提出的。他最先嘗試在裝滿顆粒的柱子上使用溶劑來分離從植物中提取的化合物。茨維特用顆粒填滿開口的玻璃柱。他發(fā)現(xiàn)兩種特殊的材料，粉筆末和氧化鋁很有用。他將樣品倒入柱中，并讓樣品流過顆粒床，隨后加入純?nèi)軇?，隨著樣品由于重力自上而下流過柱子，可看到不同顏色的譜帶被分開，因為有些組分比另外一些移動得快。他將這些分開的不同顏色的譜帶與樣品中原有的不同化合物相關(guān)聯(lián)。他還根據(jù)每一種化合物對填料的化學親和性強弱，提出了分析這些化合物的分離規(guī)律。與顆粒填料有較強親和性的化合物移動慢，與溶劑有較強親和性的化合物移動快。這個過程可這樣描述：樣品中的化合物在流動的溶劑（流動相）與固體顆粒（固定相）間的分布不一樣。這樣使每一種化合物以不同的速度移動，從而產(chǎn)生了化合物之間的分離。高效液相色譜（HPLC）是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。

高效液相色譜法（HPLC）是20世紀60年代末期迅速發(fā)展起來的用于有機物定量分析的儀器分析方法。HPLC是在經(jīng)典液相色譜的基礎上，采用全多孔或非多孔高效微粒（1.7～10μm）固定相制備的色譜柱，由高壓輸液泵輸送流動相，用高靈敏度檢測器進行檢測，實現(xiàn)了高柱效、高選擇性和高靈敏度的快速分析，已成為有機物定量分析的主要分析工具。

高效液相色譜對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，因而彌補了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而80%則需用高效液相色譜來分析。

1.2 高效液相色譜分析原理

（1）高效液相色譜分析流程。由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng)，然后輸出，經(jīng)流量與壓力測量之后，導入進樣器。被測物由進樣器注入，并隨流動相通過色譜柱，在柱上進行分離后進入檢測器，檢測信號由數(shù)據(jù)處理設備采集與處理，并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復雜的混合物分離（極性范圍比較寬）還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似，不同的是氣相色譜改變溫度，而HPLC改變的是流動相極性，使樣品各組分在最佳條件下得以分離。

（2）高效液相色譜的分離過程。同其他色譜過程一樣，HPLC也是溶質(zhì)在固定相和流動相之間進行的一種連續(xù)多次交換過程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。

開始樣品加在柱頭上，假設樣品中含有3個組分，A、B和C，隨流動相一起進入色譜柱，開始在固定相和流動相之間進行分配。分配系數(shù)小的組分A不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱。分配系數(shù)大的組分C在固定相上滯留時間長，較晚流出色譜柱。組分B的分配系數(shù)介于A、C之間，第二個流出色譜柱。若一個含有多個組分的混合物進入系統(tǒng)，則混合物中各組分按其在兩相間分配系數(shù)的不同先后流出色譜柱，達到分離的目的。

（3）高效液相色譜的數(shù)據(jù)采集處理。當分開的化合物譜帶離開色譜柱后，進入檢測器。檢測器帶有可以在流動相背景下檢測到每個分開的化合物譜帶的流通池。一個合適的檢測器有能力辨別化合物的存在，并發(fā)送相應的信號到計算機數(shù)據(jù)站。

2 高效液相色譜在飼料分析與檢測中的應用

飼料成分非常復雜。一般將飼料成分分為營養(yǎng)物質(zhì)和非營養(yǎng)物質(zhì)兩大類，高效液相色譜在分析這兩類物質(zhì)分子組成和含量上具有獨特優(yōu)勢。

2.1 營養(yǎng)物質(zhì)分析中的應用

（1）檢測飼料中維生素。維生素是一種維持動物正常生理功能所必需的低分子有機化合物。與其他營養(yǎng)素相比，動物所需維生素的量很少，通常以微克（ug）或毫克（mg）計。但維生素又不同于微量元素，因為有機化合物，也與構(gòu)成動物生長的身體物質(zhì)和貯存物質(zhì)的營養(yǎng)素不同。缺乏維生素可引起動物代謝紊亂，影響動物健康和生產(chǎn)性能。動物獲得維生素最主要的途徑是飼料。目前情況下添加人工合成的維生素類飼料添加劑是補充飼料維生素含量不足的最主要途徑。按照溶解性，維生素可分為脂溶性維生素和水溶性維生素。除了氯化膽堿外，全部單一維生素均可運用高效液相色譜法測定，如VA、VD3、VE、VK3、VC、VB2、VB12等。

表1 維生素單體高效液相色譜法檢測方法匯總

（2）檢測飼料中氨基酸。動物對蛋白質(zhì)的需求本質(zhì)上是對氨基酸的需求。因此飼料中氨基酸的種類和含量是衡量其質(zhì)量高低的一項重要指標。氨基酸的測定方法很多，國家標準（GB/T 18246-2000）對飼料中氨基酸測定采用柱后衍生、用茚三酮作為衍生劑試劑的離子交換色譜法。而色氨酸的測定，目前多采用不同濃度、不同種類強堿水解樣品，再用比色法或高效液相色譜法（HPLC）等定量。安捷倫公司分析方法推薦用鄰苯二甲醛、9-芴甲基氯甲酸酯（OPA-FMOC）柱前衍生反相高效液相色譜法，以C18氨基酸分析柱，紫外檢測器，30min內(nèi) 17種氨基酸得到了分離。氨基酸濃度在 10～1000 pmol/μL范圍內(nèi)，其峰面積與氨基酸濃度的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.996。17種氨基酸的加標回收率在83.9%～109.8%范圍內(nèi)。

（3）檢測飼料中有機酸。飼料添加劑中有酸化劑的使用已被廣泛認可，但隨著價格的差異，也會存在一些摻假問題，因為傳統(tǒng)的滴定方法無法區(qū)分酸性物質(zhì)的種類，故高效液相色譜法的應用，解決了這個問題，國家標準中對有機酸的檢測進行了規(guī)定：飼料中丙酸和丙酸鹽的測定GB/T 17815-1999；飼料中酸化劑檸檬酸、富馬酸和乳酸的測定GB/T 23877-2009。在實際的檢測工作中有很好的指導意義。

2.2 非營養(yǎng)物質(zhì)分析中的應用

（1）檢測飼料中多種β-興奮劑。β-興奮劑是從天然兒茶酚胺衍生合成的一類化學結(jié)構(gòu)和生理功能類似腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙醇類衍生物，大體分為苯胺型（如克倫特羅等）、苯酚型（如沙丁胺醇、萊克多巴胺等）、苯二酚型（如特布他林、鹽酸多巴胺等）三大類。大量研究表明，在動物日糧中β-興奮劑可以提高飼料轉(zhuǎn)化率和增加瘦肉率，長期使用該類化合物會嚴重危害動物的肝臟、腎臟等內(nèi)臟器官，且在動物內(nèi)臟器官中的存留時間較長，一般烹飪過程很難使其失活，所以β-興奮劑可通過食物鏈進入體內(nèi)，嚴重危害人類健康。除了美國食品與藥物管理局（FDA，2004）批準僅萊克多巴胺可應用于豬和牛飼料外，其它歐美國家均禁用該類藥物。我國農(nóng)業(yè)部公告第235號（2002）規(guī)定嚴禁在畜牧生產(chǎn)上使用各種β-興奮劑類藥物。飼料中β-興奮劑的相關(guān)檢測方法較多，對鹽酸克倫特羅HPLC及GC-MS測定方法進行了比較，表明HPLC可作為一般定量測定方法，與GC-MS一起作為仲裁法，現(xiàn)兩種方法均已作為農(nóng)業(yè)部標準頒布實施。

（2）檢測飼料中的真菌毒素。①飼料中的真菌毒素——黃曲霉毒素，它是由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生的，主要包括B1、B2、G1和G2這4種毒素，其中，B1是毒性最強和危害最大的一種，B2和G2分別是B1和G1的雙羥基衍生物。當前，飼料中黃曲霉毒素的檢測方法主要采用薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法、免疫親和柱法以及熒光光度法等，隨著HPLC技術(shù)應用的日益普及，選用免疫親和層析柱凈化、高效液相色譜熒光檢測器進行檢測的方法對飼料中黃曲霉毒素 B1、B2、G1和G2進行檢測研究。②飼料中的真菌毒素——T-2毒素，主要由鐮孢菌屬產(chǎn)生，其檢測方法較多。目前，免疫親和柱凈化結(jié)合高效液相色譜法應用效果較好。③飼料中的真菌毒素——玉米赤霉烯酮（ZEN），又稱F2毒素，由鐮刀菌屬產(chǎn)生的一種真菌毒素，可引起人和動物雌激素過多綜合癥，具有生殖發(fā)育毒性、免疫毒性、基因毒性及可疑致癌性等。ZEN主要污染玉米、小麥等谷物類作物及其產(chǎn)品，由于其毒性，我國規(guī)定人用的小麥、玉米中ZEN含量不超過60μg/kg，飼料中ZEN含量不超過500μg/kg。國標GB/T 1954-2004規(guī)定，玉米赤霉烯酮的測定方法有薄層色譜法和酶聯(lián)免疫吸附法，但這些方法的樣品提取操作繁瑣耗時，需消耗大量的有機溶劑。近年來樣品處理方法不斷得到改進，同時結(jié)合高效液相色譜法的測定方法得到廣泛應用。

國家標準在真菌毒素中檢測方法匯總?cè)绫?所示。

表2 真菌毒素檢測方法國家標準匯總

（3）檢測飼料中的抗生素。飼料產(chǎn)品中抗生素藥物殘留問題一直是飼料執(zhí)法部門抽查的核心內(nèi)容，生產(chǎn)過程中的交叉污染、配方中使用過量等情況，都會造成飼料產(chǎn)品中存在不符合規(guī)定的藥物添加問題。液相色譜法是最佳的檢測手段，它為藥物含量及藥物殘留的檢出提供了儀器保障。也為飼料產(chǎn)品質(zhì)量安全提供了保障，企業(yè)可以自行完成各環(huán)節(jié)監(jiān)察工作。國家標準中在藥物檢測方法的規(guī)定最為全面，包括四環(huán)素類、氯霉素類、聚醚類、多肽類及化學合成類藥物，高效液相色譜可以在此領域的檢測發(fā)揮到極致。

（4）檢測飼料中的三聚氰胺。三聚氰胺（melamine）簡稱三胺，又名蜜胺，學名三聚酰胺，是一種重要的氮雜環(huán)有機化工原料，由于其分子中含有大量氮元素，而普通的全氮測定法不能排除這類偽蛋白氮的干擾，因而一些廠商為了降低成本而添加這種化工原料，以提高產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量。作為飼料中的非法添加，已得到廣泛關(guān)注，國家法律規(guī)定飼料中三聚氰胺含量小于2.5ppm，并制定了行業(yè)標準NY/T 2071-2011飼料中三聚氰胺的測定，為飼料檢測工作中起到了很好的指導作用。

隨著飼料業(yè)的不斷發(fā)展、現(xiàn)代儀器的不斷進步和在飼料企業(yè)中的廣泛應用，高效液相色譜技術(shù)發(fā)揮著非常重要的作用，它應用廣泛，適用領域?qū)?，改進和提升的空間較大，越來越被檢測人員所重視和推崇，液相色譜檢測技術(shù)已不再高深和無法駕馭，它也在隨著時代的步伐慢慢靠近人們?nèi)粘５臋z測工作中，成為最可信任的檢測工作，為產(chǎn)品安全提供最有效地保障，在飼料分析檢測中發(fā)揮更加廣泛的作用，做出更加卓越的貢獻。

［1］王傳蓉.高效液相色譜技術(shù)在飼料分析中的應用［J］.中國乳業(yè)，2012，130（10）：46-48.

［2］王玲，楊璐玲，孫國強.高效液相色譜技術(shù)在飼料分析中的應用研究進展［J］.中國飼料，2016，（6）：31-39.

呂麗卿，主要研究方向：飼料。