楊梓亨, 宋衛(wèi)鋒, 程亞杰, 李海宇, 簡靜儀

廣東工業(yè)大學環(huán)境科學與工程學院, 廣東 廣州 510006

ABR反應器處理苯胺黑藥廢水及其微生物種群結(jié)構(gòu)

楊梓亨, 宋衛(wèi)鋒*, 程亞杰, 李海宇, 簡靜儀

廣東工業(yè)大學環(huán)境科學與工程學院, 廣東 廣州 510006

苯胺黑藥廣泛用作鉛鋅硫化礦浮選捕收劑，是一種難生化降解浮選藥劑. 為考察苯胺黑藥的厭氧降解行為，采用ABR(厭氧序批式折流板反應器)對苯胺黑藥進行處理，利用掃描電鏡研究不同隔室中顆粒污泥的性狀，并采用Miseq高通量測序的方法分析起主要作用的隔室中的微生物群落組成. 結(jié)果表明，在進水ρ(苯胺黑藥)和ρ(CODCr)有一定波動情況下，苯胺黑藥和CODCr去除率在各階段均呈增加趨勢. 100 d成功啟動后運行穩(wěn)定；HRT(水力停留時間)為24 h時，苯胺黑藥和CODCr去除率分別為67%～71%和68%～73%. 反應器內(nèi)出現(xiàn)大量顆粒污泥，沿水流方向顆粒污泥粒徑分布逐漸減小，顆粒污泥規(guī)則、密實，不會流失. Miseq高通量測序結(jié)果表明，反應器第1格和第2格中綠彎菌門菌群所占比例(分別為24.73%和33.60%)最大，其次是厚壁菌門(分別為24.17%和20.92%)和變形菌門(分別為18.93%和20.88%)；在屬的水平檢測到Caldisericum、Leptolinea、Leuconostoc和Bacillus等，使得反應器具有較好的耐沖擊負荷和良好的降解作用. 研究表明，ABR對苯胺黑藥有良好的去除作用.

ABR反應器； 苯胺黑藥； 顆粒污泥； Miseq高通量測序

ABR(厭氧序批式折流板反應器)是一種高效厭氧處理工藝，在工業(yè)廢水處理領(lǐng)域應用前景廣闊. 該工藝使用一系列垂直放置的折流板使反應器分隔成多個連續(xù)的隔室，水流速度較慢，通過折流板的阻擋及污泥自身的沉降作用，使活性污泥顆粒被有效地截流在反應器內(nèi)，從而明顯提高了反應器的處理效率[1- 2]. ABR有利于產(chǎn)酸段和產(chǎn)甲烷段在不同的隔室內(nèi)進行，減緩了高負荷條件下低pH對甲烷菌的抑制作用，在不同隔室形成性能穩(wěn)定的微生物群落，使反應器具有抗沖擊負荷的能力[3]. ABR較好地實現(xiàn)了SMPA(分相多階段)的工藝思想，具有優(yōu)異的去除有機污染物的能力. 目前對ABR中微生物種群的研究主要集中在不同種類的甲烷菌上，而對酸化過程中起關(guān)鍵作用的其他種類的微生物在不同格室中的分布情況則研究較少.

苯胺黑藥(二苯胺基二硫代磷酸鹽)被廣泛用作鉛鋅硫化礦浮選過程的捕收劑，是選礦廢水中的主要污染物. 作為礦區(qū)水體環(huán)境優(yōu)先控制污染物，苯胺類化合物對生物具有一定的毒性，是一種難生化降解浮選藥劑，直接外排對自然環(huán)境有很大危害，在工業(yè)排水中被嚴格控制[4- 6]. 目前對苯胺黑藥的降解研究主要集中在物理化學法(如混凝法、酸堿中和法、化學氧化法、電化學催化法[7- 9])，對其厭氧降解研究甚少，只是初步研究其厭氧降解的機理，并未深入. 相較于好氧生物處理，厭氧生物法由于能耗低和產(chǎn)泥少等特點得到了廣泛應用，應用ABR處理苯胺黑藥廢水有現(xiàn)實必要性.

該研究采用由4個隔室串聯(lián)組成的容量為17.5 L 的厭氧折流板反應器處理苯胺黑藥廢水，著重考察了ABR工藝處理廢水中苯胺黑藥的效果，研究了不同隔室中顆粒污泥的性狀，分析了起主要作用的隔室的微生物群落組成，得到苯胺黑藥的厭氧降解的最佳條件，以期為有色金屬金屬選礦廢水的處理提供新的方法和途徑.

1 材料與方法

1.1試驗裝置

注：1—調(diào)節(jié)池；2—水泵；3—沼氣收集管；4—ABR；5—沉淀池；6—排水閥.圖1 ABR試驗裝置示意Fig.1 Schematic diagram of the ABR experimental equipment

試驗裝置如圖1所示，反應器由有機玻璃制成，有效容積17.5 L，由4個隔室組成，上下流室寬度比為5∶1. 沉淀池有效容積為1.55 L，上清液外排. 在反應器啟動初期投加活性炭促進顆粒污泥的形成[10].1.2試驗用水和運行方案

試驗用水為人工配制的模擬廢水，ρ(CODCr)及ρ(苯胺黑藥)的選取以實際礦山企業(yè)長期循環(huán)使用的選礦廢水水質(zhì)為依據(jù).ρ(CODCr)在450～600 mg/L之間，苯胺作捕收劑時，累積濃度約為200～300 mg/L.ρ(苯胺黑藥)從25 mg/L分階段逐步增至250 mg/L，按進水ρ(CODCr)的要求增減葡萄糖的添加量. 加入NH4Cl 和KH2PO4調(diào)節(jié)CODCr∶N∶P(質(zhì)量比)為200∶5∶1，最后按1 mL/L的量添加微生物生長所需的Ca、Mg、Fe、Co、Ni、Zn、B等微量元素，以保證微生物細胞合成的需要. 此外，配水時投加一定量的NaHCO3保證反應器內(nèi)的緩沖能力.

ABR反應器接種污泥取自廣州瀝滘污水廠的厭氧池，啟動初期投加粒徑為0.2～0.4 mm的活性炭促進顆粒污泥的形成，投加量為3 g/L. 待反應器出水苯胺黑藥去除率達到50%以上時，提高進水ρ(苯胺黑藥)，HRT為24 h，反應器溫度通過加熱棒控制在33～35 ℃.

定期(2～3 d)取樣測定反應器進水、出水的ρ(CODCr) 和ρ(苯胺黑藥). 所有的水樣均過濾后再進行分析. 反應器運行穩(wěn)定，取污泥樣品進行微生物種群結(jié)構(gòu)解析.

1.3分析方法

通過瑞利UV- 2100紫外/可見分光光度計對苯胺黑藥進行掃描，發(fā)現(xiàn)苯胺黑藥在λ=230 nm處有特征吸收峰. 配制苯胺黑藥標準溶液系列，在λ=230 nm 處依次測定吸光度，得到標準工作曲線(y=19.06x-4.418，R2=0.998)，通過水樣的吸光度值和標準工作曲線計算ρ(苯胺黑藥)，然后計算苯胺黑藥降解率[11].ρ(CODCr)采用標準方法[12]進行測定.

顆粒污泥粒徑采用濕式篩分析法測定，通過日立S- 3400N(Ⅱ)掃描電鏡觀察顆粒污泥形態(tài).

采用Miseq高通量測序解析微生物種群結(jié)構(gòu)[13]. 污泥樣品經(jīng)DNA提取和純化，對提取到的DNA進行瓊脂糖電泳檢測，查看基因組DNA的完整性與濃度. 利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，以確定PCR反應應加入的DNA量. PCR所用的引物已經(jīng)融合了Miseq測序平臺的通用引物. PCR結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，采用生工瓊脂糖回收試劑盒(cat：SK8131)對DNA進行回收. 回收產(chǎn)物用Qubit 2.0定量，根據(jù)測得的DNA濃度，將所有樣品按照1∶1的比例進行混合，混合后充分振蕩均勻. 用Miseq平臺測序(Illumina公司)，所得結(jié)果進行優(yōu)化. 采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似度水平的OTU代表序列進行分類學分析，分析樣品的多樣性以及群落結(jié)構(gòu).

2 結(jié)果與討論

2.1苯胺黑藥和CODCr的去除

在運行初期，投加葡萄糖作為進水碳源，有部分活性污泥漂浮及氣泡產(chǎn)生，運行2 d后下沉. 如圖2所示，運行到第10天，在進水中添加苯胺黑藥，進水ρ(苯胺黑藥)為29.04 mg/L ，出水ρ(苯胺黑藥)為7.13 mg/L，降解率達到75.46%. 這是由于ρ(苯胺黑藥)較低，對厭氧微生物毒性低，并且活性污泥具有吸附作用所致. 維持進水ρ(苯胺黑藥)基本穩(wěn)定，苯胺黑藥降解率逐漸下降，最低降至45.82%；之后有所升高，至第22天達到78.31%. 馴化中期隨進水ρ(苯胺黑藥)的提高，出水ρ(苯胺黑藥)逐步降低. 微生物此時已經(jīng)有了一定的活性抗擊苯胺黑藥的毒性[14]. 馴化后期，由于ρ(苯胺黑藥)高，降解效果波動較大，第68天時苯胺黑藥降解率達到最低，僅為9.03%. 此時，ρ(苯胺黑藥)高且存在累積，在一定程度上會抑制微生物的生長，停止進水6 d使微生物適應反應器內(nèi)的有毒環(huán)境，至第74天降解率恢復到65.40%. 整個馴化期間降解率曲線起伏不定，但各階段趨勢是不斷上升直至平穩(wěn). 厭氧污泥經(jīng)過100 d的馴化，當進水碳源中ρ(苯胺黑藥)達到250 mg/L時，其降解率達到70.00%左右并維持穩(wěn)定，出水最低ρ(苯胺黑藥)達到72.95 mg/L，降解率達70.22%.

圖2 反應器進出水苯胺黑藥質(zhì)量濃度及其去除率隨運行時間的變化Fig.2 Variation of aniline aerofloat concentration in the influent and effluent and aniline aerofloat removal efficiency with operation time

由圖3可見，運行階段ρ(CODCr)控制在500.00～700.00 mg/L，0～22 d出水ρ(CODCr)不斷下降，直至50.43 mg/L，CODCr去除率達到90.27%，這是因為在馴化初期接種污泥密閉24 h后大部分有機物已經(jīng)消耗，0～10 d進水碳源僅為微生物易于利用的葡萄糖，在厭氧反應器內(nèi)CODCr滿足了微生物生長；11～22 d低濃度的苯胺黑藥對微生物的生長影響不顯著. 微生物利用水中的營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)化為自身物質(zhì)不斷生長，隨著ρ(苯胺黑藥)的增加，CODCr去除率有所下降，第62天之前ρ(苯胺黑藥)相對較低，CODCr去除率維持在較高水平，其中在第36天和第48天測得CODCr去除率分別達到86.18%和83.59%. 苯胺黑藥在該濃度馴化的后期，微生物生長已適應該濃度梯度，繼續(xù)增加ρ(苯胺黑藥)則直接導致出水濃度升高. 隨著ρ(苯胺黑藥)的增加，CODCr去除率整體較前一階段有所降低，第80天僅為44.63%，后又逐漸升高. 至運行穩(wěn)定，CODCr去除率維持在70.00%以上. CODCr去除率趨勢基本與苯胺黑藥降解率趨勢吻合，反應器的前面隔室對有機物的去除起到主要作用[15].

圖3 反應器進出水ρ(CODCr)和CODCr去除率隨運行時間的變化Fig.3 Time course of ρ(CODCr) in the influent and effluent and CODCr removal efficiency

2.2顆粒污泥性狀

運行初期，活性炭表面附著大量微生物，可見活性炭對微生物有很強的吸附作用，能成為微生物良好的附著載體. 運行25 d時反應器底部出現(xiàn)少量顆粒污泥，60 d時反應器內(nèi)大量顆粒污泥形成，顆粒污泥的表面逐漸變得規(guī)則、光滑，強度逐漸提高，產(chǎn)氣明顯. 此時顆粒污泥的粒徑為0.25～2.00 mm，ρ(MLSS)為28 770 mg/L，MLVSS/MLSS為0.51.

ABR反應器內(nèi)不同隔室顆粒污泥的粒徑分布情況見表1. 由表1可見，反應器中顆粒污泥粒徑隨水流方向逐漸減小，反應器內(nèi)第3隔室和第4隔室顆粒污泥的粒徑相對較小，維持在0.33～2.00 mm之間.

研究認為，大顆粒污泥不如小顆粒污泥活性高[16- 17]，而且截留和過濾基質(zhì)也不如小顆粒污泥. 在各種運行條件下，顆粒污泥不會被沖出反應器，在試驗中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)顆粒污泥的流失.

表1 ABR反應器各隔室不同粒徑顆粒污泥粒徑的質(zhì)量分數(shù)

啟動成功后所形成的顆粒污泥形狀各異，有橢圓形、球形等，也有一些顆粒污泥呈破碎狀，說明此時顆粒污泥的強度還不夠高，還有待通過各種運行條件的近一步優(yōu)化而逐步得到提高. 顆粒污泥表面和內(nèi)部的微生物并未呈現(xiàn)明顯的分區(qū)分布，也有一些細菌以成簇、成團的方式出現(xiàn)，形成了一個互營共生的微生態(tài)系統(tǒng). 隨著運行時間增加，反應器內(nèi)的顆粒污泥變得更加規(guī)則、密實、光滑，顆粒污泥微生物菌群中甲烷八疊球菌占明顯優(yōu)勢. 顆粒表面凹凸不平，這使顆粒的比表面積明顯增加，有利于泥水接觸、明顯提高傳質(zhì)效果(見圖4). 顆粒污泥的表面和內(nèi)部微生物排列比較松散，而且出現(xiàn)微生物胞外聚合物，考慮主要是微生物在苯胺黑藥毒性抑制條件下，為解除環(huán)境壓力而產(chǎn)生的[18- 19].

2.3污泥微生物群落結(jié)構(gòu)解析

對ABR反應器第1、2隔室污泥進行高通量測序，分別得到 35 003 和 35 632 個有效序列，優(yōu)化后進行歸類，得到OTU數(shù). 在97%相似度水平，對所有序列進行OTU劃分，然后進行多樣性指數(shù)分析和群落結(jié)構(gòu)的分類學分析，結(jié)果見表2. Shannon-Wiener多樣性指數(shù)常用來定量描述一個區(qū)域的生物多樣性，其值越大，說明群落多樣性越高；Chao1和ACE指數(shù)在生態(tài)學中常用來估計物種總數(shù)，可以表征菌群豐度；Simpson指數(shù)在生態(tài)學中常常用來定量描述一個區(qū)域的生物多樣性，其值越大，說明群落多樣性越低. 厭氧活性污泥的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、Chao l和ACE指數(shù)較高，Simpson指數(shù)較低，表明其具有較高的菌群豐度和多樣性. Coverage指數(shù)表示各樣品文庫的覆蓋率，數(shù)值越高，則樣本中序列沒有被測出的概率越低，實際反映了本次測序結(jié)果代表樣本的真實情況. 第1隔室顆粒污泥的粒徑明顯大于第2隔室，第1隔室承受了更大的負荷，但第2隔室卻比第1隔室菌群豐度和多樣性高. 有研究表明，微生物多樣性與CODCr去除量有顯著相關(guān)性，CODCr去除量高導致Simpson指數(shù)低[20]. 因為第1隔室對CODCr去除起主要作用，所以使得第1隔室細菌多樣性低于第2隔室，這與文獻[20]的研究結(jié)果一致.

圖4 顆粒污泥的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.4 Scanning electron photomicrographs of granular sludge after the startup

隔室測序量∕條97%相似水平OTU數(shù)Shannon-Wiener多樣性指數(shù)指數(shù)ACE指數(shù)Chao1指數(shù)Simpson指數(shù)Coverage指數(shù)13500355436.679620584.579912968.25610.00740.905223563259646.783023288.219814747.68010.00620.8968

在門的水平，第1、2兩隔室的細菌種群分布如圖5所示. 由圖5可見，可以看出主要菌群為綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、嗜熱絲菌門(Caldiserica)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、螺旋菌門(Spirochaetae)、浮霉菌門(Planctomycetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、酸桿菌門(Acidobacteria)、廣古菌門(Euryarchaeota)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和綠菌門(Chlorobi). 其中綠彎菌門菌群所占比重最大(分別為24.73%和33.60%)，其次是厚壁菌門(分別為24.17%和20.92%)和變形菌門(分別為18.93%和20.88%).

圖5 在門的水平上不同隔室菌群的相對豐度Fig.5 Relative abundance of bacterial community of different compartments at phylum levels

厭氧污泥中的優(yōu)勢菌群綠彎菌門細菌是兼性菌，在光合作用中不產(chǎn)生氧氣，不能固氮，主要用來分解糖類物質(zhì)[21]，能降低降解苯胺黑藥產(chǎn)物中的糖類物質(zhì). 研究[22]表明，在厭氧污泥消化器中，優(yōu)勢菌就是綠彎菌門. 很多厚壁菌門細菌可產(chǎn)生內(nèi)生孢子，對脫水和極端環(huán)境有較強的抵抗力[23]，這使反應器具有較好的耐沖擊負荷. 變形菌門是細菌中最大的一門，包含多種代謝種類，在常規(guī)活性污泥系統(tǒng)、脫氮除磷系統(tǒng)都存在，主要作用是降解廢水中的有機物，同時完成整個系統(tǒng)的脫氮除磷[24, 25]. 這能去除降解苯胺黑藥所產(chǎn)生的NO3-、PO43-. 桿菌門菌群常在除磷系統(tǒng)中被報道，可降解蛋白質(zhì)、糖類等物質(zhì)[26]. 浮霉菌門細菌是一門水生細菌，其中一類和浮霉菌屬等關(guān)系較遠的細菌Planctomycetessp.能在缺氧的環(huán)境下利用亞硝酸鹽氧化銨離子生成氮氣來獲得能量，被稱作厭氧氨氧化菌，對反應器內(nèi)的脫氮起重要作用[27]，這與去除苯胺黑藥降解產(chǎn)物相吻合. 此外，系統(tǒng)中還存在其他細菌，如藍藻門(1、2隔室分別為0.07%和0.08%)具有固氮能力和對不良環(huán)境的抵抗能力，能增強系統(tǒng)的耐沖擊負荷.

表3列出了在屬(genus)水平上鑒定出的優(yōu)勢菌及其相對豐度. 綜合1、2隔室，豐度最高的為Caldisericum和Leptolinea. 其中Caldisericum屬于嗜熱絲菌門，是一種異養(yǎng)的厭氧高溫絲狀菌，在第1隔室中Caldisericum的豐度最高，為11.00%，第2隔室為6.61%，此菌能減少硫化物，對顆粒污泥的形成[28]和苯胺黑藥的降解起重要作用.Leptolinea屬于綠彎菌門，在第2隔室中的豐度最高，為12.09%，第1隔室為6.41%，此菌與ABR反應器內(nèi)的發(fā)酵產(chǎn)酸有關(guān)[29]. 其余一些豐度較低的細菌(Leuconostoc、Bacillus、Clostridium、Syntrophomonas、Azospira和Lactobacillus)屬于厚壁菌門，Leuconostoc對有毒環(huán)境有很強的抵抗能力，在工業(yè)中已被廣泛使用[30].Desulfovibrio屬于變形菌門；Planctomyces屬于浮霉菌門. 陳小清分離得到一株苯胺黑藥高效降解菌死亡谷枯草芽孢桿菌Bacillusvallismortis[11]. 總體而言，在反應器中產(chǎn)生的種類眾多的各類細菌進一步驗證了反應器對苯胺黑藥有降解作用.

表3 屬水平鑒定出的優(yōu)勢菌及其相對豐度

3 結(jié)論

a) 進水ρ(苯胺黑藥)和ρ(CODCr)有波動的情況下，出水苯胺黑藥和CODCr去除率隨反應器的穩(wěn)定而逐漸升高. 在運行穩(wěn)定、HRT為24 h，苯胺黑藥和CODCr的去除率分別為67%～71%和68%～73%，二者趨勢一致，表明ABR對苯胺黑藥有良好的去除作用.

b) ABR反應器內(nèi)能夠出現(xiàn)大量顆粒污泥，隨著隔室的推移，顆粒粒徑呈逐漸減小的趨勢，反應器內(nèi)顆粒污泥規(guī)則、密實，ρ(MLSS)高達 28 770 mgL，不會隨水流失，形成了能夠適應苯胺黑藥廢水水質(zhì)并降解苯胺黑藥的微生物群落結(jié)構(gòu).

c) 厭氧活性污泥樣品的Miseq高通量測序結(jié)果表明：在反應器第1隔室和第2隔室內(nèi)，綠彎菌門菌群所占比重最大(分別為24.73%和33.60%)，其次是厚壁菌門(分別為24.17%和20.92%)和變形菌門(分別為18.93%和20.88%). 其他優(yōu)勢菌群有嗜熱絲菌門、擬桿菌門、螺旋菌門、浮霉菌門、疣微菌門、酸桿菌門、廣古菌門、芽單胞菌門和綠菌門. 在屬的水平檢測到Caldisericum、Leptolinea、Leuconostoc和Bacillus等.

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Treatment of Aniline Aerofloat Wastewater Using Anaerobic Baffled Reactor and Analysis of Activated Sludge Community

YANG Ziheng, SONG Weifeng*, CHENG Yajie, LI Haiyu, JIAN Jingyi

School of Environmental Science and Engineering, Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006, China

An anaerobic baffled reactor was developed for the treatment of aniline aerofloat wastewater, a refractory flotation regent. Scanning electron microscopy revealed the shape and properties of granule sludge from different compartments. The microbial communities that might have promary functions were further analyzed by applying Miseq high-throughput sequencing approaches. The results showed that the removal efficiency of aniline aerofloat and CODCrincreased in each stage despite their great fluctuation in the influent. At a hydraulic retention time of 24 h, aniline aerofloat and CODCrremoval reached 67%- 71% and 68%- 73% after 100 days′ operation, respectively. A large amount of granular sludge formed in the reactor, and the particles size distribution was reduced in the direction of flow. The sludge was regular, close-grained and not lost. Miseq high-throughput sequencing results showed thatChloroflexiaccounted for most of the sequence (24.73% and 33.60%), followed byFirmicutes(24.17% and 20.92%) andProteobacteria(18.93% and 20.88%) at the phylum levels. At the genus levels,Caldisericum,Leptolinea,LeuconostocandBacilluswere identified, which meant the reactor had good resistance to impact load and good degradation effect. The study indicated that ABR may be an effective remover of aniline aerofloat.

ABR; aniline aerofloat; granular sludge; Miseq high-throughput sequencing

2016-12-17

：2017-05-09

廣東省科技計劃項目(2014A020209077)

楊梓亨(1992-)，男，廣東汕頭人，454284669@qq.com.

*責任作者，宋衛(wèi)鋒(1972-)，男，河南郟縣人，教授，碩導，主要從事水污染控制理論與技術(shù)研究，weifengsong@263.net

X703.1

：1001- 6929(2017)09- 1448- 07

ADOI：10.13198/j.issn.1001- 6929.2017.02.72

楊梓亨,宋衛(wèi)鋒,程亞杰,等.ABR反應器處理苯胺黑藥廢水及其微生物種群結(jié)構(gòu)[J].環(huán)境科學研究,2017,30(9):1448- 1454.

YANG Ziheng,SONG Weifeng,CHENG Yajie,etal.Treatment of aniline aerofloat wastewater using anaerobic baffled reactor and analysis of activated sludge community[J].Research of Environmental Sciences,2017,30(9):1448- 1454.