張安，趙佳琦，李曉婷，單旭菲，楊彬

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319）

脂磷壁酸對小鼠乳腺組織TLR2表達的影響

張安，趙佳琦，李曉婷，單旭菲，楊彬

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319）

為了研究脂磷壁酸對小鼠乳腺組織TLR2表達的影響，試驗采用小鼠為模型，用不同劑量的LTA對小鼠乳腺進行灌注，采用組織切片方法觀察小鼠乳腺組織的病理組織學變化，Real-time PCR方法檢測乳腺組織中TLR2以及炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達變化。結(jié)果表明，對照組乳腺腺泡正常，灌注LTA乳腺腺泡壁增厚，乳腺腺泡有中性粒細胞的浸潤。TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達水平比未注射LTA小鼠顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果表明TLR2介導(dǎo)的信號途徑能夠使炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達。

小鼠；乳腺組織；脂磷壁酸；TLR2

奶牛乳腺炎是一種主要由病原菌感染引起的一種復(fù)雜性疾病，是影響世界奶牛業(yè)健康發(fā)展的最主要疾病之一。引起奶?；既橄傺椎牟≡⑸镏饕写竽c埃希菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌及停乳鏈球菌[1-2]，脂磷壁酸是革蘭氏陽性菌特征性的膜結(jié)合聚合物[3]。脂多糖LPS常被用作模擬大腸桿菌來誘導(dǎo)實驗性體外和體內(nèi)乳腺炎，而LTA（lipoteichoic acid，LTA）常被用作模擬金黃色葡萄球菌來誘導(dǎo)實驗性體外和體內(nèi)乳腺炎[4-5]。

TLR是一類細胞表面的天然免疫受體，主要表達于免疫細胞和上皮細胞。宿主天然免疫系統(tǒng)主要通過位于細胞膜或胞內(nèi)體膜上的TLR來識別和監(jiān)測入侵的病原微生物，并對它們的刺激做出反應(yīng)。病原相關(guān)分子模式PAMPs激活TLRs信號通路，產(chǎn)生I型干擾素、炎癥細胞因子和趨化因子，同時也誘導(dǎo)樹突狀細胞的成熟，啟始適應(yīng)性免疫反應(yīng)[6]。TLR的配體能夠作為免疫佐劑影響適應(yīng)性免疫反應(yīng)[7]。TLR2能特異性識別革蘭氏陽性菌成分，包括脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）。TLR信號激活后，引起NF-κB和MAPK表達增加，調(diào)節(jié)各種免疫和炎癥介質(zhì)的基因表達，包括TNF-α、IL-1及IL-6[8]。研究發(fā)現(xiàn)TLR2可以作為奶牛乳腺炎候選基因，應(yīng)用于乳腺炎抗性分子標記輔助選擇育種[9]。TLR2過表達轉(zhuǎn)基因羊為研究TLR2在防衛(wèi)細菌侵染中的作用提供了一個理想的模型[10]。

研究以小鼠為模型，采用不同濃度的LTA灌注小鼠乳腺，觀察小鼠乳腺組織的病理組織學變化，檢測乳腺組織中TLR2以及炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達變化，為TLR2介導(dǎo)的乳腺炎炎性信號通路的研究提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

BALB/c小鼠購自長春市生物制品研究所；LTA購自InvivoGen公司；RNA提取所用Trizol購自Invitrogen；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takaka公司；實時定量PCR試劑盒購自Bio-Rad公司。

1.2 小鼠乳腺灌注

將6～8周齡雌鼠和雄鼠合籠飼養(yǎng)，當發(fā)現(xiàn)雌鼠懷孕，將懷孕雌鼠進行分組實驗，懷孕雌鼠產(chǎn)后用乙醚進行麻醉，對實驗組小鼠的乳腺灌注LTA（按照1 μg、5 μg、10 μg劑量），LTA溶解于生理鹽水，每個劑量6只，對照組灌注生理鹽水，各注射組都灌注到第4對乳腺。灌注12 h后將小鼠處死并且采集乳腺，將一側(cè)乳腺用甲醛固定液固定后，經(jīng)過脫水、透明、包埋、切片、HE染色等步驟，將切片置于顯微鏡下觀察與照相；另一側(cè)乳腺凍存于液氮中，用于提取RNA。

1.3 熒光定量PCR檢測

按照Trizol法提取組織總RNA，用NanoDrop2000超微量分光光度計測定RNA濃度及RNA的OD值后反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，用熒光定量PCR試劑盒對反轉(zhuǎn)錄的cDNA進行擴增，以內(nèi)參β-actin進行目的基因相對表達量的計算。

表1 熒光定量PCR用到的引物和序列Table 1Primers and sequences for Real-time PCR

1.4 統(tǒng)計分析

采用統(tǒng)計軟件SPSS17.0對熒光定量PCR數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，P＜0.05或P＜0.01為具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 小鼠乳腺的病理組織學變化

將LTA按不同劑量灌注小鼠乳腺，灌注12 h后，對照組乳腺腺泡正常，未出現(xiàn)病理變化，腺泡腔內(nèi)可見乳汁；灌注1 μg LTA乳腺腺泡壁增厚，乳腺腺泡有少量中性粒細胞的浸潤；灌注5 μg和10 μg LTA乳腺腺泡壁增厚，乳腺腺泡有大量中性粒細胞的浸潤（圖1）。

2.2 LTA對小鼠乳腺組織中TLR2、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達的影響

采用熒光定量PCR方法對小鼠乳腺組織中TLR2、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達水平進行檢測，結(jié)果顯示，與對照組相比，不同劑量LTA灌注小鼠乳腺中TLR2、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05），并且表達水平隨劑量的增加而升高（圖2）。

圖1 不同劑量的LTA注射小鼠乳腺后炎性細胞增多Fig.1 Inflammatory cells increased in the mammary glands of mice after different doses of LTA infusion

圖2 不同劑量的LTA灌注小鼠乳腺后TLR2、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的相對表達量Fig.2Relative expression of TLR2，TNF-α，IL-1β and IL-6 mRNA in the mammary glands of mice after different doses of LTA infusion

3 討論

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)Toll樣受體在奶牛乳腺炎發(fā)病過程中起重要作用，臨床乳房炎奶牛的乳腺組織中TLR4、TNF-α和IL-1β的表達水平比健康奶牛的表達水平顯著升高[11]。用大腸桿菌人工感染小尾寒羊乳房結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染大腸桿菌后乳腺組織中TLR4的表達明顯上調(diào)[12]。用金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)大鼠乳腺炎模型發(fā)現(xiàn)TLR2、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達水平顯著升高[13]。研究用LTA灌注小鼠乳腺發(fā)現(xiàn)炎性細胞的浸潤及炎性細胞因子表達水平的明顯升高，表明乳腺發(fā)生感染時，乳腺組織分泌的炎性細胞因子促進炎性細胞遷徙到乳腺腺泡當中。

TLR2是革蘭氏陽性菌及其病原相關(guān)分子模式LTA的特異性受體。用金黃色葡萄球菌LTA灌注奶牛乳腺發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)乳腺趨化因子及炎性細胞因子的升高[14-15]。試驗用不同劑量金黃色葡萄球菌LTA灌注小鼠乳腺組織后，乳腺組織中TLR2 mRNA的表達水平均顯著升高，且TLR2表達升高與乳腺組織損傷及炎性細胞因子的釋放密切相關(guān)，這表明TLR2信號途徑在金黃色葡萄球菌乳腺炎發(fā)病機制中發(fā)揮著重要的作用。

小鼠乳腺炎模型能夠用來監(jiān)測宿主免疫應(yīng)答、乳腺炎的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸，小鼠乳腺炎模型與大動物模型相比具有用時短、高效、節(jié)省成本等優(yōu)點，而且近交系小鼠具有相同的基因，降低了動物之間的差異[16]。革蘭氏陰性菌脂多糖LPS作為一種誘導(dǎo)小鼠乳腺炎的常用內(nèi)毒素，而且LPS能夠通過TLR4的途徑激活NF-κB[17-18]。在金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)心肌功能障礙的研究中發(fā)現(xiàn)LTA能夠誘導(dǎo)TLR2野生型小鼠心臟TLR2的上調(diào)，并且激活NF-κB，使細胞因子的表達升高，而在TLR2缺失小鼠中沒有這些效應(yīng)。這些研究結(jié)果與研究的LTA能夠引起小鼠乳腺TLR2及炎性細胞因子表達的升高相一致[19]。

［1］張哲，李新圃，楊峰，等.奶牛乳腺炎疫苗免疫佐劑研究進展［J］.中國奶牛，2015（14）：14-18.

［2］朱嬌玲，喬霞，李雪，等.奶牛乳腺炎表皮葡萄球菌耐藥性及生物被膜形成相關(guān)基因的研究［J］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學學報，2015，36（2）：1-8.

［3］Reichmann N T，Grundling A.Location，synthesis and function of glycolipids and polyglycerolphosphate lipoteichoic acid in Gram-positive bacteria of the phylum Firmicutes［J］.FEMS Microbiol Lett，2011，319（2）：97-105.

［4］Im J，Lee T，Jeon J H，et al.Gene expression profiling of bovine mammary gland epithelial cells stimulated with lipoteichoic acid plus peptidoglycan from Staphylococcus aureus［J］.Int Immunopharmacol，2014，21（1）：231-240.

［5］Wellnitz O，Zbinden C，Huang X，et al.Short communication：Differential loss of bovine mammary epithelial barrier integrity in response to lipopolysaccharide and lipoteichoic acid［J］.J Dairy Sci，2016，99（6）：4851-4856.

［6］Medzhitov R.TLR-mediated innate immune recognition［J］.Semin Immunol，2007，19（1）：1-2.

［7］Steinhagen F，Kinjo T，Bode C，et al.TLR-based immune adjuvants［J］.Vaccine，2011，29（17）：3341-3355.

［8］Tan R S，Ho B，Leung B P，et al.TLR cross-talk confers specificity to innate immunity［J］.Int Rev Immunol，2014，33（6）：443-453.

［9］張翠霞，王洪梅，李建斌，等.荷斯坦牛TLR2基因遺傳多態(tài)性與乳腺炎抗性關(guān)系分析［J］.中國獸醫(yī)學報，2009，29（8）：1065-1068.

［10］張弘韜，潘求真，馮國興，等.外源Toll樣受體2轉(zhuǎn)基因綿羊的構(gòu)建與鑒定［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2013，25（6）：26-30.

［11］余盼，孫宇，李蓮，等.乳房炎奶牛乳腺組織中TLR4/ p38的表達差異分析［J］.南京農(nóng)業(yè)大學學報，2015，38（6）：967-972.

［12］陳富強，張小麗，李發(fā)弟，等.TLR4基因在小尾寒羊乳房炎乳腺組織中的表達［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2016，24（3）：349-356.

［13］Wang H，Yu G，Yu H，et al.Characterization of TLR2，NOD2，and related cytokines in mammary glands infected by Staphylococcus aureus in a rat model［J］.Acta Vet Scand，2015，57：25.

［14］黃媛琴，于晶，崔長艷，等.1日齡五指山豬胸腺的解剖及組織形態(tài)學觀察［J］.延邊大學農(nóng)學學報，2016（2）：161-165.

［15］Bougarn S，Cunha P，Harmache A，et al.Muramyl dipeptide synergizes with Staphylococcus aureus lipoteichoic acid to recruit neutrophils in the mammary gland and to stimulate mammary epithelial cells［J］.Clin Vaccine Immunol，2010，17（11）：1797-1809.

［16］Ingman W V，Glynn D J，Hutchinson M R.Mouse models of mastitis-how physiological are they［J］.Int Breastfeed J，2015，10：12-14.

［17］Kobayashi K，Oyama S，Uejyo T，et al.Underlying mechanisms involved in the decrease of milk secretion during Escherichia coli endotoxin induced mastitis in lactating mice［J］.Vet Res，2013，44：119120.

［18］Kobayashi K，Oyama S，Numata A，et al.Lipopolysaccharide disrupts the milk-blood barrier by modulating claudins in mammary alveolar tight junctions［J］.PLoS One，2013（4）：62187.

［19］Boehm O，Knuefermann P，Plueck J，et al.TLR2 stimulation induces cardiac inflammation but not cardiac depression in vivo［J］.Inflamm（Lond），2013，10（1）：33-35.

Effect of Lipoteichoic Acid on TLR2 Expression in Mammary Tissue of Mice

Zhang An，Zhao Jiaqi，Li Xiaoting，Shan Xufei，Yang Bin
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

In order to investigate the effect of lipoteichoic acid（LTA）on TLR2 expression in mammary tissue of mice，mice were used as model，and mammary infusion was taken with different doses of LTA.Tissue section method was used to observe pathological histological changes in mammary tissue.Real-time PCR was used to detect TLR2，TNF-α，IL-1β and IL-6 mRNA in mammary tissue after LTA infusion.The results showed that the mammary alveolars of control group were normal，perfusion LTA mammary gland bubble wall thickening，inflammatory cells increased in mammary tissue after LTA infusion.The expression levels of TLR2，TNF-α，IL-1β and IL-6 mRNA significantly increased in LTA infused mammary gland（P＜0.05）.The results indicated that TLR2 mediated signal pathway could lead to the inflammatory cytokine expression.

mice；mammary tissue；lipoteichoic acid；TLR2

S852.3

A

1002-2090（2017）04-0024-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.006

2016-12-15

黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目。

張安（1995-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院動物醫(yī)學專業(yè)2013級本科生。

楊彬，男，講師，E-mail：yangbin_nm@126.com。