楊萍萍

（大理白族自治州環(huán)境監(jiān)測站云南大理671000）

浮游植物顯微鏡計數(shù)方法適用范圍探究

楊萍萍

（大理白族自治州環(huán)境監(jiān)測站云南大理671000）

通過采集洱海浮游植物樣品對各顯微鏡計數(shù)方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明：全片法適用于浮游植物細(xì)胞密度低水體的測定，行格法適用于浮游植物細(xì)胞密度適中水體的測定，對角線法適用于浮游植物細(xì)胞密度適中或高水體的測定。

浮游植物；數(shù)量測定；顯微鏡

引言

浮游植物是指生活在水中營浮游生活的自養(yǎng)型生物，也被稱為浮游藻類，已知淡水藻類有25000種左右，而中國已發(fā)現(xiàn)的淡水藻類約9000種[1]，浮游植物是水體生態(tài)系統(tǒng)的重要初級生產(chǎn)者，其種類組成和數(shù)量分布的生態(tài)學(xué)特征是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要研究內(nèi)容[1、2]。浮游植物對其所處的水生態(tài)環(huán)境反應(yīng)靈敏，能夠?qū)λw營養(yǎng)狀態(tài)的變化迅速做出響應(yīng)，其種屬組成及群落結(jié)構(gòu)能夠準(zhǔn)確反映水環(huán)境現(xiàn)狀，是評價水環(huán)境現(xiàn)狀的重要指示生物[1]。

顯微鏡計數(shù)法是目前淡水浮游植物測定的基本方法。隨著科技的發(fā)展，浮游植物測定還有分光光度法、熒光分光光度法、流式細(xì)胞顯微鏡計數(shù)法、庫爾特計數(shù)法等。[3]但是這幾種方法僅能夠分析測定浮游植物細(xì)胞密度，顯微鏡計數(shù)法不僅可以測定水體中浮游植物細(xì)胞密度，還可以進(jìn)行浮游植物的種屬及群落結(jié)構(gòu)分析，仍是目前進(jìn)行浮游植物測定的主流方法。

目前國家尚未出臺浮游植物測定的標(biāo)準(zhǔn)方法，實際應(yīng)用中顯微鏡技術(shù)法還分為全片計數(shù)法、行格計數(shù)法、對角線計數(shù)法。[1、4]各種方法針對不同水體浮游植物存量存在不同的使用范圍。為探究各種方法的優(yōu)缺點及適用范圍，采集洱海水樣，通過濃縮、稀釋處理調(diào)整樣品濃度，分別用三種不同技術(shù)方法進(jìn)行測定，比較分析各種方法利弊及適用范圍。

洱海屬于中營養(yǎng)湖泊，位于高原，浮游植物種屬豐富。根據(jù)大理州環(huán)境監(jiān)測站2013-2015對洱海浮游植物36期396組定性、定量標(biāo)本測定結(jié)果，共采集鑒定到浮游植物8門71屬。浮游植物種屬豐富，細(xì)胞個體從大到小均有所涵蓋，適宜作為浮游植物測定實驗水樣。

1 材料和方法

1.1 試劑和設(shè)備

魯哥氏液，40 g碘溶于含碘化鉀60 g的1 000 m L水溶液中；2.5 L有機玻璃采水器；Nikon 50i顯微鏡；顯微鏡數(shù)碼相機；0.1 mL藻類計數(shù)框，20×20 mm，框內(nèi)橫豎各10格；22×22 mm蓋玻片；100μl移液槍。[8]

1.2 水樣的采集與制備

從洱海中采集水樣，經(jīng)初步測定，水樣初始濃度為107個細(xì)胞/升。于相同點位相同時間共采集3個樣品，用有機玻璃采水器采集表層水樣1L，裝入樣品瓶，現(xiàn)場加入15ml魯哥試劑固定。將兩個樣品分別進(jìn)行稀釋和濃縮，經(jīng)稀釋10倍調(diào)整濃度到106個細(xì)胞/升，濃縮10倍調(diào)整濃度至108個細(xì)胞/升。[8]濃度調(diào)整后，作為初始樣品，針對三種濃度水樣，待計數(shù)。

1.3 顯微鏡計數(shù)

分別用全片計數(shù)法、行格計數(shù)法、對角線計數(shù)法（分別簡稱：全片、行格、對角），對每一濃度樣品計數(shù)，每個樣品每種方法計數(shù)7次，報出7次計數(shù)結(jié)果及種屬組成，并對計數(shù)時間、溫度、濕度等實驗條件進(jìn)行記錄。藻細(xì)胞分類等級定到屬。[9]計數(shù)時，若破損細(xì)胞或葉綠體缺失則不計數(shù)。若計數(shù)過程中由于時間較長，水分蒸發(fā)導(dǎo)致裝片產(chǎn)生氣泡，則應(yīng)重新制片計數(shù)。每個水樣平行計數(shù)2次，計數(shù)結(jié)果與其平均值之差控制在±15%以內(nèi)。

全片計數(shù)法：對計數(shù)框內(nèi)100個小格的全部藻體進(jìn)行計數(shù)；行格計數(shù)法：計數(shù)框每列或每行的10個小格組成一個長條，對計數(shù)框內(nèi)第2、5、8條長條計數(shù)。與長條右側(cè)或下刻度相交的個體計數(shù)，與左側(cè)或上刻度相交的個體不計數(shù)。對角線計數(shù)法：計數(shù)框?qū)蔷€上的十個小方格區(qū)域內(nèi)的所有藻細(xì)胞逐一分類計數(shù)。破損細(xì)胞不計數(shù)。[5、6]

2 實驗結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)結(jié)果

通過對三組樣品采用不同方法計數(shù)，共獲得浮游植物測定數(shù)據(jù)351組，其中每組包含浮游植物細(xì)胞密度及水樣中浮游植物種屬組成、計數(shù)時長（表1-3）。其中，108濃度樣品由于水樣中藻類細(xì)胞濃度高，藻類種屬較多，根據(jù)行格計數(shù)法所用時間估算，若物鏡倍數(shù)為20倍條件下，全片計數(shù)法平均計數(shù)時長約為2小時23分鐘。計數(shù)時間較長，且裝片在計數(shù)至50分鐘左右（雨天溫度13度，濕度68%）蒸發(fā)出現(xiàn)氣泡，導(dǎo)致不能完成實驗。若在物鏡倍數(shù)為10倍條件下，除轉(zhuǎn)板藻、新月藻等大型藻體外，大部分藻屬細(xì)胞較小，計數(shù)較困難。單細(xì)胞藻類如小環(huán)藻、衣藻、藍(lán)隱藻、藍(lán)纖維藻、四角藻等在10倍物鏡下較難分辨，故108樣品濃度進(jìn)行全片計數(shù)不可行。

表1 洱海水樣三種藻類計數(shù)方法實驗結(jié)果單位：個細(xì)胞/升

2.2 結(jié)果分析

從實驗結(jié)果中得知，當(dāng)水體中浮游植物細(xì)胞密度較低時，對角線法和行格法實驗結(jié)果相近，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較高，測定出細(xì)胞種屬數(shù)較全片法少。全片法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較低，結(jié)果穩(wěn)定，所觀察中出現(xiàn)的浮游植物種屬較其他兩種方法多。故全片法適用于浮游植物細(xì)胞密度低的水體的測定。

當(dāng)水體中浮游植物細(xì)胞密度適中時，行格法和全片法相對對角線法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，結(jié)果較穩(wěn)定，從浮游植物種屬組成、浮游植物細(xì)胞密度結(jié)果、計數(shù)時長等綜合分析，行格法較適用于浮游植物細(xì)胞密度適中的水體。

當(dāng)水體中浮游植物細(xì)胞密度較高時，全片法已不能正常使用，此時行格法與對角線法測定出種屬組成相近。行格法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較低，結(jié)果較穩(wěn)定，但細(xì)胞密度測定結(jié)果較低，技術(shù)時間長。對角線法細(xì)胞密度測定結(jié)果與多種方法測定結(jié)果均值相近，計數(shù)時長適中，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在15%以內(nèi)。故對角線法較適宜浮游植物細(xì)胞密度較高的水體。

2.3 各種計數(shù)方法比較

各種浮游植物顯微鏡技術(shù)方法優(yōu)缺點比較。

表2 浮游植物顯微鏡計數(shù)方法對比分析

結(jié)語

浮游植物種類及群落結(jié)構(gòu)分析對深入研究淡水浮游植物生理特征、群落結(jié)構(gòu)及功能、在淡水生態(tài)系統(tǒng)中的作用都具有重要的科學(xué)意義。[1]顯微鏡計數(shù)法中對角線法、行格法、全片法在不同實驗條件下具有各自的優(yōu)缺點。

全片法測定結(jié)果穩(wěn)定，測定出種屬全；但工作量最大，不適用于高濃度浮游藻類樣品。行格法實驗測定耗時相對全片法短，測定樣品速率適中；但在低濃度時測定結(jié)果不穩(wěn)定，測定出種屬少，對于高密度浮游植物水樣，計數(shù)耗時較長，由于水分蒸發(fā)計數(shù)框內(nèi)會產(chǎn)生氣泡，影響計數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。對角線法實驗測定耗時短，測定樣品速率高，對角線選取樣品分布具有代表性；但在低濃度時測定結(jié)果不穩(wěn)定，測定出種屬少。全片法適用于浮游植物細(xì)胞密度低時的測定，行格法適用于浮游植物細(xì)胞密度適中情況下的測定，對角線法適用于水體中浮游植物細(xì)胞密度適中或較高時的測定。選擇適當(dāng)?shù)母∮沃参镉嫈?shù)方法對浮游植物的研究十分重要，可以根據(jù)樣本大小、便于分析、樣品處理率等不同的需求選擇最佳計數(shù)方法。

[1]錢奎梅，劉霞，陳宇煒，淡水浮游植物計數(shù)與定量方法湖泊科學(xué)2015，27（5）：767-775.

[2]李志勇，劉津，高東微等.瓶裝飲用水中浮游藻類計數(shù)方法研究[J].食品科技.2009.34（7）:266-270.

[3]金玉，張瑜霞，李愛軍等對角線法分析高密度浮游藻類數(shù)量的研究環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2013（36）

[4]張瑜霞，金玉，施擇等富營養(yǎng)化水體藻類顯微鏡計數(shù)方法改進(jìn)研究福建分析測試，2014，23（1）

[5]趙孟緒水庫藻類監(jiān)測原理與方法分析[J].廣東水利水電.2010.8:61-63.

[6]劉曉江，施心路，齊桂蘭等.淡水藻類在監(jiān)測水質(zhì)和凈化污水中的應(yīng)用[J].生物學(xué)雜志，2010，27（6）:76-78，86.

[7]張秋勁，何冬瓊，于飛等.四川省重點流域浮游植物群落調(diào)查研究[J].中國環(huán)境監(jiān)測，2012，28（5）:53-56.

[8]國家環(huán)境保護總局，水和廢水分析方法編委會水和廢水監(jiān)測分析方法[M].北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社.2002.

[9]胡鴻鈞，魏印心.中國淡水藻類：系統(tǒng)、分類及生態(tài)[M].北京:科學(xué)出版社，2006.