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(1.北京三元食品股份有限公司，北京 100163；2.首都兒科研究所，北京 100020；3.北京市通州區(qū)婦幼保健院，北京 101100)

[專題研究]

分娩方式及性別對母乳喂養(yǎng)嬰兒腸道菌群的影響

李菊芳1，姜鐵民1，賈妮2，侯海鷗3，陳歷俊1，戴耀華2

(1.北京三元食品股份有限公司，北京100163；2.首都兒科研究所，北京100020；3.北京市通州區(qū)婦幼保健院，北京101100)

目的旨在通過高通量測序技術(Illumina)對母乳喂養(yǎng)嬰兒糞便樣本的16S rDNA基因進行測序分析，以探索分娩方式和嬰兒性別對健康足月嬰兒出生后1個月內(nèi)腸道菌群定植的影響。方法本研究于2015年3至6月在北京市通州區(qū)婦幼保健院產(chǎn)科招募剛出生的健康足月新生兒10人。采用Illumina高通量測序技術對純母乳喂養(yǎng)嬰兒的胎糞(1d)，15d和30d的糞便樣本中所有微生物的16S rRNA V3+V4進行測序檢測。結果胎糞的菌群多樣性最高，隨著喂養(yǎng)時間的延長，又呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢；兩種分娩方式對腸道菌群定植的影響差異顯著：順產(chǎn)組的腸道菌群多樣性均高于剖宮產(chǎn)組；在科水平上擬桿菌科(Bacteroidaceae)在順產(chǎn)組嬰兒腸道菌群中長期存在，且相對豐度較高，而梭菌科(Clostridiaceae)在剖宮產(chǎn)組嬰兒腸道中穩(wěn)定存在；雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)于嬰兒出生后15d即開始產(chǎn)生，但順產(chǎn)組嬰兒腸道中此菌群相對豐度遠高于剖宮產(chǎn)組(15d和30d時該菌的相對豐度在順產(chǎn)組和剖宮產(chǎn)組的比例分別為4:1和10:1)；性別對嬰兒腸道菌群多樣性和豐度無顯著影響，但可造成菌群在科水平上菌群構成的差異：到出生后30d時男嬰組中丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)相對豐度較高(該菌科相對豐度占總菌科的20%)，女嬰組中毛螺菌科(Lachnospiraceae)相對豐度較高(該菌科相對豐度占總菌科的18%)，且這兩種菌科在對方組中均為檢測到。結論分娩方式對嬰兒出生后1月齡內(nèi)腸道菌群定植規(guī)律產(chǎn)生顯著影響，而嬰兒性別不是腸道菌群定植的關鍵因素，但在嬰兒生長發(fā)育過程中會對腸道菌群構成產(chǎn)生一定的影響。

嬰兒；分娩方式；性別；腸道菌群

人類體內(nèi)大約有1014個細菌，超過人類基因數(shù)的100倍。最大的微生物群落位于大腸中，它是宿主重要的組成部分，與宿主的健康緊密相連[1-2]。在過去的十幾年中，受益于分子生物學技術的發(fā)展，人體腸道菌群研究已經(jīng)取得了巨大的進步，特別是宏基因組理論的提出以及與之相結合的第二代測序技術的逐步普及，為腸道菌群的研究提供了一系列非依賴性培養(yǎng)的微生物研究技術，使得人們對腸道菌群發(fā)展變化規(guī)律及其影響因素逐步明晰[3-5]。有研究表明腸道菌群在人類的整個生命過程中發(fā)揮著重要的作用，例如屏障功能、新陳代謝反應、營養(yǎng)效應以及宿主先天性及適應性免疫反應的成熟[6]。嬰兒時期腸道菌群的定植是腸道菌群形成的關鍵時期，影響未來生長發(fā)育和健康狀況，與遠期肥胖、糖尿病、過敏性疾病等的發(fā)生密切相關[7]。

嬰兒腸道菌群的結構和組成受多種因素影響，包括來自母體和自身的因素。分娩方式(陰道分娩或剖宮產(chǎn))已經(jīng)被證明對早期腸道菌群定植，尤其是雙歧桿菌的數(shù)量具有非常重要的影響[8-9]。Dominguez-Bello等[10]利用焦磷酸測序的方法分析新生兒胎糞表明，首次腸道微生物菌群的建立與陰道分娩的母親陰道(乳桿菌，普氏菌或者纖毛菌)或者剖宮產(chǎn)母親的皮膚(葡萄球菌，棒狀桿菌以及丙酸桿菌)有非常強的相關性。同時利用時間溫度梯度凝膠電泳(TTGE)和變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析發(fā)現(xiàn)，剖宮產(chǎn)嬰兒和陰道分娩嬰兒出生后3d的糞便樣品菌群組成有差異。剖宮產(chǎn)嬰兒體內(nèi)的雙歧桿菌數(shù)目比陰道分娩嬰兒的少，且菌群多樣性程度也較低[11]。這些證據(jù)表明腸道環(huán)境受其首次遇到的皮膚或者陰道帶來的微生物菌群的影響。然而，利用免培養(yǎng)方法分析早產(chǎn)兒糞便樣品發(fā)現(xiàn)分娩方式與各種微生物(包括雙歧桿菌)定植水平無關[12]。前人已經(jīng)對分娩方式造成的嬰兒腸道定植差異進行了大量研究，但出生1月齡內(nèi)不同分娩方式的純母乳喂養(yǎng)嬰兒腸道菌群定植的動態(tài)變化情況還需進一步分析。

性別與地域、年齡、飲食結構和健康狀況等并列成為成人腸道菌群結構改變的重要影響因素。Bolnick等[13]通過對人類、魚類和小鼠進行針對性的研究分析，明確了宿主腸道內(nèi)微生物菌群的組成是取決于宿主的飲食結構與其性別共同作用的，并指出在使用飲食療法調節(jié)腸道微生物菌群失調時，需要根據(jù)性別差異來知道不同的治療方案。Mueller等[14]對來自歐洲4個國家的230個健康成人腸道菌群的多樣性分析發(fā)現(xiàn)，男性腸道內(nèi)Bacteroides-Prevotella group的數(shù)量顯著多于女性。Stanley等[15]的動物實驗結果表明不同性別的大鼠尿液代謝物組成有顯著差異，且這些差異物為腸道菌群代謝所產(chǎn)生。這說明性別對成人腸道菌群構成產(chǎn)生顯著差異，這可能與代謝性疾病的發(fā)生有關系。關于嬰兒腸道菌群定植時期由性別產(chǎn)生的差異至今鮮見報道。WHO兒童成長測評標準分別針對男童和女童繪制了不同的體重、身長/身高、頭圍的發(fā)育標準曲線(http://www.who.int/en/)，這說明不同性別嬰兒的機體代謝及生長發(fā)育過程存在差異，那么不同性別嬰兒腸道菌群的早期定植及代謝情況是否有差異還需進一步研究。

本研究的目的是采用Illumina高通量測序技術對嬰兒出生1個月內(nèi)腸道菌群的變化規(guī)律進行研究，重點考察了分娩方式和嬰兒性別對嬰兒腸道菌群早期定植的影響。本研究的順利開展將為今后嬰兒腸道微生態(tài)的研究提供更科學、更精確的數(shù)據(jù)支撐，也為開發(fā)調節(jié)腸道微生態(tài)平衡的嬰幼兒乳品提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1嬰兒糞便樣本的采集

1.1.1志愿者招募

本研究于2015年3至6月在北京市通州區(qū)婦幼保健院產(chǎn)科招募剛出生的健康足月新生兒10人(其中順產(chǎn)嬰兒5例；剖宮產(chǎn)嬰兒5例)，胎齡滿37周不滿42足周，出生體重為2 500～4 000g，Apgar評分>7分，早開奶，純母乳喂養(yǎng)；父母無嚴重的慢性疾病，且在調研期間不會搬遷出調研區(qū)。本研究經(jīng)過首都兒科研究所倫理委員會審批，監(jiān)護人自愿參加并簽署知情同意書。

1.1.2糞便樣本采集

采集時間點為：胎糞(1d)、15d和30d。準備取樣時給嬰兒清洗臀部及肛門，換干凈的紙尿褲。取樣時，請取樣者戴無菌手套，然后用取樣勺挖取約5g糞便后放入帶有保護液的PSP管中，采集時注意避免糞尿混合。采集好的樣品于-80℃冰箱保存。

1.1.3樣品編號

糞便樣品編號為4位編碼，依次表示出生方式、性別、嬰兒編號和出生時間，其中第一位字母N或C分別表示順產(chǎn)和剖宮產(chǎn)，第二位字母B或G分別表示男嬰或女嬰，第三位數(shù)字表示嬰兒編號，從0到9，第四位1、2、3分別表示樣品采集時間點，即出生1d、15d和30d。

1.2糞便樣本基因測序流程

1.2.1 DNA提取

采用糞便基因組提取試劑盒(DP328)(天根生化科技有限公司，中國)提取200mg糞便樣本中微生物的總DNA，具體步驟按說明書操作。所提取的DNA于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2文庫構建及測序

取用10ng的DNA模板，對16S rRNA-V3+V4區(qū)進行擴增，引物為314F-805R，同時加入特異index序列。文庫構建完成后，先使用Qubit 2.0進行定量，稀釋擴增產(chǎn)物至1ng/μL，隨后對文庫的insert size進行檢測，符合預期后進行實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)(QPCR)，對文庫的有效濃度進行準確定量，以保證文庫質量。由安諾優(yōu)達基因科技有限公司采用Miseq進行測序，測序策略為PE250。

1.2.3生物信息學分析

測序后得到的下機數(shù)據(jù)經(jīng)過去除低質量堿基、混淆堿基(Ns)、接頭污染序列等過程完成數(shù)據(jù)過濾，得到可信的目標序列(Clean Reads)，用于后續(xù)分析。然后將雙端測序相應的Read1與Read2利用序列拼接方法PEAR進行拼接[16]。拼接后的序列利用軟件QIME 1.8.0版本進行分析[17-19]，包括OTUs的提取、OTUs的交疊分析、聚類分析、Lefse分析、系統(tǒng)發(fā)生樹的構建、Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析等[20]。

Alpha多樣性分析表示樣品內(nèi)的菌群多樣性情況，包括菌種的類別豐富度以及菌種數(shù)目的均勻度，其描述方式有Chao1、Observed species、shannon和Simpson；Beta多樣性分析主要考察樣品間的菌群差異情況，其中主坐標分析(PCoA)依賴于Unweighted UniFrac 距離和Weighted UniFrac距離，通過對多維數(shù)據(jù)降維處理得出數(shù)據(jù)中最主要的影響因子或元素；聚類分析可用來分析物種結構相似性。

1.3統(tǒng)計學方法

菌群多樣性分析數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，采用IBM SPSS Statistics 22統(tǒng)計軟件進行單因素ANOVA分析，顯著水平α=0.05。

2結果

2.1分娩方式對母乳喂養(yǎng)嬰兒1月齡內(nèi)腸道菌定植的影響

2.1.1物種豐度及多樣性

分類操作單元(OUT)的數(shù)量可以代表樣品物種的豐度。本研究中將序列相似度大于97%的Tags歸為一類OTUs，認為它們具有相同的物種來源。不同分娩方式的純母乳喂養(yǎng)嬰兒在出生后的3個時期腸道微生物的OUT數(shù)量和Alpha多樣性分析結果見表1。無論何種分娩方式，胎糞中的OUT數(shù)量最高，其中順產(chǎn)組胎糞中OUT數(shù)量顯著大于其它兩個時間點(P<0.05)。隨著嬰兒的生長OUT數(shù)量又呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢；比較兩種分娩方式的結果發(fā)現(xiàn)順產(chǎn)組嬰兒在3個不同時間點下OUT數(shù)量均高于剖宮產(chǎn)組。

另外，本研究中采用四種不同的Alpha多樣性指數(shù)表征菌群的豐度和群落的穩(wěn)定性，結果見表1。Shannon Index是根據(jù)樣品中的物種種類以及每個物種的比例計算得到的多樣性指標，其值越大表示菌群分布越均勻。兩組在3個時間點下糞便菌群的分布均勻程度無顯著性差異，但順產(chǎn)組嬰兒在各時間點下菌種分布均勻程度均比剖宮產(chǎn)組高；Chao1是一個可以不基于進化樹來評價物種豐度的指數(shù)，其在低豐度樣品特別多的時候更能體現(xiàn)真實的多樣性情況，值越大表示樣品物種豐度越高，表1顯示的結果趨勢與OUT數(shù)量結果一致：順產(chǎn)組嬰兒糞便菌群豐度高于剖宮產(chǎn)組，胎糞中的菌群豐度最高(P<0.05)；Observed Species是一個對物種豐度進行檢測的指數(shù)，也即某次實驗中觀測到的種類數(shù)。從表1中可以看出在任意的一次實驗中均可得到順產(chǎn)組的菌群豐度高于剖宮產(chǎn)組，且胎糞的菌群豐度最高這一結果，這也說明本研究結果的可靠性；Simpson是測量一個種群集中程度或優(yōu)勢程度的指數(shù)，從表1中可以看出剖宮產(chǎn)組的菌群豐度低于順產(chǎn)組，但其胎糞菌群集中程度顯著高于順產(chǎn)組(P=0.049)，之后隨著年齡的增長，兩種分娩方式嬰兒糞便的菌群集中程度的差異逐漸減小，但均無顯著性差異(均P>0.05)。

表1 順產(chǎn)組和剖宮產(chǎn)組OUT數(shù)量及Alpha多樣性

(續(xù)表1-1)

時間(d) ObseveredSpecies 順產(chǎn)剖宮產(chǎn)FP Simpson 順產(chǎn)剖宮產(chǎn)FP169.92±55.6746.96±39.890.1440.7140.38±0.190.73±0.285.3810.0491522.85±7.3417.89±3.560.0260.8760.45±0.130.59±0.031.5230.2523025.90±8.2120.228±4.540.5880.4650.51±0.140.58±0.132.3070.167F0.9542.5100.1982.176P0.4120.1230.8230.156

2.1.2腸道菌群結構組成差異

圖1顯示在門水平上出生后不同時間嬰兒糞便樣品的菌群構成。結果表明胎糞檢測到9個主要菌門，但是所有樣品中99.13%以上的序列主要由4個菌門組成，分別是放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、后壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)，見圖1a；15d時嬰兒糞便中共檢測到4個菌門，分別是Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria，見圖1b；而出生30d時嬰兒糞便中共檢測到5個菌門，分別是Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria、軟壁菌門(Tenericutes)，見圖1c。通過豐度計算發(fā)現(xiàn)兩種分娩方式嬰兒在3個時間點下門水平上的優(yōu)勢菌群均為Proteobacteria和Firmicutes。這一結果說明不同分娩方式嬰兒在同一時期腸道菌群結構在門水平上差異不顯著，但隨著出生時間的變化，門水平上菌群構成豐度有一定的差異。

注：圖中橫坐標表示樣品名稱，縱坐標表示菌的相對豐度。

圖1門水平上不同分娩方式嬰兒在出生后不同時間腸道菌群的構成

Fig.1 Intestinal flora composition in infants delivered with different mode at different time after birth at phylum level

對所有樣品得到的OTU進行物種注釋后，結果顯示各樣品91%的Tag序列能夠注釋到“科”的水平，而能夠注釋到“屬”水平的tag僅為4.76%，因此選擇“科”作為各個樣品的最佳分類水平。圖2a表示不同分娩方式嬰兒胎糞中腸道菌群構成差異。順產(chǎn)組中占總菌群60%以上的菌群主要有：腸桿菌科(Enterobacteriaceae)為22.74%、擬桿菌科(Bacter￣oidaceae)為22.12%和葡萄球菌科(Staphylococcaceae)為16.47%；而在剖宮產(chǎn)組中Enterobacteriaceae為38.84%、梭菌科(Clostridiaceae)為28.89%、Staphylococcaceae為20.72%，三種菌科已占到組菌群含量的88%以上。這表明Enterobacteriaceae和Staphylococcaceae是兩種分娩方式嬰兒胎糞中的共有菌群，而Bacteroidaceae是順產(chǎn)組的特異優(yōu)勢菌，Clostridiaceae是剖宮產(chǎn)組的特異優(yōu)勢菌。同時對一些低豐度菌群進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，順產(chǎn)組中含量約為6.65%的瘤胃菌科(Ruminococcaceae)是剖宮產(chǎn)組中的40倍，而Bacteroi￣daceae和疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)在順產(chǎn)組和剖宮產(chǎn)組的比例分別為86:1和130:1。盡管這些低豐度菌群含量甚微，但可能其功能及與成年后某些疾病發(fā)生的相關性還需進一步研究。

圖2b顯示不同分娩方式的嬰兒在出生后15d嬰兒腸道菌群在科水平上的菌群結構。數(shù)據(jù)結果顯示，順產(chǎn)組在科分類水平上其多樣性要高于剖宮產(chǎn)組，其中順產(chǎn)組中Enterobacteriaceae為40.53%、丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)為18.81%、Bacteroidaceae為12.16%，三種菌科占到總菌群的70%以上；在剖宮產(chǎn)組中Enterobacteriaceae為46.61%、Clostridiaceae為37.44%、Erysipelotrichaceae為7.52%，三種菌科已占到總菌群含量的90%以上。從而可知兩種分娩方式嬰兒的優(yōu)勢菌群均為Enterobacteriaceae，但主要差異菌群為Clostridiaceae，它是剖宮產(chǎn)組的第二菌科，但在順產(chǎn)組中僅為3.97%，兩者相差將近10倍。另外，韋榮球菌科(Veillonellaceae)、鏈球菌科(Streptococcaceae)、雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)在順產(chǎn)組和剖宮產(chǎn)組的比例分別為1:4、7:1、4:1，Bacteroidaceae和毛螺菌科(Lachnospiraceae)在順產(chǎn)組中比例為12.16%和5.96%，在剖宮產(chǎn)組中幾乎不存在。

圖2c顯示不同分娩方式嬰兒在出生后30d時腸道菌群在科水平上的菌群構成。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)此時順產(chǎn)組可檢測到22個科，而剖宮產(chǎn)組檢測到19個科。在順產(chǎn)組中Enterobacteriaceae為34.05%、Erysipelotrichaceae為18.66%、Bacteroidaceae為12.26%，三種菌科占到總菌群的75%以上；在剖宮產(chǎn)組中Enterobacteriaceae為45.85%、Clostridiaceae為27.79%、Erysipelotrichaceae為11.82%，三種菌科已占到總菌群含量的85%以上。Bacteroidaceae在順產(chǎn)組為12.26%，而在剖宮產(chǎn)組中幾乎不存在，Streptococcaceae、紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)、孿生菌科(Gemellaceae)在兩組中的比例為1:3、100:1、10:1。乳桿菌科(Lactobacillaceae)在兩組中無差別，而Bifidobacteriaceae在順產(chǎn)組占有9.01%，是剖宮產(chǎn)組的10倍。

注：圖中橫坐標表示樣品名稱，縱坐標表示菌的相對豐度。

圖2科水平上不同分娩方式嬰兒在出生后不同時間腸道菌群的構成

Fig.2 Intestinal flora composition in infants delivered with different mode at different time after birth at family level

綜合上述結果對嬰兒腸道菌群構成變化進行縱向觀察發(fā)現(xiàn)，Bacteroidaceae在順產(chǎn)組嬰兒腸道菌群中長期存在，且相對豐度較高，而Clostridiaceae在剖宮產(chǎn)組嬰兒腸道中穩(wěn)定存在，這也是兩種生產(chǎn)方式嬰兒腸道菌群構成的主要差別，見表2。另外，由于順產(chǎn)嬰兒在出生過程中可以與產(chǎn)婦陰道微生物大量接觸，而剖宮產(chǎn)嬰兒出生時接觸到的是經(jīng)過消毒的母親皮膚，所以分娩后1d順產(chǎn)嬰兒腸道菌群多樣性大于剖宮產(chǎn)者，但這些特異的菌群隨著哺乳的開始逐漸消失或者產(chǎn)生新的更多的厭氧菌菌群。同時，本研究結果顯示順產(chǎn)組嬰兒腸道中Bifidobacteriaceae于嬰兒出生后15d即開始產(chǎn)生，而剖宮產(chǎn)組產(chǎn)生時間較晚，且順產(chǎn)組嬰兒腸道中此菌群相對豐度遠高于剖宮產(chǎn)組。

表2 不同分娩方式嬰兒腸道相對高豐度菌群比較

2.1.3分娩方式對嬰兒腸道菌群構成的聚類分析

為了進一步驗證分娩方式對嬰兒腸道菌群定植的影響，利用樣品間的Weighted UniFrac距離進行PCoA主坐標分析以考察樣品間的相似度。圖3顯示第一和第二主成分，其貢獻率分別為30%和13%，此時順產(chǎn)組分布較疏離，而剖宮產(chǎn)組分布較密集，這可能與順產(chǎn)組菌群多樣性相對較高有關系?？傮w看順產(chǎn)組和剖宮產(chǎn)組可以各自聚成一類，這也證明兩種分娩方式對腸道菌群構成影響差異性的存在。

圖3樣品Beta多樣性分析

Fig.3 Beta diversity analysis of samples

2.2性別對母乳喂養(yǎng)嬰兒1月齡內(nèi)腸道菌定植的影響

鑒于分娩方式對嬰兒腸道菌群的顯著影響，在考察性別這一因素時統(tǒng)一選擇分娩方式為剖宮產(chǎn)的嬰兒，盡量保證其他因素的一致性。

2.2.1物種豐度及多樣性

不同性別嬰兒糞便樣品中OUT數(shù)量及Alpha多樣性分析結果見表3。經(jīng)過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)男嬰胎糞中OUT數(shù)量略高于女嬰，但無顯著性差異(P>0.05)。隨著兩組嬰兒的生長，OUT數(shù)量均呈現(xiàn)先下降再升高的趨勢，但統(tǒng)計分析均無顯著性差異，且15d和30d時兩組OUT數(shù)量相近，這表明性別不會對嬰兒腸道菌群多樣性產(chǎn)生顯著差異。

表3同時展示了Alpha多樣性分析的4個指標值。Shannon Index在不同組間和組內(nèi)不同時間點下均無顯著性差異，這說明兩組嬰兒糞便樣本中微生物菌群分布都比較均勻；另外，除了女嬰隨時間變化Chao1有顯著差異(P<0.05)外，各時間點下性別之間表征菌群豐度的Chao1無顯著差異；而表征任意一次隨機檢測菌群豐度的Obsevered Species值在兩組之間及不同時間點下均無顯著性差異，這表明性別對嬰兒腸道菌群的豐度不產(chǎn)生影響；同時兩組嬰兒在3個時間點下Simpson值均無顯著性差異，表明性別對嬰兒腸道菌群集中程度無影響。

2.2.2嬰兒性別對腸道菌群構成的影響

性別對剖宮產(chǎn)嬰兒腸道菌群在科水平上的構成及相對豐度影響見圖4。從圖中可以看出男嬰胎糞中的優(yōu)勢菌群主要為Enterobacteriaceae、Clostridiaceae和Staphylococcaceae，而女嬰胎糞中的優(yōu)勢菌群主要為Enterobacteriaceae、Clostridiaceae、Staphylococcaceae和Streptococcaceae，且比較發(fā)現(xiàn)男嬰組中Enterobacteriaceae和Staphylococcaceae相對豐度高于女嬰組，而女嬰組中Clostridiaceae的相對豐度高于男嬰組。隨著嬰兒的成長，男嬰組中Erysipelotrichaceae的相對豐度顯著升高，到30d時約占總菌科的20%，而女嬰組中未檢測到此菌科。女嬰組在30d時Lachnospiraceae占總菌科的18%，而男嬰組中未檢測到此菌科。以上結果表明性別對嬰兒腸道菌群構成比例有一定的影響，這一早期定植的差異可能與成年后一些相關疾病在不同性別人群間發(fā)生的概率有關系。

表3 不同性別嬰兒OUT數(shù)量及Alpha多樣性

(續(xù)表3-1)

時間(d) ObseveredSpecies 男女FP Simpson 男女FP160.8±49.2426.20±1.410.8880.4510.39±0.280.36±0.390.0130.9181517.2±3.4216.80±5.520.0110.9240.60±0.040.59±0.030.0420.8513020.63±5.3520.00±4.950.0180.9030.59±0.180.56±0.100.0320.870F2.1462.4081.0550.578P0.1980.2380.4050.613

注：黑色1d；紅色15d；藍色30d。

圖4科水平上不同性別嬰兒糞便菌群構成比較

Fig.4 Comparison of intestinal flora composition in different gender infants at family level

3討論

嬰兒腸道菌群的定植受多種因素的影響，包括分娩方式、喂養(yǎng)方式、家庭環(huán)境等一系列因素。本研究重點考察分娩方式和嬰兒性別這兩個因素，因此為了排除喂養(yǎng)方式這一重要因素的影響，本研究中選擇純母乳喂養(yǎng)嬰兒進行跟蹤調查。

3.1不同分娩方式對嬰兒腸道菌群的影響

近年來剖宮產(chǎn)比例逐年升高，并高于世界衛(wèi)生組織規(guī)定值(不高于10%～15%)。關于剖宮產(chǎn)的潛在危害多項研究表明它直接導致腸道菌群構成的改變，引起腸道菌失衡，進而導致免疫功能障礙以及增加免疫調節(jié)疾病的發(fā)生，例如過敏和自身免疫等[21]。眾多研究分析了剖宮產(chǎn)嬰兒腸道菌群的早期定植情況，以增加更多的證據(jù)表明剖宮產(chǎn)對嬰兒遠期發(fā)育的潛在危害。Azad等[22]研究了分娩方式和嬰兒飲食對加拿大健康嬰兒腸道菌群的影響，結果表明選擇剖宮產(chǎn)的嬰兒腸道菌群豐度和多樣性極低。本研究中alpha多樣性分析發(fā)現(xiàn)直接表征菌群豐度的Chao1值在順產(chǎn)組嬰兒糞便菌群中高于剖宮產(chǎn)組，同樣證實了剖宮產(chǎn)嬰兒腸道菌群豐度較低的結論。Dominguez-Bello等[10]的研究發(fā)現(xiàn)剛出生時陰道分娩嬰兒從母親的陰道獲得更多細菌，以Lactobacillus，Prevotella和Sneathia spp為主，而剖宮產(chǎn)嬰兒腸道菌群類似于目前皮膚表面的細菌，以Staphylococcus，Corynbacterium和Propionibac￣terium spp為主。本研究考察了純母乳喂養(yǎng)嬰兒從出生到1月齡時腸道菌群的動態(tài)變化過程，結果表明在門水平上不同分娩方式嬰兒在同一時期腸道菌群結構差異不顯著，均以Firmicutes和Proteobacteria為主。但隨著出生時間的變化，科水平上菌群構成豐度差異顯著：嬰兒出生后1月齡內(nèi)順產(chǎn)組嬰兒腸道菌群構成多樣性高于剖宮產(chǎn)組；Bacteroidaceae在順產(chǎn)組嬰兒腸道菌群中長期存在，且相對豐度較高，而Clostridiaceae在剖宮產(chǎn)組嬰兒腸道中穩(wěn)定存在；Bifidobacteriaceae在順產(chǎn)組嬰兒腸道內(nèi)出現(xiàn)時間較早(出生后15d)，且順產(chǎn)組嬰兒腸道中此菌相對豐度遠高于剖宮產(chǎn)組。Rutayisire等[23]認為出生后3個月內(nèi)的腸道菌群多樣性和定植情況與分娩方式緊密相關，出生6個月后這種顯著相關性消失。本研究的局限性在于只分析了分娩方式對出生到1月齡時腸道菌群定植的影響。健康腸道菌群的定植可以促進嬰兒免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育，因此進一步的研究不光需要延長隊列跟蹤調查時間，還需要結合嬰兒的身體發(fā)育情況進行綜合評價，明確分娩方式對嬰兒遠期健康的影響。

3.2嬰兒性別對腸道菌群的影響

目前關于性別對腸道菌群影響的研究較少，Rutayisire等[23]研究了性別對成年人腸道菌群的影響，結果發(fā)現(xiàn)男性與女性腸道菌群的差異受體質指數(shù)的影響，且這種差異將會對代謝性疾病和腸道炎癥疾病等產(chǎn)生重要影響[24]。因此，性別這一看似并不重要的因素在嬰兒期腸道菌群定植時也需重點考慮。本研究發(fā)現(xiàn)性別對嬰兒腸道菌群多樣性和豐度無顯著影響，但可造成菌群在科水平上菌群構成的差異：結果表明到出生后1月齡時男嬰組中Erysipelotrichaceae相對豐度較高，女嬰組中Lachnospiraceae相對豐度較高，且在本研究中這兩種菌科在對方組中均未檢測到。本研究只是針對性別導致的差異菌進行了分析，后期更多地研究需要進一步研究這種差異菌群的產(chǎn)生對嬰兒近期及遠期健康的影響，為成年后代謝性等相關疾病的預防或治療提供數(shù)據(jù)支撐。

嬰兒時期是腸道菌群建立的關鍵時期，腸道菌群早期定植模式可影響腸道生理發(fā)育和免疫系統(tǒng)成熟，進而影響嬰兒遠期健康。本研究的順利開展為深入了解嬰兒腸道菌群的早期定植奠定了基礎，同時為嬰幼兒配方奶粉的開發(fā)提供了新的著眼點，從微觀角度建立一種更科學、更精準的評價體系，從而改變單純宏觀營養(yǎng)組分調配的模擬現(xiàn)狀，為新配方的開發(fā)提供更合理的數(shù)據(jù)支撐。

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[專業(yè)責任編輯：史曉薇]

Effect of delivery mode and infant gender on intestinal microflora in breast feeding infants

LI Ju-fang1, JIANG Tie-min1, JIA Ni2, HOU Hai-ou3, CHEN Li-jun1, DAI Yao-hua2

(1.BeijingSanyuanFoodsCo.,Ltd,Beijing100163,China; 2.CapitalInstituteofPediatrics,Beijing100020,China;3.TongzhouDistrictMaternalandChildHealthCareHospitalofBeijing,Beijing101100,China)

ObjectiveTo explore the effect of delivery mode and infant gender on intestinal flora colonization in healthy full-term infants within 1 month after birth through gene sequence analysis on 16S rDNA in fecal sample from breast feeding infants by high throughput sequencing technology (Illumina).MethodsTen healthy full-term newborns delivered in obstetrics department of Tongzhou District Maternal and Child Health Care Hospital of Beijing from March to June in 2015 were recruited in this study. The 16SrRNA V3+V4 in fecal samples from exclusively breast feeding infants at 1d, 15d and 30d of age was sequenced by Illimina high throughput sequencing technology.ResultsThe highest flora diversity was found in meconium samples. With extension of feeding time the flora diversity deceased firstly and increased subsequently. Difference in influence on intestinal flora colonization of two delivery modes was significant. Flora diversity in vaginal delivery group was higher than that in cesarean delivery group. In family level Bacteroidaceae in vaginal delivery group could exist for a long time and its relative abundance was higher than that in cesarean delivery group. While Clostridiaceae could survive long and stably in cesarean delivery group. Bifidobacteriaceae had been colonizing since 15 days after birth, but its abundance in vaginal delivery group was far higher than that in cesarean delivery group (the ratio of relative abundance between vaginal and cesarean delivery groups at 15d and 30d was 4:1 and 10:1, respectively). Infant gender had no significant influence on infant intestinal microflora diversity and abundance, but could cause difference in flora composition at family level. Relative abundance of Erysipelotrichaceae was higher in male infants at 30d after birth (its relative abundance accounting for 20% of total bacteria family), and relative abundance of Lachnospiraceae in female infants was higher (its relative abundance accounting for 18% of total bacteria family). And these two bacteria were not detected in the other gender group in this study.ConclusionDelivery mode has distinct influence on intestinal flora colonization rule in infants from birth to 1 month old. Infant gender is not a critical factor of intestinal flora colonization, but it influences intestinal flora composition at some degree during growth and development of infant.

infant; delivery mode; gender; intestinal flora

2016-11-08

北京市科技計劃資助項目(D141100004814002)；北京市自然基金資助項目(z140001)；奶牛產(chǎn)業(yè)技術體系北京市創(chuàng)新團隊資助項目。

李菊芳(1983—)，女，博士，高級工程師，主要從事乳制品開發(fā)與臨床功效循證研究工作。

戴耀華，研究員。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.09.001

R151.4

A

1673-5293(2017)09-1035-06