葉文蘭，駱禮華，嚴(yán) 璐，姚劉斌，江 龍

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

金佛山方竹根際土壤中優(yōu)勢(shì)AM真菌的鑒定

葉文蘭，駱禮華，嚴(yán) 璐，姚劉斌，江 龍

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

從貴州省正安縣、桐梓縣和重慶市南川區(qū)的金佛山方竹林地采集方竹根系和根際土壤，采用堿解離-酸性品紅染色法對(duì)根樣進(jìn)行染色，研究根系叢枝菌根侵染情況，利用濕篩傾注-蔗糖離心法從土樣中分離AM真菌孢子，結(jié)合形態(tài)特征和18S rDNA AML1-AML2區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)AM真菌進(jìn)行種屬鑒定。結(jié)果顯示：AM真菌能夠侵染金佛山方竹根系，侵染率為25.27%；從土壤中分離得到6種優(yōu)勢(shì)AM真菌，其中4種通過形態(tài)特征和18S rDNA AML1-AML2區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，均能鑒定到種水平，分別為蜜色無梗囊霉Acaulosporamellea、珠狀巨孢囊霉Gigasporamargarita、美麗盾巨孢囊霉Scutellosporacalospora和孢璧兩性球囊霉Ambisporaleptotich，其余2種通過18S rDNA AML1-AML2區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定為無梗囊霉屬Acaulospora，結(jié)合形態(tài)特征鑒定為大型無梗囊霉Acaulosporacolossica和疣狀無梗囊霉Acaulosporatuberculata。

金佛山方竹；AM真菌鑒定；優(yōu)勢(shì)菌種；發(fā)育分析

金佛山方竹(Chimonobambusautilis(Keng) Keng f.)屬于禾本科竹亞科寒竹屬植物，是我國特有種之一，僅分布于貴州大婁山系海拔1 300 m以上雨霧多、濕度大、氣候寒冷的高寒地區(qū)，金佛山方竹可筍材兩用，竹筍營養(yǎng)豐富、味美鮮嫩，竹材是造紙、竹器編制的好原料，具有“竹類之冠”的美譽(yù)[1-2]，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值在市場上具有巨大的潛力。前期我們?cè)诮鸱鹕椒街窳值氐恼{(diào)查工作中發(fā)現(xiàn)，金佛山方竹根系有叢枝菌根(Arbuscular Mycorrhiza，AM)，叢枝菌根是由AM真菌與植物形成的互惠共生體，通過共生體AM真菌能夠促進(jìn)植物對(duì)礦質(zhì)元素(N、P、K)和水分的吸收，從而能夠促進(jìn)植物生長，提高植物的產(chǎn)量和品質(zhì)，增強(qiáng)植物抗逆和抗病性[3-4]。

由于金佛山方竹林的立竹密度、繁殖和豐產(chǎn)栽培等技術(shù)還不完善，導(dǎo)致竹筍資源滿足不了市場需求[5-6]，獲得高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的金佛山方竹筍是解決市場供需矛盾的關(guān)鍵。本研究以金佛山方竹主要分布區(qū)貴州省正安縣、桐梓縣和重慶市南川區(qū)為采樣地，采集根系和根際土壤，研究金佛山方竹菌根侵染狀況，從根際土壤中分離AM真菌孢子，通過形態(tài)特征和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法，對(duì)金佛山方竹根際優(yōu)勢(shì)AM真菌進(jìn)行種屬鑒定，以期為進(jìn)一步研究接種AM真菌對(duì)金佛山方竹產(chǎn)量、品質(zhì)、繁殖率、移栽苗成活率等的影響提供菌種資料和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 根系和土壤樣品的采集

2015年10月、2016年7月從金佛山方竹主要分布地(貴州省正安縣新州鎮(zhèn)、桐梓縣獅溪鎮(zhèn)和重慶市南川區(qū)金山鎮(zhèn))共采集18份金佛山方竹根系和根際土壤。采樣地分布在海拔1 500～1 800 m，每隔約50 m海拔高差，選取長勢(shì)良好的金佛山方竹進(jìn)行采樣，采樣時(shí)除去雜草和表面2 cm厚土壤和雜質(zhì)，從東南西北4個(gè)方向采集距地表5～20 cm土層中金佛山方竹根系(粗度小于20 mm的須根)和根際土壤，3株重復(fù)，混合后約1 kg為1個(gè)樣。在采集袋上標(biāo)記樣地編號(hào)、海拔和經(jīng)緯度。樣品根系及時(shí)用清水洗凈后，放進(jìn)廣口瓶中用固定液(FAA)固定，根際土壤于通風(fēng)處自然風(fēng)干后，與根系一同保存于4 ℃冰箱。

1.2 根系菌根侵染狀況觀察和侵染率測(cè)定

實(shí)驗(yàn)采用堿解離-酸性品紅染色法[7]。從FAA固定液中取出根系，用清水沖洗2-3次，將根系剪成1 cm，加入10% NaOH在90 ℃水浴鍋中解離1 min，水洗3-5次。加入30%過氧化氧在90 ℃水浴鍋中酸化30 s～1 min，水洗3-5次。0.01%的酸性品紅乳酸甘油染色2 d，染色根段置于OlympusBX53光學(xué)顯微鏡鏡檢，觀察記錄各種菌根結(jié)構(gòu)(菌絲、叢枝和泡囊等結(jié)構(gòu))，凡是有上述結(jié)構(gòu)之一的的根樣，均視為有AM真菌侵染。

每個(gè)樣品處理50條根段，按根段頻率標(biāo)準(zhǔn)法[8]測(cè)定菌根侵染率，即沒有菌根結(jié)構(gòu)的根段其侵染率為0%，整條根段全被侵染的為100%，只有一半長度的根段被侵染的為50%，以此類推，并記錄各侵染率下的根段條數(shù)。侵染率計(jì)算公式如下:

侵染率=∑(0%×根段數(shù)+10%×根段數(shù)+20%×根段數(shù)+…+100%根段數(shù))/觀察的總根段數(shù)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用 Excel 2003、SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件。

1.3 AM真菌的形態(tài)鑒定

金佛山方竹土壤中AM真菌孢子的分離采用濕篩傾注-蔗糖離心法[9]，將分離的孢子收集于培養(yǎng)皿中，置于體視顯微鏡下，根據(jù)孢子的形狀、大小、顏色及連孢菌絲的形狀、大小進(jìn)行初步分類，選取分離頻度﹥50%的AM真菌孢子，用無菌槍頭吸取單個(gè)孢子于載玻片上，加入載浮劑PVLG置于光學(xué)顯微鏡下記錄孢子的形狀、大小、顏色，孢壁的構(gòu)造、層次、顏色、厚度，孢子表面紋飾、連孢菌絲以及壓破孢子后與Melzer′s試劑染色反應(yīng)等特征，依據(jù)《VA菌根真菌鑒定手冊(cè)》[10]和NVAM(http://invam.wvu.edu/)網(wǎng)站提供的圖片及菌種的描述，根據(jù)分類系統(tǒng) Phylogeny and taxonomy of glomeromycota(http://www.amf-phylogeny.com/)進(jìn)行種屬鑒定。

分離頻度(frequency，F(xiàn))=(AM真菌某屬或種的出現(xiàn)土樣數(shù)/總土樣數(shù))×100%；

優(yōu)勢(shì)度按分離頻度來劃分，分離頻度﹥50%為優(yōu)勢(shì)屬(種)[11]。

1.4 AM真菌18s rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

參考董秀麗和趙斌[12]描述的方法，分別提取優(yōu)勢(shì)AM真菌單個(gè)孢子的DNA進(jìn)行巣式PCR擴(kuò)增。

第一次PCR擴(kuò)增：采用真菌18S rDNA通用引物對(duì)GeoA2-Geo11[13](表1)。反應(yīng)體系(20 μL)：10×PCR緩沖液(mg2+plus)2.0 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)1.6 μL，DNA模板2 μL，引物 GeoA2(10 mmol·L-1)和引物Geo11(10 mmol·L-1)均為0.5 μL，TaKaRaTaq(5×16.67 mkat·L-1)0.1 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸100 s，循環(huán)30次，最后72 ℃延伸10 min。

第二次PCR擴(kuò)增：采用AM真菌特異性通用引物對(duì)AML1-AML2[14](表1)，模板以第一次PCR產(chǎn)物稀釋10倍，取2 μL，反應(yīng)體系與第一次PCR相同，反應(yīng)程序退火溫度改為50 ℃，延長時(shí)間為50 s，其余反應(yīng)成程序與第一次相同。取擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL，用1.0%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)。

PCR產(chǎn)物寄到華大基因公司測(cè)序。測(cè)序得到的序列用Bioedit軟件人工校對(duì)后分別提交GenBank，獲取登錄號(hào)，經(jīng)BLAST比對(duì)后下載相似性達(dá)97%的序列，以Vanrijapesudolonga(AB051047.1)作為外群，用生物學(xué)軟件MAGA 5.2通過鄰位加入法(N-J)，運(yùn)行1 000次bootstrap驗(yàn)證，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 Nested PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 金佛山方竹根系A(chǔ)M真菌的侵染狀況

通過根系染色，3個(gè)地區(qū)所采根系樣品均觀察到各種菌根結(jié)構(gòu)(表2和圖1)，菌根侵染率：正安縣為25.33%，桐梓縣為23.83%，南川區(qū)為26.67%，3個(gè)地區(qū)的侵染率都比較接近，在20%～30%之間，無顯著差異，3個(gè)地區(qū)的平均侵染率為25.27%。

表2 不同采集地的根系侵染狀況

注：同一列中，小寫字母“a”表示差異沒達(dá)到5%顯著水平，“+”表示觀察到此結(jié)構(gòu)。

Note：in the same column,lowercase letters “a” indicated the difference did not reach significant level 5%, "+" indicates that the structure is observed

2.2 金佛山方竹優(yōu)勢(shì)AM真菌的形態(tài)特征

從金佛山方竹根際土壤中分離得到編號(hào)為JFAM-1～FAM-6的6種分離頻度﹥50%的AM真菌孢子，JFAM-1的分離頻度為72.22%，JFAM-2為83.33%，JFAM-3為55.56%，JFAM-4為61.33%，JFAM-5為83.33%，JFAM-6為66.67%，根據(jù)分離頻度，它們?yōu)榻鸱鹕椒街駜?yōu)勢(shì)菌種，經(jīng)形態(tài)鑒定為以下6種AM真菌(表3和圖2)。

圖1 金佛山方竹根系叢枝菌根結(jié)構(gòu)Fig.1 Arbuscular mycorrhizae structures in the roots of Chimonobambusa utilis1.根外孢子 ；2.叢枝和入侵點(diǎn)；3.根外菌絲；4. 根內(nèi)菌絲及孢子；5、6.囊泡1.Extraradical spores; 2.Arbuscular structures and intrusion point; 3.Extraradical hyphae; 4.Intraradical hyphae and spore; 5，6.vesieular

圖2 金佛山方竹優(yōu)勢(shì)AM真菌孢子的形態(tài)Fig.2 Morphology of the dominant arbuscular mycorrhizal fungi spores in the rhizosheric soil of Chimonobambusa utilis1-2：JFAM-1(大型無梗囊霉)；3-5：JFAM-2(蜜色無梗囊霉)；6-8：JFAM-3(疣狀無梗囊霉)；9-11：JFAM-5(珠狀巨孢囊s霉)；12-14：JFAM-5(美麗盾巨孢囊霉)；15-16：JFAM-6(孢璧兩性球囊霉)1-2:JFAM-1 (Acaulospora colossica); 3-5：JFAM-2 (Acaulospora mellea); 6-8：JFAM-3 (Acaulospora tuberculata) 9-11:JFAM-4 (Gigaspora margarita); 12-14：JFAM-5 (Scutellospora calospora); 15-16:JFAM-6 (Ambispora leptoticha)

表3 優(yōu)勢(shì)AM真菌的主要特征

2.4 金佛山方竹優(yōu)勢(shì)AM真菌的18S rDNA AML1-AML2區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

以6種優(yōu)勢(shì)AM真菌的單個(gè)孢子DNA為模板，以引物GeoA2-Geo11進(jìn)行第1次PCR擴(kuò)增，由于AM真菌DNA拷貝數(shù)低，在瓊脂糖凝膠中未觀察到相應(yīng)的AM真菌的DNA條帶，以AML1-AML2為巣式引物進(jìn)行第2次PCR擴(kuò)增，AM真菌相應(yīng)DNA序列被特異性地?cái)U(kuò)增出來，片段大小約為800 bp(圖3)。

圖3 18S rDNA AML2-AML2區(qū)域擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplication production of the AML1-AML2 region sequenceM:DL 2 000 bp maker; 1:JFAM-1; 2:JFAM-2; 3:JFAM-3; 4:JFAM-4; 5:FAM-5; 6:JFAM-6

所用序列明顯地分為4個(gè)聚類群(圖4)。JFAM-1、JFAM-2、JFAM-3同在分類群Acaulospora里，JFAM-4、JFAM-5、JFAM-6分別在分類群Gigaspora、Scutellospora、Ambispora里。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，JFAM-1～JFAM-6的鑒定結(jié)果如表3，JFAM-2、JFAM-4、JFAM-5、JFAM-6的分子鑒定結(jié)果與形態(tài)鑒定一致，分別為蜜色無梗囊霉Acaulosporamellea、J珠狀巨孢囊霉Gigasporamargarita、美麗盾巨孢囊霉Scutellosporacalospora、孢璧兩性球囊霉Ambisporaleptoticha，JFAM-1和JFAM-3在分子上鑒定為無梗囊霉Acaulospora和Acaulosporasp，與形態(tài)鑒定不一致，JFAM-1和JFAM-3在形態(tài)上分別鑒定為大型無梗囊霉Acaulosporacolossica和疣狀無梗囊霉Acaulosporatuberculata，由于兩者的18S rDNA序列信息在Genbank中未搜到，據(jù)現(xiàn)有序列信息分析，JFAM-1和JJFAM-3通過18S rDNA AML1-AML2區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育分析只能鑒定為無梗囊霉屬Acaulospora。

圖4 基于18S rDNA AML1-AML2區(qū)序列的金佛山方竹根際土壤優(yōu)勢(shì)AM真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(N-J)金佛山方竹根際土壤優(yōu)勢(shì)AM真菌DNA序列Fig.4 Neighbor-joining consensus phylogram for AML1-AML2 region of 18S rDNA sequence of of the dominant arbuscular mycorrhizal fungi in the rhizosheric soil of Chimonobambusa utilis sequences of of the dominant arbuscular mycorrhizal fungi in the rhizosheric soil of Chimonobambusa utilis

表4 金佛山方竹根際土壤優(yōu)勢(shì)AM真菌分子鑒定與形態(tài)鑒定

4 討論

本研究通過對(duì)金佛山方竹根系進(jìn)行染色觀察發(fā)現(xiàn)，在各采樣地樣品中均能觀察到各種菌根結(jié)構(gòu)，如孢子、菌絲、叢枝和泡囊等結(jié)構(gòu)，AM真菌能夠侵染金佛山方竹根系。3個(gè)采樣地的侵染率無顯著差異，都在20%～30%，3個(gè)采樣地的平均侵染率為25.27%，與生長在干旱地區(qū)的植物如櫨橘[15]、沙蒿[16]、胡楊和駱駝刺[17]相比，金佛山方竹菌根侵染率不高。不同植物之間菌根侵染率的差異除了與植物和AM真菌的親和程度有關(guān)，還與其生長的各種環(huán)境因子相關(guān)[18-19]。金佛山方竹侵染率不高的主要原因可能是金佛山方竹生長在濕度較大的環(huán)境中，研究表明，土壤濕度對(duì)AM真菌侵染影響很大，在含水量過高的土壤中，其侵染率明顯減少[20]。雖然在自然條件下金佛山方竹菌根侵染率不高，但它仍屬于菌根型植物，通過人為接種與之相匹配的AM菌種，其侵染率會(huì)有所提高。因此通過接種AM真菌在提高金佛山方竹產(chǎn)量、品質(zhì)、繁殖率，移栽苗成活率等應(yīng)用上仍具有廣闊的前景。

AM真菌分類鑒定有助于菌種保存，菌種多樣性研究，對(duì)于AM真菌資源在農(nóng)業(yè)、造林、園藝等方面的運(yùn)用具有重要的意義。AM真菌種類的鑒定常用的方法是形態(tài)鑒定法。但形態(tài)鑒定法存在一定的局限，即同一種AM真菌的形態(tài)特征會(huì)因生活史、宿主植物、地理環(huán)境的不同而出現(xiàn)形態(tài)差異，常常誤判，造成不同研究者的鑒定結(jié)果差異很大[21]。近年來，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，核酸生物信息已運(yùn)用到AM真菌的分類鑒定中，使菌種鑒定更加精準(zhǔn)，在一定程度上改變了形態(tài)鑒定的局限性[22]。

關(guān)于AM真菌的分子鑒定，國外已有報(bào)道，國內(nèi)則研究得少[23]，本研究是國內(nèi)首次結(jié)合傳統(tǒng)孢子形態(tài)鑒定方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)金佛山方竹AM真菌進(jìn)行雙重鑒定，克服了孢子形態(tài)鑒定的片面性，提高了試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性。編號(hào)為JFAM-2、JFAM-4、JFAM-4、JFAM-5、JFAM-6的4種AM真菌孢子，利用AML1-AML2區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定為蜜色無梗囊霉Acaulosporamellea、珠狀巨孢囊霉Gigasporamargarita、美麗盾巨孢囊霉Scutellosporacalospora、孢璧兩性球囊霉Ambisporaleptoticha，與基于孢子形態(tài)特征的鑒定結(jié)論一致。FAM-1和JFAM-3通過形態(tài)特征，分別鑒定為大型無梗囊霉Acaulosporacolossica和疣狀無梗囊霉Acaulosporatuberculata，通過AML1-AML2區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育分析，兩者均為無梗囊霉屬Acaulospora，但未確定種名，這是因?yàn)樵贕enBank中沒有大型無梗囊霉Acaulosporacolossica和疣狀無梗囊霉Acaulosporatuberculata的基因信息，而我們?cè)囼?yàn)中得到的基因信息將有望成為以上2種AM真菌在GenBank的標(biāo)準(zhǔn)信息。研究結(jié)果也證實(shí)：以AML1-AML2為巢式引物對(duì)AM真菌DNA進(jìn)行巣式PCR擴(kuò)增的技術(shù)，具有很好的靈敏性，簡單破碎孢子或根段的粗提DNA樣品就可以直接用于PCR反應(yīng)，有效的擴(kuò)增出目標(biāo)片段，實(shí)現(xiàn)了AM真菌在根內(nèi)和土壤中的特異性檢測(cè)?？梢灶A(yù)見隨著AM真菌基因信息數(shù)據(jù)庫的充實(shí)，在AM真菌的種屬鑒定中，此方法將會(huì)越來越具有優(yōu)越性。

AM真菌在一定的生境下長期生長發(fā)育，適應(yīng)生境的菌種可大量繁殖形成優(yōu)勢(shì)菌種，反之則逐漸被淘汰[24]。大型無梗囊霉Acaulosporacolossica、蜜色無梗囊霉Acaulosporamellea、疣狀無梗囊霉Acaulosporatuberculata、珠狀巨孢囊霉Gigasporamargarita、美麗盾巨孢囊霉Scutellosporacalospora和孢璧兩性球囊霉Ambisporaleptoticha可能適應(yīng)這種雨霧多、濕度大、氣候寒冷的高寒地區(qū)，而成為金佛山方竹根際優(yōu)勢(shì)菌種，這與它們自身的生物學(xué)特性有關(guān)，相關(guān)生理學(xué)和分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究報(bào)道的金佛山方竹根際優(yōu)勢(shì)AM真菌，可為下一步發(fā)展金佛山方竹栽培技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

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Identification of the Dominant Arbuscular Mycorrhizal Fungi in the Rhizosphere Soil ofChimonobambusautilis

YE Wen-lan,LUO Li-hua,YAN Lu,YAO Liu-bin,JIANG Long

(College of Life Sciences,Guizhou University,Guiyang 550025,Guizhou,China)

The root samples and rhizosphere soil ofChimonobambusautiliswere collected fromChimonobambusautilisforest of Zhengan county and Tongzi county of Guizhou,and Wansheng District of Chongqing City. The infection situation of Arbuscular mycorrhizal fungi(AMF) was studied by alkaline lysis and acid fuchsin stain,and the spores of AMF were isolated by wet-sieving and sucrose density gradient centrifugation methods and the species were identified based on morphological characters and phylogenetic analysis of AML1-AML2 region of 18S rDNA sequence. The results indicated that AMF can infect the roots ofChimonobambusautilis,and the infection-rate was higher than 20%. The six dominant AMF species were isolated from the soil sample,of these,four species were identified by using both morphological characters and phylogenetic analysis of AML1-AML2 region of 18S rDNA sequence,includingAcaulosporamellea、Gigasporamargarita、ScutellosporacalosporaandAmbisporaleptotich. Another 2 were identified asAcaulosporacolossicaandAcaulosporetuberculatabased on morphological characters，and were belong to the genusAcaulosporaby phylogenetic analysis AML1-AML2 region of 18S rDNA sequence.

Chimonobambusautilis; Identification ofarbusularmycorrhizalfungi; The dominant species; Phylogenetic analysis

2016-10-18

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BAD04B0204)，貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(黔科合J字〔2009〕2282號(hào))

葉文蘭，碩士研究生，從事植物學(xué)生理學(xué)等研究。通信作者：江龍，博士，教授，從事植物生理學(xué)、菌根生物學(xué)等研究。E-mail：jianglonggy@sina.com