王禎 于亮 史霄雨

北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院（北京 100084）

4周間歇性禁食對(duì)大鼠骨骼肌質(zhì)量及自噬的影響

王禎 于亮 史霄雨

北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院（北京 100084）

目的：探討4周間歇性禁食后大鼠體重、體脂及骨骼肌質(zhì)量的變化與大鼠骨骼肌自噬的關(guān)系，為間歇性禁食提供理論依據(jù)。方法：20只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（Con組）和間歇性禁食組（IF組），每組各10只。采取每周三、周五間歇性禁食方案，每周按時(shí)記錄大鼠體重，4周干預(yù)后雙能X線吸收測(cè)量法（DEXA）分析體脂含量，之后分離雙側(cè)比目魚(yú)肌稱(chēng)量濕重，免疫熒光法檢測(cè)比目魚(yú)肌laminin蛋白體現(xiàn)肌肉橫截面積，透射電鏡觀察比目魚(yú)肌自噬泡形態(tài)，Western Blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、p62及調(diào)控蛋白AMPKα、p-AMPKα、ULK1的表達(dá)情況。結(jié)果：4周間歇性禁食后，間歇性禁食組大鼠體重與體脂含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），但各組比目魚(yú)肌濕重及肌纖維橫截面積并無(wú)明顯差異（P＞0.05）。間歇性禁食組比目魚(yú)肌AMPKα、p-AMPKα、ULK1蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），間歇性禁食組比目魚(yú)肌內(nèi)自噬標(biāo)記LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平明顯高于對(duì)照組，p62表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，均具有非常顯著性差異（P＜0.01）。結(jié)論：4周間歇性禁食明顯降低體脂水平，具有控制體重的作用，可激活A(yù)MPK-ULK1通路適度促進(jìn)骨骼肌自噬，以維持骨骼肌質(zhì)量，可作為一種潛在的“減肥”方法進(jìn)行深入研究。

間歇性禁食；骨骼肌質(zhì)量；自噬；AMPK；LC3

間歇性禁食（intermittent fasting，IF）是指機(jī)體周期性的保持禁食與攝食交替進(jìn)行，其中禁食日攝入熱量極低或?yàn)榱愕囊环N方法。有研究表明，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在禁食期間心血管系統(tǒng)疾病和糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)降低，體內(nèi)脂肪的供能比例增加，可在減脂的同時(shí)改善炎癥、神經(jīng)退行性疾病、代謝綜合征等多種疾病程度，具有抗衰老、改善健康的作用[1-3]。但間歇性禁食在控制能量攝入的同時(shí)，可能降低體內(nèi)糖和蛋白質(zhì)水平，進(jìn)而影響骨骼肌質(zhì)量[4，5]?，F(xiàn)已證實(shí)骨骼肌自噬是利用溶酶體清除受損蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)合成與降解的平衡，保持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的重要過(guò)程，自噬水平適度增加有助于維持骨骼肌質(zhì)量與功能[6]。本研究通過(guò)建立4周間歇性禁食模型，明確間歇性禁食對(duì)大鼠脂肪及骨骼肌質(zhì)量的影響，觀察骨骼肌自噬在間歇性禁食過(guò)程中對(duì)骨骼肌質(zhì)量的影響，為間歇性禁食的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

20只8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重300±20 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，于北京體育大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，相對(duì)濕度50%～70%，溫度20～24℃，晝夜明暗交替各12小時(shí)。所有動(dòng)物預(yù)適應(yīng)3天后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為2組對(duì)照組（Con組）和間歇性禁食組（IF組），每組10只。對(duì)照組大鼠體重296.1±14.33 g，間歇性禁食組體重293±17.63 g，兩組大鼠體重經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)期間每周六下午稱(chēng)量大鼠體重，記錄大鼠體重變化情況。

1.2 主要試劑及儀器

AMPKα抗體，ab80039，Abcam公司；p-AMPKα抗體，ab133448，Abcam公司；ULK1抗體，ab128859，Ab?cam公司；LC3抗體，ab128025，Abcam公司；p62抗體，ab56416，Abcam公司；laminin抗體，ab11575，Abcam公司；GAPDH抗體，TA-08，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；磷酸酶抑制劑，Roche公司；蛋白酶抑制劑，Roche公司。

Western Blotting電泳儀、電轉(zhuǎn)儀，Bio-Rad公司；xMark酶標(biāo)儀，Bio-Rad公司；防脫磨砂載玻片，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 間歇性禁食模型

研究過(guò)程中常使用的三種禁食方式為能量攝入限制、隔日禁食和飲食限制。在參照Vasconcelos等[7]設(shè)計(jì)的大鼠隔日禁食方案的基礎(chǔ)上，考慮“人性化”因素在研究過(guò)程中減少禁食時(shí)間，降低禁食“強(qiáng)度”，在Brown等[8]提出的間歇性禁食模型上進(jìn)行修改完成本研究間歇性禁食模型。具體干預(yù)方案為間歇性禁食組大鼠單籠飼養(yǎng)，預(yù)適應(yīng)期間每天稱(chēng)量投食量及次日食物剩余量，并計(jì)算該組大鼠正常進(jìn)食量，以周為單位，正式實(shí)驗(yàn)期間每周三、周五食物完全剝奪24 h，禁食期間飲水自由，每周四、周六根據(jù)計(jì)算給予大鼠正常進(jìn)食量，總熱量與周一、周二、周日相同。達(dá)到周二至周六進(jìn)行禁食與否的交替操作，周一和周日正常飲食進(jìn)行調(diào)整的效果。實(shí)驗(yàn)周期為4周。以上禁食、稱(chēng)量均在每天同一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行。

圖1 本研究間歇性禁食模型示意圖

1.4 取材及檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 取材

4周實(shí)驗(yàn)后，各組處死前禁食12小時(shí)，采用10%水合氯醛麻醉大鼠，按3 mg/kg體重進(jìn)行腹腔注射，腹主動(dòng)脈取血致死。取雙側(cè)比目魚(yú)肌，放于錫紙上，分別稱(chēng)量左右腿濕重；分割米粒大小用OCT冰凍切片包埋劑包埋后放入－80℃冰箱，做冰凍切片使用；同樣分割米粒大小放入戊二醛中，做電鏡使用；剩余比目魚(yú)肌投入液氮，隨后轉(zhuǎn)移至－80℃超低溫冰箱冷凍保存用于檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)。除稱(chēng)重外，其余實(shí)驗(yàn)過(guò)程不區(qū)分左右腿。

1.4.2 雙能 XX線吸收測(cè)量法（DEXA）

取材前開(kāi)機(jī)校準(zhǔn)儀器，打開(kāi)NORLAND軟件，將麻醉的大鼠放于掃描床上，依次標(biāo)定開(kāi)始點(diǎn)、結(jié)束點(diǎn)、基點(diǎn)，開(kāi)始掃描，掃描結(jié)束后保存、分析數(shù)據(jù)，以記錄大鼠體脂含量，每組測(cè)量3只。

1.4.3 免疫熒光檢測(cè)laminin

細(xì)胞外層粘連蛋白laminin位于細(xì)胞外基質(zhì)，是基膜的特有成分和主要功能成分。通過(guò)檢測(cè)其定位，可以反映骨骼肌橫截面積。實(shí)驗(yàn)前提前開(kāi)啟冰凍切片機(jī)預(yù)冷，將溫度調(diào)至－20℃。將從－80℃取出的包埋塊放置在冰凍切片機(jī)中平衡溫度20分鐘。清理冰凍切片機(jī)內(nèi)部，用OCT冰凍切片包埋劑澆鑄固定組織的底座，固定玻璃蓋板及刀片，待OCT凝固后將上端削平，繼續(xù)在底座上滴加少許冰凍切片包埋劑，從包埋殼中取出組織，并垂直固定在底座上，凝固后修整，以便切橫截面。常溫放置防脫載玻片。先用50 μm 粗調(diào)，后用8 μm細(xì)調(diào)調(diào)整組織與刀片間距離。待距離合適后切下組織并固定在防脫載玻片上。顯微鏡下觀察肌細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)，－80℃保存。

選取在－80℃保存帶有樣本的防脫載玻片，PBS搖床洗3次，每次15分鐘，用含有0.3%Triton的PBS搖床破膜30分鐘，5% 羊血清室溫封閉30分鐘，一抗lam?inin濃度1：500，滴加后濕盒內(nèi)4℃ 過(guò)夜，次日加入熒光二抗（避光操作，濃度1:500），DAPI封片后，激光共聚焦顯微鏡100倍拍攝laminin儲(chǔ)存，每組選取3只，每只拍攝8張，使用Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計(jì)橫截面積大小。

1.4.4 透射電鏡檢測(cè)自噬體形態(tài)

將固定并置于戊二醛中于4℃保存的標(biāo)本按照以下步驟進(jìn)行操作：（1）0.1 M磷酸緩沖液浸洗30 min。（2）1%四氧化鋨固定液（固定液內(nèi)含有磷酸緩沖液）4℃固定2小時(shí)。（3）0.1 M磷酸緩沖液浸洗10 min。（4）乙醇梯度脫水：30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇各10 min。（5）70%乙醇醋酸雙氧鈾塊染2小時(shí)或過(guò)夜。（6）90%乙醇10 min×2；100%乙醇10 min×3。（7）環(huán)氧丙烷置換10 min。（8）環(huán)氧樹(shù)脂EMbed浸透、包埋、聚合。（9）作1～2 μm的半超薄切片，美蘭染色后光學(xué)顯微鏡下定位，超薄切片機(jī)制作60 μm的超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后，透射電鏡下觀察、拍照。每組2只，每只2個(gè)標(biāo)本，分別選取1000、3000、6000倍三個(gè)視野進(jìn)行拍攝。觀察比目魚(yú)肌自噬體形態(tài)變化。

1.4.5 Western Blot

選取在－80℃保存的比目魚(yú)肌100 mg于EP管中剪碎，加入1 ml含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RAPI裂解液，冰浴勻漿30秒。靜置30分鐘后，4℃、12000 rpm離心8分鐘，取上清。使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，之后加入相應(yīng)比例的裂解液和5×loading buffer，將濃度調(diào)為一致，100℃變性10分鐘，冷卻后－40℃冷凍備用。

Western Blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、p62及調(diào)控蛋白AMPKα、p-AMPKα、ULK1的表達(dá)。AMPKα、p-AMPKα、ULK1、p62采用10%分離膠濃度，LC3采用12%分離膠濃度，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，300 mA轉(zhuǎn)膜1.5小時(shí)，5%BSA對(duì)PVDF膜封閉2小時(shí)，使用5%BSA配制一抗AMPKα（濃度1∶500）、p-AMPKα（濃度1∶500）、ULK1（濃度1∶500）、LC3（濃度1∶500）、p62（濃度1∶500）、GAPDH（濃度1∶2000），4℃過(guò)夜。目的蛋白二抗?jié)舛?∶1000，內(nèi)參二抗?jié)舛?∶2000，室溫?fù)u床孵育1.5小時(shí)，洗膜后進(jìn)行曝光顯影，利用Image Lab5.1軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，使用Image J、spss19.0、GraphPad Prism等軟件進(jìn)行分析處理，組間分析采用單因素方差分析的LSD法，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 間歇性禁食后大鼠體重、體脂的變化

4周實(shí)驗(yàn)后，對(duì)照組與間歇性禁食組大鼠體重均明顯高于實(shí)驗(yàn)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。對(duì)照組體重每周增幅明顯，與實(shí)驗(yàn)前對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），間歇性禁食組從第二周開(kāi)始，每周體重同樣逐漸升高，與實(shí)驗(yàn)前對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；兩組相比，對(duì)照組大鼠體重增長(zhǎng)幅度更大，從第二周開(kāi)始，對(duì)照組體重明顯高于間歇性禁食組（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 大鼠體重增長(zhǎng)趨勢(shì)

在4周干預(yù)后對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，DEXA掃描測(cè)量其體脂含量（圖2），發(fā)現(xiàn)間歇性禁食組大鼠體脂含量（44.93 ± 3.59 g）明顯低于對(duì)照組（60 ± 1.67 g），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 DEXA檢測(cè)大鼠體脂含量

2.2 間歇性禁食對(duì)大鼠比目魚(yú)肌濕重及肌纖維橫截面積的影響

4周干預(yù)后，間歇性禁食組大鼠比目魚(yú)肌濕重與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。本研究對(duì)大鼠比目魚(yú)肌進(jìn)行冰凍切片，免疫熒光檢測(cè)laminin，發(fā)現(xiàn)4周間歇性禁食干預(yù)后，間歇性禁食組大鼠比目魚(yú)肌纖維橫截面積變化不大，與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖3。

表2 大鼠比目魚(yú)肌濕重

圖3 大鼠比目魚(yú)肌纖維橫截面積

2.3 間歇性禁食對(duì)大鼠比目魚(yú)肌自噬體形態(tài)的影響

本研究使用透射電鏡定性分析間歇性禁食后骨骼肌內(nèi)自噬體形態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，間歇性禁食組比目魚(yú)肌中雙層“脂質(zhì)體”膜結(jié)構(gòu)增加，胞漿中包括細(xì)胞器在內(nèi)的雙層膜結(jié)構(gòu)增多，見(jiàn)圖4。

圖4 透射電鏡檢測(cè)大鼠比目魚(yú)肌自噬體形態(tài)

2.4 間歇性禁食對(duì)大鼠比目魚(yú)肌自噬相關(guān)蛋白的影響

2.4.1 比目魚(yú)肌AMPK α、p-AMPK α蛋白表達(dá)變化

4周實(shí)驗(yàn)后，間歇性禁食組大鼠比目魚(yú)肌內(nèi)AMPKα、p-AMPKα的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），表明間歇性禁食過(guò)程中能量攝入減少可能激活了能量開(kāi)關(guān)AMPK。見(jiàn)圖5。

圖5 大鼠比目魚(yú)肌內(nèi)AMPKα、p-AMPKα蛋白表達(dá)

2.4.2 比目魚(yú)肌ULK 1蛋白表達(dá)變化

ULK1是AMPK通路調(diào)控自噬的下游信號(hào)。4周實(shí)驗(yàn)后，間歇性禁食組大鼠比目魚(yú)肌ULK1蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖6。

2.4.3 比目魚(yú)肌LC 3、 p62蛋白表達(dá)變化

經(jīng)過(guò)4周實(shí)驗(yàn)后，間歇性禁食組大鼠比目魚(yú)肌內(nèi)LC3-Ⅰ蛋白水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平非常顯著地高于對(duì)照組（P＜0.01），間歇性禁食組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值也明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）。此外，間歇性禁食組大鼠比目魚(yú)肌中的p62在4周間歇性禁食后明顯低于對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn)圖7。

圖6 大鼠比目魚(yú)肌內(nèi)ULK1蛋白表達(dá)

圖7 大鼠比目魚(yú)肌內(nèi)LC3、p62蛋白表達(dá)

3 討論

3.1 間歇性禁食對(duì)大鼠體重的控制情況

禁食是一種控制機(jī)體能量攝入的方法，在研究過(guò)程中通常使用的三種禁食方案為能量攝入限制（calor?ic restriction，CR）、隔日禁食（alternate-day fasting，ADF）和飲食限制（dietary restriction，DR）[9]。間歇性禁食（intermittent fasting，IF）是在歐美地區(qū)日益流行的新興減肥手段，是指周期性地在一定的時(shí)間內(nèi)保持零熱量或極低熱量攝入，禁食期間保證正常飲水的方法。由于其禁食和攝食呈周期性規(guī)律，因此在保證周期性的前提下可調(diào)整間歇性禁食的時(shí)間，隔日禁食也屬于間歇性禁食。目前，間歇性禁食作為一種潛在的非藥理學(xué)干預(yù)手段，已被證明可以增進(jìn)健康，延緩衰老。機(jī)體在間歇性禁食過(guò)程中，由于能量收支平衡遭到破壞，會(huì)動(dòng)用脂肪供能，對(duì)加速脂肪分解、減少體內(nèi)脂肪含量、降低體重起到積極作用。研究發(fā)現(xiàn)間歇性禁食可顯著減少肥胖者體重[10]以及BMI[11]。但可能存在的問(wèn)題是在熱量攝取沒(méi)有調(diào)整的情況下，由于間歇性禁食后靜息能量支出的減少，可能使禁食期間體重增加[12]。

本研究在參照Vasconcelos等設(shè)計(jì)的大鼠隔日禁食方案的基礎(chǔ)上，以減少禁食時(shí)間，降低禁食“強(qiáng)度”為原則，修改Brown等提出的間歇性禁食模型，建立每周三、周五食物完全剝奪，周二至周六進(jìn)行禁食與否的交替操作的間歇性禁食模型，這樣在影響AMPK表達(dá)后，可通過(guò)周一和周日正常飲食進(jìn)行調(diào)整，以達(dá)到研究“低強(qiáng)度”間歇性禁食的目的。結(jié)果在進(jìn)行4周實(shí)驗(yàn)后，間歇性禁食組大鼠體重及體脂含量明顯低于對(duì)照組（P＜0.01），這表明本實(shí)驗(yàn)間歇性禁食方案對(duì)于控制體重、降低體脂含量具有較為明顯的效果。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中課題組每周保證對(duì)照組和間歇性禁食組大鼠的食物總量相等，但在實(shí)際喂養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)大鼠在非禁食日，尤其是每周日和下周一并未將食物全部攝入。這就無(wú)法解釋研究結(jié)果是由空腹還是能量攝入減少引起的，分析原因可能是禁食強(qiáng)度不夠，下一步進(jìn)行隔日禁食再觀察上述情況。無(wú)論是空腹還是能量攝入減少均可以啟動(dòng)“能量開(kāi)關(guān)”AMPK。作為細(xì)胞內(nèi)的能量感受器，AMPK的激活主要由磷酸化完成，并調(diào)節(jié)包括骨骼肌組織在內(nèi)的機(jī)體多條下游靶向通路，在調(diào)節(jié)糖代謝和脂代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。運(yùn)動(dòng)可促使機(jī)體能量消耗，增加AMP/ATP比值，激活A(yù)MPK已得到公認(rèn)，同樣能夠改變機(jī)體能量水平的禁食也可促進(jìn)大鼠骨骼肌AMPK磷酸化水平[13]，并且在激活A(yù)MPK時(shí)引發(fā)糖代謝和脂代謝的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[14]。Wijngaarden等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在能量攝入限制過(guò)程中AMPK被激活的同時(shí)，受試者體內(nèi)脂肪酸的利用率明顯增加。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過(guò)4周間歇性禁食后，大鼠比目魚(yú)肌內(nèi)AMPKα及p-AMPKα蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01），表明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的間歇性禁食方案能夠改變AMPK水平調(diào)控糖脂代謝，進(jìn)而影響體脂含量和體重。

3.2 間歇性禁食誘導(dǎo)的自噬對(duì)大鼠骨骼肌質(zhì)量的影響

目前關(guān)于禁食對(duì)骨骼肌質(zhì)量方面的影響研究尚少且存在爭(zhēng)議，有研究發(fā)現(xiàn)熱量限制能減少衰老導(dǎo)致的肌肉質(zhì)量的丟失[16]，增強(qiáng)肌肉的收縮能力[17]。但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期的熱量限制會(huì)顯著減少大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)含量[18]，降低肌肉質(zhì)量[19]。本研究從比目魚(yú)肌濕重和肌纖維橫截面積入手，發(fā)現(xiàn)在4周間歇性禁食后并未發(fā)生顯著性差異，提示該間歇性禁食方式?jīng)]有造成大鼠比目魚(yú)肌骨骼肌質(zhì)量下降，可能與激活A(yù)MPK通路誘導(dǎo)適度自噬有關(guān)。

生命體借自噬維持蛋白代謝平衡及細(xì)胞環(huán)境穩(wěn)定，凈化自身多余或受損細(xì)胞器，自噬體的外膜與溶酶體膜融合，內(nèi)膜及其包裹的物質(zhì)進(jìn)入溶酶體腔，被溶酶體中的酶水解，自噬溶酶體內(nèi)分解出的其他成分可被細(xì)胞再利用。這一過(guò)程在細(xì)胞廢物清除、結(jié)構(gòu)重建、新陳代謝中起重要作用。自噬可被饑餓、缺血缺氧、細(xì)胞重建等多種應(yīng)激條件激活，其自噬標(biāo)志蛋白LC3表達(dá)會(huì)發(fā)生變化。在自噬體吞噬細(xì)胞組分時(shí)，胞漿內(nèi)LC3-Ⅰ會(huì)與磷脂酰乙醇胺結(jié)合，轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3-Ⅱ，通常使用LC3-Ⅱ或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平反映自噬活性。但自噬水平無(wú)論是過(guò)度還是不足，都會(huì)對(duì)骨骼肌質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。前者在大鼠尾懸吊的研究中已經(jīng)得到證實(shí)，會(huì)促使骨骼肌萎縮[20]；后者則不能及時(shí)清除受損的細(xì)胞器，導(dǎo)致骨骼肌凋亡甚至壞死發(fā)生[21]。

AMPK分為α、β和γ三種亞單位，其中α分為α1和α 2，β分為β1和β2，γ分為γ1、γ2和γ3等不同亞型。AMPK具有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，p-AMPK-Thr172是AMPK被激活所發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)之一，其磷酸化水平受高濃度ATP引起的上游激酶磷酸化和蛋白質(zhì)磷酸酶抑制去磷酸作用，共同誘導(dǎo)AMP進(jìn)行精確底物調(diào)節(jié)，而且細(xì)胞內(nèi)AMP和ATP濃度變化可影響上述調(diào)節(jié)過(guò)程[22]。營(yíng)養(yǎng)水平、運(yùn)動(dòng)程度、藥物干預(yù)等因素均可誘導(dǎo)自噬，而且自噬水平的增加可能與促進(jìn)健康甚至延長(zhǎng)壽命有關(guān)[23-25]。禁食過(guò)程中能量消耗可改變AMP/ATP比例，激活A(yù)MPK強(qiáng)烈誘導(dǎo)自噬發(fā)生，有研究表明自噬可以促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)細(xì)胞的存活，其通過(guò)細(xì)胞質(zhì)成分的“自我消化”，在有限的能源中回收所有的營(yíng)養(yǎng)成分，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)合成和蛋白質(zhì)降解之間的平衡，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[26，27]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期禁食可上調(diào)自噬關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄，增加骨骼肌中的BECN1和LC3蛋白水平，提示自噬可以從細(xì)胞中去除功能失調(diào)的細(xì)胞器和受損蛋白質(zhì)，進(jìn)而減少炎癥，改善代謝穩(wěn)態(tài)[28]。

本研究發(fā)現(xiàn)4周實(shí)驗(yàn)后，間歇性禁食組大鼠比目魚(yú)肌自噬標(biāo)志分子LC3-Ⅱ及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），p62明顯低于對(duì)照組（P＜0.01），提示間歇性禁食可能通過(guò)激活A(yù)MPK，誘導(dǎo)骨骼肌自噬。在調(diào)控過(guò)程中AMPK可以通過(guò)TSC1/2抑制mTORC1、通過(guò)JNK抑制BCL2、通過(guò)促進(jìn)FoxO3激活自噬，但最直接的途徑為磷酸化ULK1激活自噬[29-31]。AMPK可通過(guò)在Ser317、Ser777、Ser467、Ser555等多個(gè)位點(diǎn)磷酸化ULK1，mTORC1也可以在Ser317、Ser777位點(diǎn)磷酸化ULK1并產(chǎn)生抑制作用，AMPK激活可在Ser757磷酸化ULK1抑制mTORC1[32]。本研究發(fā)現(xiàn)4周實(shí)驗(yàn)后，間歇性禁食組大鼠比目魚(yú)肌ULK1表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)間歇性禁食模型激活A(yù)MPK后可能是通過(guò)促進(jìn)ULK1激活骨骼肌自噬。自噬的迅速激活對(duì)于快速清除對(duì)機(jī)體造成危害或處于堆積狀態(tài)的蛋白和細(xì)胞器，保證骨骼肌正常生理狀態(tài)具有重要意義。盡管有報(bào)道指出，禁食在增加自噬的同時(shí)導(dǎo)致肌肉萎縮發(fā)生，但從長(zhǎng)期來(lái)看適度的自噬可以清除失活線粒體和聚集的肌纖維，防止肌細(xì)胞死亡[33]。Bujak等研究發(fā)現(xiàn)禁食期間的骨骼肌AMPK敲除鼠會(huì)出現(xiàn)自噬停止現(xiàn)象，從而影響肌肉功能和線粒體活動(dòng)[34]。這說(shuō)明在能量不足的情況下，細(xì)胞通過(guò)增強(qiáng)自噬活性也是作為細(xì)胞能量缺乏的一種補(bǔ)充。由于線粒體功能紊亂可導(dǎo)致骨骼肌萎縮，運(yùn)動(dòng)可以通過(guò)線粒體生物合成和線粒體自噬提高線粒體功能和骨骼肌機(jī)能[35]。因此，我們推測(cè)間歇性禁食在機(jī)體能量水平下降的狀態(tài)下激活A(yù)MPK誘導(dǎo)的適度自噬，可以清除骨骼肌內(nèi)堆積的蛋白或細(xì)胞器，從而保證骨骼肌質(zhì)量。

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，4周間歇性禁食可以有效降低大鼠體脂含量，起到控制體重的作用，且不會(huì)導(dǎo)致骨骼肌質(zhì)量下降，其原因可能與AMPKα磷酸化激活下游ULK1，誘導(dǎo)適度骨骼肌自噬，增強(qiáng)骨骼肌適應(yīng)有關(guān)。建議從骨骼肌線粒體等細(xì)胞器的角度，研究長(zhǎng)期間歇性禁食或不同強(qiáng)度的間歇性禁食作用，系統(tǒng)闡明作用機(jī)制，為進(jìn)一步明確該方法的“減肥”效果奠定基礎(chǔ)。

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Effects of Four-week Intermittent Fasting on Skeletal Muscle Mass and Autophagy in Rats

Wang Zhen，Yu Liang，Shi Xiaoyu
Sport Science College，Beijing Sport University，Beijing 100084，China Corresponding Author:Yu Liang，Email：yuliang@bsu.edu.cn

ObjectiveTo observe the changes of body weight，fat mass and skeletal muscle mass of rats after 4 weeks of intermittent fasting，and explore relationship with autophagy in skeletal muscle，so as to provide theoretical basis for intermittent fasting.MethodTwenty male Sprague Dawley rats were randomly divided into a control group（Con）and an intermittent fasting group（IF），each of 10.The rats of IF group were forbidden to eat food every Wednesday and Friday，and the body weight of both groups was recorded weekly.After 4 weeks，Dual-Energy X-Ray Absorption（DEXA）was used to ana?lyze the body fat mass，then the bilateral soleus was separated to record the wet weight and measure the cross-sectional area of the soleus fibers by testing laminin with immunofluorescence confocal laser scanning microscope.The form of autophagic vacuole of soleus was observed using a transmission elec?tron microscopy.The expression of autophagy-related protein LC3，p62 and regulating protein AMPK，p-AMPK and ULK1 were measured using Western blotting.ResultAfter 4 weeks of intermittent fasting，the weight and fat mass of IF were significantly lower than those of Con （P＜0.01），but there were no significant differences between them in wet weight and cross-sectional area of soleus（P＞0.05）.The ex?pressions of AMPK，p-AMPK，ULK1 in IF were significantly higher than those in Con（P＜0.01）.Com?pared with Con，the expression of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰof IF increased significantly，while the expression ofp62 decreased significantly（P＜0.01）.ConclusionFour weeks of intermittent fasting decreases the fat mass significantly，and control the weight efficiently.Intermittent fasting can maintain the skeletal mus?cle mass by promoting moderate autophagy through the AMPK-ULK1 pathway.It should be a potential“l(fā)ose weight”method for further research.

intermittent fasting，skeletal muscle mass，autophagy，AMPK，LC3

2017.02.04

國(guó)家自然科學(xué)基金（31500964），霍英東教育基金會(huì)資助（151095），國(guó)家體育總局全民健身課題（2015B046），中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金資助，北京體育大學(xué)自主科研課題（2016RB018，2017YB028）

第1作者：王禎，Email：434436884@qq.com；

于亮，E-mail：yuliang@bsu.edu.cn