吳衛(wèi)東

鄭州大學體育學院（鄭州 450044）

有氧運動訓練對ApoE—/—小鼠肝臟鐵調(diào)素蛋白和血清IL-6、MCP-1含量的影響

吳衛(wèi)東

鄭州大學體育學院（鄭州 450044）

目的：觀察有氧運動訓練對載脂蛋白E基因缺陷（ApoE—/—）小鼠肝臟鐵調(diào)素（Hepcidin）蛋白表達及血清IL-6、MCP-1水平的影響，探討有氧運動防治ApoE—/—小鼠動脈粥樣硬化（AS）的作用。方法：20只8周齡雄性ApoE—/—小鼠隨機分為對照組（C組，10只）和運動組（E組，10只），對照組小鼠不運動，運動組小鼠進行14周遞增負荷跑臺訓練，每周5次，即小鼠由第1～5周10 m/min，30 min，逐漸遞增至13 m/min，60 min，跑臺坡度為0°。14周運動干預結束后取材，對小鼠主動脈進行包埋并進行冰凍切片，然后經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）和油紅O（ORO）染色，觀察主動脈的病理變化，采用Western blot方法檢測肝臟Hep?cidin蛋白表達水平，同時采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫（ABC-ELISA）方法檢測血清Hepcidin、白細胞介素-6（IL-6）及單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）含量。結果：對照組小鼠主動脈血管壁纖維板斷裂，可見大量泡沫細胞浸潤和纖維斑塊，運動組小鼠較對照組主動脈病變減輕；運動組小鼠Hepcidin蛋白表達及血清水平顯著低于對照組（P＜0.01）；運動組小鼠血清IL-6、MCP-1水平顯著低于對照組（P＜0.01）。結論：長期有氧運動訓練降低了ApoE—/—小鼠肝臟Hepcidin蛋白表達和血清水平，同時降低了小鼠血清中炎癥因子IL-6、MCP-1的水平，從而發(fā)揮了防治ApoE—/—小鼠動脈粥樣硬化的作用。

動脈粥樣硬化；運動；ApoE—/—小鼠；Hepcidin；IL-6；MCP-1

動脈粥樣硬化（AS）是一種常見的動脈血管疾病，其所致的心、腦血管疾病發(fā)病率和死亡率均居各種疾病前列。有研究發(fā)現(xiàn)AS發(fā)生發(fā)展的重要機制之一是動脈粥樣斑塊內(nèi)鐵沉積的顯著增多[1，2]。斑塊內(nèi)鐵沉積一方面會導致巨噬細胞浸潤和泡沫細胞出現(xiàn)[3]，另一方面可使血管內(nèi)皮細胞脂質(zhì)過氧化反應增強，促進巨噬細胞進一步浸潤，不斷放大氧化應激及炎癥反應[4]，這是加速AS發(fā)生發(fā)展的重要因素。Hepcidin是一種主要在肝臟合成分泌的抗菌多肽，是一種負性鐵調(diào)節(jié)激素，當機體鐵缺乏時，Hepcidin表達減少使更多的鐵進入血漿；當機體鐵過多超過需要時，Hepcidin表達增加抑制小腸鐵的吸收和單核巨噬細胞鐵的釋放，使更多的鐵被限制在細胞內(nèi)從而降低血漿中的鐵含量[5]。Hepcidin過度表達可使AS斑塊內(nèi)鐵沉積增多，巨噬細胞脂質(zhì)積聚及炎癥反應增強，導致AS斑塊的不穩(wěn)定性增加[6，7]。有氧運動是防治AS的有效手段，但關于有氧運動能否通過抑制肝臟Hepcidin蛋白的表達發(fā)揮防治AS的作用尚未見報道。本研究以載脂蛋白E基因缺陷（ApoE—/—）小鼠為動物模型，觀察有氧運動對小鼠肝臟Hepcidin蛋白表達及對AS病變的影響，探討有氧運動通過Hep?cidin防治AS的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及運動方案

20只8周齡雄性ApoE—/—小鼠以二級條件飼養(yǎng)，合格證號：scxk（京）2009-0007。適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為對照組（C組）和運動組（E組），每組10只，兩組小鼠均飼以高脂膳食飼料（21%豬油，0.15%膽固醇，78.85%普通飼料）[8]。

對照組不運動，運動組小鼠于每日上午9～10時同時進行跑臺運動，遞增運動強度和時間，每周5次，即小鼠由第1～5周10 m/min，30 min，逐漸遞增至13 m/min，60 min，跑臺坡度為0°，穩(wěn)定此運動量至14周末。此運動方案參考Bedford[9]等的研究確定，運動強度相當于75%最大攝氧量。

1.2 取材

14周運動干預結束后所有小鼠麻醉，內(nèi)刺取血，制備血清。心臟血管在體經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水灌流后取出全心臟、主動脈及肝臟，DEPC水沖洗。取材前運動組小鼠停止運動48小時，禁食過夜。

1.3 測試指標和方法

主動脈病理觀察：全心臟標本經(jīng)4%多聚甲醛固定4小時，然后從心尖部切除一半心室，OCT包埋，沿心室部分進行連續(xù)冰凍切片，直至切到主動脈瓣。切片厚度10 μm進行連續(xù)切片，至主動脈瓣消失為止。從每只小鼠主動脈連續(xù)切片中每間隔10張取一張，共取10張進行HE及ORO染色，光鏡下對組織切片隨機選擇3個視野進行觀察。

血清Hepcidin、白細胞介素-6（IL-6）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）含量測定：雙抗夾心酶聯(lián)免疫（ABC-ELISA）方法，實驗步驟嚴格按試劑盒使用說明書操作。

肝臟Hepcidin蛋白測定：采用Western blot方法檢測。取100 mg肝臟充分剪碎加入裂解液，勻漿后離心（14000 r/min，30 min）取上清液，測定蛋白濃度。調(diào)整上樣量后，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，用濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%的脫脂奶粉封閉1小時，TBST洗滌后加一抗（1∶200）4oC過夜。TBST沖洗3次，加堿性磷酸酶標記的二抗（1∶3000）稀釋液孵育1小時后顯色，以肝臟Hepcidin與β-Actin的比值作為相對表達量。

1.4 主要試劑和儀器

臺式高速低溫離心機（AvantiTM30），美國BECK?MAN公司；BLATER冰凍切片機，ATTENPON公司；酶標儀，美國熱電公司Multiskan MK 3；光學顯微鏡（AVNOX），OLYMPUS公司；電泳儀，北京六一儀器廠；ABC-ELISA試劑盒，美國R＆D公司；油紅O染料，美國Sigma公司；β-Actin一抗，北京中山金橋生物技術有限公司；Hepcidin一抗，美國Abcam公司；二抗（山羊抗兔），北京中山金橋生物技術有限公司；PVDF膜 ，美國Millipore公司。

1.5 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差（±s）表示，用SPSS14.0數(shù)據(jù)軟件包進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗。顯著性水平P＜0.05。

2 結果

2.1 主動脈病理觀察

對照組小鼠主動脈HE染色觀察所見10例，發(fā)現(xiàn)大部分主動脈竇血管壁纖維板分裂成多層狀、出現(xiàn)間隙，斷裂嚴重，內(nèi)膜失去原有的波浪狀，且斑塊內(nèi)可見大量膽固醇結晶，顯示出易損斑塊的特征。運動組小鼠主動脈HE染色觀察所見10例，發(fā)現(xiàn)大部分主動脈竇血管壁彈力纖維排列致密，偶有斷層，內(nèi)膜較完整，斑塊內(nèi)膽固醇結晶較少，見圖1a、b。

對照組小鼠主動脈ORO染色觀察所見10例，發(fā)現(xiàn)大部分主動脈竇血管腔可見大量被染成鮮紅色的脂肪團塊并占據(jù)部分管腔。運動組小鼠主動脈ORO染色觀察所見10例，發(fā)現(xiàn)大部分主動脈竇血管腔內(nèi)脂肪團塊著色相對較淺，斑塊脂質(zhì)含量較少，只在貼近管壁內(nèi)膜存在，血管腔的狹窄趨緩，見圖1c、d。結果提示有氧運動有效延緩了ApoE—/—小鼠AS的發(fā)展。

圖1 ApoE—/—小鼠主動脈竇橫截面染色觀察

2.2 血清IL-6、MCP-1含量

運動組小鼠血清IL-6、MCP-1水平顯著低于對照組（P＜0.01），見表1。提示有氧運動可降低ApoE—/—小鼠血清IL-6、MCP-1水平。

表1 兩組小鼠血清IL-6、MCP-1水平比較（n=10）

2.3 肝臟Hepcidin蛋白表達及血清含量

運動組小鼠肝臟Hepcidin蛋白表達及血清水平顯著低于對照組（P＜0.01），見表2、圖2。提示有氧運動可降低ApoE—/—小鼠肝臟Hepcidin蛋白表達及血清水平。

表2 兩組小鼠肝臟Hepcidin蛋白表達及血清含量的比較（n=10）

圖2 兩組小鼠肝臟Hepcidin Western Blot蛋白表達

3 討論

ApoE缺失會導致循環(huán)血液中膽固醇積累而誘發(fā)AS，ApoE—/—小鼠就是利用基因敲除技術，造成血液中膽固醇清除困難而不需要高脂飲食就會自發(fā)形成AS，且產(chǎn)生的AS斑塊病變位置、病變過程與人類極為相似[10，11]。ApoE—/—小鼠AS模型是否成功建立主要依據(jù)主動脈病理形態(tài)學觀察，本實驗主動脈病理形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)對照組小鼠主動脈內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)皮細胞下可見大量泡沫細胞聚集及粥樣斑塊，表明本實驗AS模型成功建立，同時發(fā)現(xiàn)有氧運動可有效延緩ApoE—/—小鼠AS的發(fā)生發(fā)展。

3.1 有氧運動訓練防治ApoE—//—小鼠AS過程中Hepci?din與IL-6、MCP-1的作用

AS是一種長期慢性炎癥疾病，炎癥細胞浸潤是其重要特征。血管壁最初的炎癥反應是通過炎癥細胞增生保持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，從而實現(xiàn)對血管損傷的保護，但是血管壁炎癥如不能及時消除則會對內(nèi)皮組織和血管造成破壞，引發(fā)斑塊破裂及血栓等并發(fā)癥[12，13]。大量研究顯示，炎癥因子IL-6、MCP-1促進了AS的發(fā)生發(fā)展。IL-6可以誘導內(nèi)皮細胞產(chǎn)生急性反應蛋白，增強對宿主自身的破壞性炎癥，而且還可進一步激活主動脈TNF-α信號系統(tǒng)，從而形成正反饋的級聯(lián)放大效應，使炎癥反應加強[14]。MCP-1是AS炎癥反應發(fā)生的重要因子，它在AS斑塊巨噬細胞和平滑肌細胞內(nèi)均有表達。MCP-1可以特異性趨化激活單核/巨噬細胞并使其進入血管內(nèi)皮分化為巨噬細胞，然后通過大量攝取氧化型極低密度脂蛋白并聚集膽固醇，使巨噬細胞變?yōu)榕菽毎鸞15]，這是AS發(fā)生發(fā)展的關鍵步驟。本研究發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠肝臟Hepcidin蛋白的過度表達及高血清水平與血清炎癥因子IL-6、MCP-1的高水平相一致，同時運動組小鼠的各項指標較對照組顯著降低，提示Hepcidin可能通過促進斑塊內(nèi)的炎癥反應加速了ApoE—/—小鼠AS病變的發(fā)展。

鐵雖然是人體必需的元素，但其不成對電子可以催化生成氧自由基導致細胞損傷和脂質(zhì)過氧化反應，因此鐵的沉積成為促進AS發(fā)生發(fā)展的重要因素，有研究發(fā)現(xiàn)AS發(fā)生的初始階段斑塊內(nèi)鐵的濃度已經(jīng)顯著升高[16]。鐵作為一種強氧化劑一方面可以促進內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞內(nèi)低密度脂蛋白氧化生成具有強致AS作用的氧化型低密度脂蛋白，進而被組織巨噬細胞的清道夫受體識別并聚集大量脂質(zhì)形成泡沫細胞；另一方面鐵的沉積可以加速巨噬細胞凋亡并釋放細胞內(nèi)容物，使巨噬細胞進一步浸潤從而不斷放大炎癥反應[17，18]。在Hepcidin的作用下大量鐵沉積于AS斑塊，導致斑塊內(nèi)的炎癥反應增強并通過釋放大量炎癥因子如IL-6、MCP-1等加速AS的發(fā)生發(fā)展，這可能是Hepcidin促進AS發(fā)生發(fā)展的主要機制。過度表達的Hepcidin主要通過兩個方面的作用使大量鐵沉積于斑塊內(nèi)：（1）Hepcidin與小腸上皮細胞的膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白1（Fp1）結合并促其降解，使小腸吸收的鐵向血漿轉(zhuǎn)運減少[19]，從而增加斑塊內(nèi)鐵的沉積；（2）Hepcidin與巨噬細胞膜表面的Fp1結合促其內(nèi)吞、降解，抑制巨噬細胞鐵的釋放[20]，從而促進斑塊內(nèi)巨噬細胞鐵的沉積。由此可見，有氧運動可能通過降低小鼠肝臟Hepcidin蛋白表達和血清水平減少了AS斑塊內(nèi)鐵的沉積，有效減弱了斑塊內(nèi)的炎癥反應并降低了炎癥因子IL-6、MCP-1的血清水平，從而延緩了AS的發(fā)生發(fā)展。

3.2 有氧運動訓練在防治ApoE—//—小鼠AS過程中對肝臟Hepcidin蛋白表達的影響機制

本實驗發(fā)現(xiàn)有氧運動抑制了小鼠肝臟Hepcidin蛋白的表達并降低了其血清水平，分析其機制可能有以下幾方面：（1）有氧運動通過影響機體鐵水平降低肝臟Hepcidin蛋白表達及血清水平。有研究發(fā)現(xiàn)機體鐵負荷增加時Hepcidin表達增強，反之當機體鐵缺乏時Hepcidin表達減弱[21]。機體內(nèi)鐵元素大約70%儲存在紅細胞，所以機體鐵的需求量與紅細胞水平密切相關。長期的有氧運動促使機體內(nèi)紅細胞生成增多，大量的鐵釋放入血漿，從而導致肝臟Hepcidin蛋白表達及血清水平降低；（2）有氧運動通過改善機體的長期慢性炎癥狀態(tài)降低肝臟Hepcidin蛋白表達及血清水平。研究發(fā)現(xiàn)炎癥刺激可引起Hepcidin mRNA的過度表達[22，23]，炎癥反應發(fā)生時肝臟Hepcidin mRNA的表達主要受IL-6調(diào)控，高水平的IL-6可誘導肝臟Hepcidin mRNA的過表達，Hepcidin的過表達反過來可進一步上調(diào)IL-6的表達水平，因此Hepcidin與IL-6之間可以相互作用，形成一個惡性循環(huán)。長期有氧運動可顯著改善機體的慢性炎癥狀態(tài)，抑制機體IL-6的表達，打破Hepci?din與IL-6之間的惡性循環(huán)，從而抑制肝臟Hepcidin蛋白表達并降低其血清水平；（3）有氧運動通過影響弗林蛋白酶-鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白信號系統(tǒng)降低肝臟Hepcidin蛋白表達及血清水平。主要在骨骼肌和心肌表達的鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白（HJV）是一種重要的調(diào)節(jié)Hepcidin表達的蛋白，它主要有兩種亞型，一是經(jīng)弗林蛋白酶作用的分泌型sHJV，另一種是通過糖基磷脂酰肌醇錨合在細胞膜上的GPI-HJV。sHJV可以通過與GPI-HJV相互競爭阻斷骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號通路的傳導從而抑制Hepcidin蛋白的表達[24，25]。有氧運動可使弗林蛋白酶的表達水平提高，高水平的弗林蛋白酶會使sHJV產(chǎn)生增多，同時增加GPI-HJV的脫落，因此，有氧運動可能通過此信號通路直接降低肝臟Hepcidin蛋白表達及血清水平。

4 結論

長期有氧運動訓練降低了ApoE—/—小鼠肝臟Hep?cidin蛋白表達和血清水平，同時降低了小鼠血清中炎癥因子IL-6、MCP-1的水平，從而發(fā)揮了防治ApoE—/—小鼠動脈粥樣硬化的作用。

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Effects of Aerobic Exercise on the Expression of Hepatic Hepcidin，and the Level of Serum IL-6 and MCP-1 in ApoE—/—Mice

Wu Weidong
Physical Education College of Zhengzhou University，Zhengzhou 450044，China Corresponding Author:Wu Weidong，Email:hwwd81@sina.com

ObjectiveTo observe the preventive effects of the aerobic exercise on the expression of hepatic hepcidin，and the level of serum IL-6 and MCP-1 in ApoE—/—rats with atherosclerosis（AS）and to explore the mechanism.MethodsTwenty 8-week male ApoE—/—mice were randomly divided in?to a control group and an exercise group，each of 10.The AS model was established in both groups through feeding high-fat diet.The control group was not given exercise intervention，while the exercise group underwent 14-week progressive intensity treadmill training，5 times a week，starting at 10 m/min for 30 min for the first 5 weeks and increasing to 13 m/min for 60 min at the end.At the end of the experiment，aortic samples were fixed and treated using the hematoxylin-eosin staining and Oil Red O.Then the pathological changes of the aorta were analyzed.The hepcidin expression of liver and se?rum hepcidin was assessed using Western blotting，and the level of the，interleukelin-6 （IL-6） and monocyte chemotactic protein-1（MCP-1） were detected using ABC-ELISA.ResultsThe pathological slice showed that the vascular fiber plate and internal membrane of the aorta in the exercise group were better than that of the control group，with less ruptured vascular fibreboards，foam cell infiltrationand fiber plaques.The hepcidin expression of liver and the level of serum hepcidin，the level of the se?rum IL-6 and MCP-1 in the exercise group were significantly lower than those of the control group（P＜0.01 andP＜0.01）.ConclusionThe long-term aerobic exercise can prevent AS for ApoE—/—mice through lowering the expression of the hepatic hepcidin and serum hepcidin，as well as the level of se?rum IL-6 and MCP-1.

atherosclerosis，exercise，ApoE—/—mice，hepcidin，IL-6，MCP-1

2016.12.25

河南省高等學校重點科研項目計劃（15B890006）；鄭州大學體育學院院管科研項目計劃（2015C3007）

吳衛(wèi)東，Email：hwwd81@sina.com