褚曉蕾 王巍 謝凌堅 劉素娟 劉善云 傅力

1天津市天津醫(yī)院康復科（天津 300211）2天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院（天津 300070）3天津體育學院運動與健康科學系（天津 300381）

運動介導 HSP70延緩增齡性骨骼肌萎縮的機理研究

褚曉蕾1王巍1謝凌堅2劉素娟2劉善云3傅力2

1天津市天津醫(yī)院康復科（天津 300211）2天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院（天津 300070）3天津體育學院運動與健康科學系（天津 300381）

目的：通過對自然衰老C57BL/6小鼠進行長期有氧運動干預，探討增齡性骨骼肌萎縮發(fā)生發(fā)展過程中細胞凋亡相關蛋白的變化及運動誘導HSP70對其影響，揭示運動預防增齡性骨骼肌萎縮的作用機理。方法：27周齡雄性C57BL/6小鼠50只，經(jīng) 1周適應性喂養(yǎng)后，隨機分為年輕對照組（YS組）、老年對照組（OS組）和老年運動組（OE組）。YS組（28周）小鼠經(jīng)抓力測試后立即處死取材。OE組小鼠采用30周、每周3～4次、每次50分鐘、75%VO2max有氧跑臺運動訓練（速度12米/分鐘，坡度0°）。OS組與OE組小鼠喂養(yǎng)至60周齡后，檢測抓力等指標后處死。隨即分離各組小鼠腓腸肌，稱重后檢測小鼠骨骼肌萎縮指數(shù)（Sarcopenia index,SI），隨后提取腓腸肌總蛋白。采用 Western Blot檢測小鼠腓腸肌組織HSP70，Cleaved Caspase-9蛋白表達水平；采用Co-IP法檢測小鼠腓腸肌HSP70與Apaf-1蛋白結合量；采用TUNEL法檢測小鼠腓腸肌細胞凋亡指數(shù)。結果：（1）SI變化：OS組小鼠腓腸肌SI較YS組顯著減少23.09%，而OE組SI與OS組相比顯著增加30.48%；（2）小鼠抓力：OS組小鼠抓力/體重比值比YS組顯著減少42.74%，OE組比OS組顯著增加21.51%；（3）凋亡指數(shù)檢測：伴隨年齡增加，OS組較YS組顯著增加475.28%，而有氧運動之后，OE組小鼠凋亡指數(shù)較OS組顯著減少46.41%；（4）Western Blot結果：OS組Cleaved Caspase-9表達水平較YS組顯著增加45.40%，OE組較OS組顯著減少33.40%；（5）腓腸肌HSP70與Apaf-1蛋白的結合量：OS組較YS組HSP70與Apaf-1結合量顯著下降67.11%，運動后OE組較OS組顯著增加306.31%。結論：（1）60周齡小鼠腓腸肌發(fā)生增齡性骨骼肌萎縮，30周有氧運動可顯著延緩增齡性骨骼肌萎縮；（2）增齡性骨骼肌萎縮可能與骨骼肌凋亡細胞增多有關，30周有氧運動可顯著抑制骨骼肌細胞凋亡；（3）30周有氧運動可增強HSP70與Apaf-1結合量，這可能是運動抑制骨骼肌細胞凋亡，延緩增齡性骨骼肌萎縮的機制之一。

有氧運動；HSP70；細胞凋亡；增齡性骨骼肌萎縮

增齡性骨骼肌萎縮是指隨年齡的增長，機體發(fā)生衰老性骨骼肌質(zhì)量下降，最大肌力和肌肉輸出功率顯著降低的現(xiàn)象[1]。增齡性骨骼肌萎縮可增加老年人跌倒、骨折的風險，降低老年人活動能力和生活自理能力，嚴重危害老年人健康、增加傷殘、死亡率[2]。根據(jù)Harman提出的自由基學說，外界環(huán)境、機體自身所產(chǎn)生的ROS是增齡性骨骼肌萎縮的主要誘因，ROS可激活Caspase-9形成級聯(lián)放大反應，誘導骨骼肌細胞凋亡，導致骨骼肌萎縮[3-4]。眾所周知，有氧運動作為防治增齡性骨骼肌萎縮的重要手段可改善老年人肌力，降低肌肉易傷性和脆弱性，緩解甚至部分逆轉其病理進程，然而有氧運動延緩增齡性骨骼肌萎縮的具體分子機制尚未完全清楚。有研究表明長期耐力運動可增強自噬對代謝產(chǎn)物降解，減少細胞內(nèi)代謝產(chǎn)物堆積，抑制ROS產(chǎn)生，抑制骨骼肌萎縮[5]。也有研究證實有氧運動可抑制骨骼肌細胞凋亡，增強Ⅱb型骨骼肌纖維基因表達使其比例增加，引起肌肉肥大，增強骨骼肌質(zhì)量和力量[6]。因HSP70可增強機體抗氧化能力還可抑制骨骼肌細胞凋亡，其在有氧運動延緩增齡性骨骼肌萎縮中的作用受到廣泛關注。HSP是一類在進化上高度保守的蛋白質(zhì)，廣泛存在于原核和真核細胞中，并參與細胞的損傷和修復過程。根據(jù)其分子量和同源度不同，將其分為 HSP90，HSP70，HSP60和sHSP 4個亞型。HSP70也稱HSP72，在細胞內(nèi)增強骨骼肌細胞抗氧化相關蛋白表達，增強機體抗氧化能力，抑制 ROS產(chǎn)生[7]。HSP70還可與Apaf-1結合阻止Caspase-9前體的募集，抑制Caspase-9激活，阻斷細胞凋亡過程[8]。

有氧運動可能通過誘導HSP70過表達抑制機體組織氧化應激反應，阻斷細胞凋亡過程，防治增齡性骨骼肌萎縮，但這一假設尚需進一步實驗證實。本實驗通過對自然衰老小鼠進行長期有氧跑臺運動干預，利用Western Blot等生物學方法檢測骨骼肌細胞凋亡相關蛋白的表達，探討增齡性骨骼肌萎縮發(fā)生進程中骨骼肌細胞凋亡蛋白表達變化及運動訓練介導的 HSP70對相關蛋白表達的影響，從細胞凋亡的視角解釋增齡性骨骼肌萎縮的發(fā)生機制以及運動干預防治增齡性骨骼肌萎縮的作用機理。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立

實驗選用50只雄性、27周齡C57BL/6小鼠，體重為22.33±1.31 g，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。小鼠購入后基礎飼料喂養(yǎng)1周，分籠飼養(yǎng)、1只/籠，期間自由進食水，實驗環(huán)境為室溫 22～25℃，濕度為30%～40%，每天光照12小時。動物適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為年輕對照組（YS組，n=15）、老年對照組（OS組，n=15）和老年運動組（OE組，n=15），飼以正常飼料（購于中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所）。期間自由飲水，每周稱體重。

1.2 抓力測定

隨機分組后，年輕組小鼠（約28周齡）進行抓力檢測后處死，老年對照組與老年運動組小鼠分別飼養(yǎng)至28周、36周、44周、52周、60周齡后使用小鼠抓力測定儀（購自淮北正華生物儀器設備公司）進行抓力檢測。小鼠抓力測定具體操作方法如下：

（1）調(diào)節(jié)儀器水平放置，旋動儀器上的兩個前機腳，使儀器上的水平氣泡穩(wěn)定在水準器中心圈，使儀器達到水平位置。

（2）測定：按動測定鍵，將小鼠放置于抓力板上，抓住鼠尾輕柔向后牽拉，待動物抓牢抓力板后，均勻用力后拉，致使小鼠松爪，儀器自動記錄下該小鼠的每次拉力值，取3次測定值的平均值。

1.3 運動方案

運動組小鼠進行為期1周的適應性訓練，以適應跑臺運動。首次運動跑臺速度為10米/分鐘，時間為30分鐘，之后逐步增加運動強度和時間，跑臺坡度為0°。然后進行為期30周、75%VO2max強度的有氧跑臺運動（跑速為12米/分鐘，參照Fernando等制定的跑與最大攝氧量對應表[9]，隔天1次，50 分鐘/次，3～4次/周）。

1.4 骨骼肌組織等樣本的留取

OS組與OE組喂養(yǎng)至60周齡后，將兩組小鼠禁食14～16小時，隨后斷頸處死小鼠、迅速分離小鼠腓腸肌。由于小鼠體重的個體差異，選取SI值（即骨骼肌質(zhì)量與體重比值）來衡量骨骼肌質(zhì)量增減程度。分離小鼠腓腸肌后稱重并計算每只小鼠的SI值。隨后分離出的腓腸肌經(jīng)液氮速凍，速凍后移至－80°C冰箱保存?zhèn)溆?。隨機選取各組小鼠腓腸肌并制備約5 mm正方形組織塊。骨骼肌組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后常規(guī)制作厚度為6 μm石蠟切片。

1.5 凋亡指數(shù)檢測

TUNEL法染色步驟根據(jù)細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行（武漢博士德生物技術公司）。隨機選取各組骨骼肌組織石蠟切片行TUNEL染色，每張切片于400倍光鏡下，隨機選擇6個無重復視野，計數(shù)細胞核包括呈棕黃色的TUNEL陽性細胞核及所有細胞核。骨骼肌細胞凋亡指數(shù)=平均陽性染色細胞核數(shù)／所有細胞核數(shù)。

1.6 蛋白樣品提取

采用1%NP-40法提取各組小鼠骨骼肌總蛋白，其裂解液中含Tris 50 mM，NaCl 150 mM，EDTA 15 mM（pH 8.0），最后加入1%NP 40，混勻后于4°C保存。制作樣品時，每100 mg組織加入裂解液約400 μl，1×Protease Inhibitor和 1×Phosphatase Inhibitor，電動勻漿，然后于4°C，15000 g離心20分鐘，取上清，測定蛋白濃度，分裝、凍存于－80°C冰箱備用。

1.7 SDS--PPAAGGEE凝膠電泳

根據(jù)分子量的不同制備不同濃度的分離膠，積層膠均為5%，用微量加樣器加入樣品孔內(nèi)等量的總蛋白，并于一側加樣孔內(nèi)加入預染蛋白Marker 6μl。使用Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液（250 mmol/L甘氨酸，25 mmol/L Tris-Base，0.1%SDS，pH 7.6），60V電壓下電泳30分鐘后，再轉換成100V電壓電泳2小時。

1.8 電轉印

采用濕法電轉?。ㄞD膜緩沖液：39 mmol/L甘氨酸，48 mmol/L Tris-base，0.037%SDS，20%甲醇，pH 8.3），電流300 mA，2小時。根據(jù)PVDF膜上預染蛋白Marker的轉移情況，判斷蛋白轉移情況。

1.9 Western BBlloott

轉膜結束后，取出PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉1小時后，用1×TBST洗滌PVDF膜，使用含5%BSA 的抗體稀釋液分別稀釋一抗。4°C孵育過夜。次日用1×TBST洗膜3次，每次5分鐘；用5%脫脂奶粉溶液按照1∶10000稀釋二抗，室溫孵育1小時，再用1×TBST洗膜3次，每次5分鐘；最后用ECL反應液做為發(fā)光底物，于暗室內(nèi)進行X光膠片曝光，經(jīng)顯影、定影后觀察分析結果。

1.10 免疫共沉淀

1.10.1 磁珠的制備

用微量移液器重懸磁珠，取50 μl磁珠加入1.5 ml試管，將小管置于磁力架上，待上清液變清晰后，棄上清，將小管從磁力架上移除。

1.10.2 抗體結合

稀釋抗體 Anti-HSP70 Primary Antibody，抗體比例為1∶200，即1 μg 抗體加200 μl 抗體結合清洗緩沖液（Ab Binding&Washing Buffer），將稀釋好的抗體加入裝有磁珠的小管中，搖床室溫孵育10分鐘，將小管置于磁力架上，待上清液變清晰后，棄上清，將小管從磁力架上移除，用200 μl抗體結合清洗緩沖液重懸沉淀。

1.10.3 靶抗原的免疫沉淀

將小管置于磁力架上，待上清液變清晰后，棄上清，將小管從磁力架上移除，加入200 μl總蛋白溶液，重懸沉淀，搖床室溫孵育10分鐘，將小管置于將小管置于磁力架上，待上清液變清晰后，棄上清，在小管中加入200 μl清洗液，重懸沉淀，清洗3次。加100 μl清洗液，重懸沉淀，將重懸液轉入新的小管。

1.10.4 靶抗原的洗脫

將小管置于磁力架上，待上清液變清晰后，棄上清，加入20 μl 洗脫液（Elution Buffer） 及10 μl 預先混合好的LDS Sample Buffer和 Sample Reducing Agent，70°C加熱10分鐘后將上清加入上樣孔進行電泳，Western Blot檢測HSP70/Apaf-1。

1.11 統(tǒng)計學分析

采用 SPSS統(tǒng)計軟件（SPSS 11.5 for Windows）分析實驗數(shù)據(jù)，并計算均值和標準差（±s）。兩組間對比采用獨立樣本t檢驗，顯著水平定為P＜0.05。

2 實驗結果

2.1 小鼠腓腸肌骨骼肌萎縮指數(shù)

本實驗處死小鼠后隨機選取各組小鼠腓腸肌稱重，發(fā)現(xiàn)OS組小鼠腓腸肌質(zhì)量比YS組小鼠低 6%（P＞0.05），而 OE 組比 OS組高 33% （P＜0.05）（圖 1.A）。本實驗發(fā)現(xiàn)OS組小鼠腓腸肌SI較YS組低23.09% 具顯著性差異（P＜0.05），而OE組比OS組高30.48% 具顯著性（P＜0.05）（圖1.B）。 上述結果提示60周齡C57BL/6小鼠骨骼肌SI隨年齡的增加發(fā)生顯著下降，30周有氧耐力運動能夠促進小鼠骨骼肌SI增加。

2.2 小鼠抓力測定結果

小鼠抓力結果見圖1.C-D，對各年齡組（28周齡、36周齡、44周齡）小鼠進行抓力檢測未發(fā)現(xiàn)顯著性差異，但可看出小鼠抓力伴隨年齡增加逐步下降。52周小鼠抓力檢測結果（圖1.C）顯示：OS組抓力值比YS組高16%（P＜0.05），而OE組小鼠抓力較OS組高11%（P＜0.05）?？紤]到小鼠體重差異的影響，僅檢測抓力不能準確反映小鼠組間差異，因此本實驗利用抓力/體重來減少小鼠個體差異。結果發(fā)現(xiàn)，伴隨著小鼠周齡的增加，OS組小鼠抓力/體重比值較YS組顯著低15%（P＜0.05），OE組比OS組高6%（P＞0.05）。在60周齡時，抓力值組間差異性變化與52周齡一致（圖1.D），各組間的抓力/體重比值也發(fā)生顯著改變。OS組小鼠抓力/體重比值較YS組顯著低42.74%（P＜0.05），OE組比OS組高21.51%，具顯著性差異（P＜0.05）。上述結果表明伴隨年齡的增長，骨骼肌肌力也隨之降低，而有氧運動可顯著緩解增齡性骨骼肌肌力下降。

圖1 小鼠腓腸肌SI值、抓力和抓力/體重

2.3 增齡對腓腸肌細胞凋亡指數(shù)影響

腓腸肌細胞凋亡隨年齡變化特點見圖2.A-B。伴隨年齡增加，OS組較YS組高475.28%，具顯著性差異（P＜0.05），而有氧運動之后，OE組小鼠骨骼肌細胞凋亡指數(shù)較OS組顯著低46.41%（P＜0.05）。以上結果表明，隨著小鼠周齡增加，腓腸肌細胞凋亡指數(shù)顯著增高，提示骨骼肌細胞凋亡可能是引起骨骼肌萎縮的主要原因之一。然而，有氧運動后腓腸肌細胞凋亡指數(shù)顯著降低，表明有氧運動可顯著抑制骨骼肌細胞凋亡。

圖2.C-D顯示腓腸肌細胞Cleaved Caspase-9表達水平。OS組的Cleaved Caspase-9蛋白表達水平較YS組高45.3%，具顯著性差異（P＜0.05）。OE組Cleaved Caspase-9表達水平較OS組顯著低33.4%（P＜0.05）。腓腸肌細胞內(nèi)Caspase-9轉化為Cleaved Caspase-9后作為上游信號蛋白活化下游的Caspase酶，繼發(fā)骨骼肌細胞凋亡。因此，腓腸肌細胞Cleaved Caspase-9可反映骨骼肌細胞凋亡程度且與TUNEL染色結果相一致。

圖2 各組小鼠腓腸肌細胞凋亡指數(shù)

2.4 HSP70蛋白表達水平

各組小鼠骨骼肌細胞HSP70蛋白表達統(tǒng)計結果如圖3.A-B。YS組HSP70表達較OS組高13.98%（P＞0.05），運動后OE組較OS組高52.37%，具有顯著性差異（P＜0.05）。

2.5 HSP70和Apaf-1結合量

各組小鼠骨骼肌細胞HSP70與Apaf-1結合量統(tǒng)計結果如圖3.C和圖3.E所示：OS組與YS組相比HSP70與Apaf-1結合量低67.11%（P＜0.05），30周有氧運動后OE組與OS組相比HSP70與Apaf-1結合量高306.31%，具顯著性差異（P＜0.05）。另外，本試驗利用免疫共沉淀技術使用Apaf-1抗體驗證其與HSP70結合量，結果與上述結果相一致（圖3.D和圖3.F）。

圖3 HSP70與Apaf-1蛋白結合量

3 討論

骨骼肌是機體重要的運動器官，增齡性骨骼肌萎縮是衰老的主要標志，其表現(xiàn)為骨骼肌纖維數(shù)目減少、肌肉質(zhì)量降低和肌力減小。國內(nèi)外已有眾多研究支持骨骼肌質(zhì)量和力量在衰老過程中下降。有研究對不同月齡的C57BL/6小鼠（4月、8月、15月、18月、22月和24月齡）骨骼肌質(zhì)量進行對比研究發(fā)現(xiàn):18月齡時C57BL/6小鼠股四頭肌已比4月齡小鼠股四頭肌SI顯著降低，且隨著年齡的增加SI進一步降低[10]，表明隨著年齡的增長小鼠骨骼肌質(zhì)量逐漸下降。另有研究將抓力作為診斷增齡性骨骼肌萎縮的重要指標，分別檢測8月齡、12月齡、20月齡和 28月齡C57BL/6小鼠抓力，發(fā)現(xiàn)12月齡時小鼠抓力值較8月齡顯著減少，并且出現(xiàn)增齡性降低的趨勢[11]。有氧運動可改善機體的生理機能、增進肌力、延緩肌肉萎縮，這已被眾多研究和事實所證明[12-13]。本研究結果也發(fā)現(xiàn)伴隨年齡增長小鼠肌肉質(zhì)量和力量逐步下降，而有氧運動顯著增強肌肉質(zhì)量和力量，改善增齡性骨骼肌萎縮。然而有氧運動改善增齡性骨骼肌萎縮機制尚未完全清楚。有研究認為有氧運動可增強IGF-1蛋白表達水平，繼發(fā)mTOR活化，肌原纖維合成增加，抑制骨骼肌萎縮[14]。也有研究發(fā)現(xiàn)有氧運動可增強骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖能力、減少肌間脂肪的生成，延緩骨骼肌萎縮[15]。然而隨著細胞凋亡檢測技術的成熟和研究領域的擴展，骨骼肌細胞凋亡被認為是引起增齡性骨骼肌萎縮的重要機制之一，這為有氧運動延緩增齡性骨骼肌萎縮研究提出了新的方向。有研究發(fā)現(xiàn)，在正常大鼠骨骼肌組織中很少出現(xiàn)凋亡細胞核，而在失神經(jīng)支配的肌萎縮大鼠骨骼肌組織中發(fā)現(xiàn)具凋亡特征的細胞核，且隨著失神經(jīng)支配時間的延長，骨骼肌萎縮程度加重、凋亡細胞核數(shù)目逐漸增加，提示骨骼肌細胞的凋亡與失神經(jīng)肌肉萎縮相關，萎縮越嚴重，凋亡的細胞核數(shù)目越多[16]。本實驗也證實衰老導致骨骼肌細胞凋亡數(shù)量顯著增加，骨骼肌力量和質(zhì)量下降，進一步證實骨骼肌細胞凋亡可能是增齡性骨骼肌萎縮的重要原因。然而本實驗還發(fā)現(xiàn)長期有氧耐力運動可顯著減少老齡組小鼠骨骼肌細胞凋亡數(shù)量，增強骨骼肌質(zhì)量和力量。這表明抑制凋亡可能是氧運動延緩增齡性骨骼肌萎縮的重要機制。然而眾多研究發(fā)現(xiàn)運動亦可導致細胞凋亡。有研究證實，運動性疲勞時大鼠骨骼肌細胞呈棕黃色染色的凋亡細胞比例顯著增多，骨骼肌細胞凋亡出現(xiàn)的高峰與運動訓練時間存在正相關[17]。另外，也有研究證實急性高強度跑臺運動后，小鼠骨骼肌細胞ROS生成增加，骨骼肌細胞氧化應激水平增加、抗氧化相關蛋白表達降低，骨骼肌凋亡細胞數(shù)量顯著增加[18]。據(jù)此推斷，運動是否誘導骨骼肌細胞凋亡，負荷強度是一個關鍵因素，強度過大可能會誘發(fā)大量細胞向壞死方向轉化，有氧運動顯著減少凋亡骨骼肌細胞，僅引發(fā)少量細胞損傷，并且受損細胞都將會以凋亡的方式“自殺”，促進受損細胞循環(huán)再利用，加快新細胞的生成。

細胞凋亡激活途徑分為外源性途徑和內(nèi)源性途徑兩種，而線粒體介導的內(nèi)源性途徑被認為是引起增齡性骨骼肌萎縮的主要途徑[19]。隨年齡增加，機體氧化防御能力下降，ROS生成增多，ROS激活線粒體凋亡途徑，通透性轉換孔開放，線粒體膜電位下降，線粒體釋放Cyt c，引起Cytc從線粒體釋放進入胞質(zhì)，與胞質(zhì)中Apaf-1和Caspase-9相互作用，形成復合物。結合到復合物上的Caspase-9自身活化，轉化為Cleaved Cas?pase-9，切割和活化下游的效應Caspase酶，繼發(fā)細胞內(nèi)凋亡信號通路的激活。本研究發(fā)現(xiàn)長期有氧耐力運動可顯著降低Cleaved Caspase-9表達水平，抑制線粒體介導的凋亡信號通路，減少其通路相關蛋白表達。

有氧運動抑制線粒體介導凋亡信號通路的分子生物學機制仍不完全清楚，有研究發(fā)現(xiàn)HSP70可增強機體抗氧化能力、抑制線粒體介導的骨骼肌細胞凋亡[20]。有氧運動可引起機體產(chǎn)生多種生理適應性變化，包括體溫升高、細胞線粒體氧化解耦聯(lián)引起的自由基生成增多等，這些生理適應性變化和誘導HSP70過表達的眾多因素相似，據(jù)此推測運動也可誘導HSP的過表達并得到實驗證實。因此，HSP70可能是長期運動增強細胞對各種刺激的抵抗能力、抑制骨骼肌細胞凋亡、延緩增齡性骨骼肌萎縮，延緩衰老的重要因素之一。但本實驗并未發(fā)現(xiàn)小鼠骨骼肌細胞HSP70表達水平的增齡性變化，提示僅靠HSP70抗氧化、抗凋亡功能難以解釋本實驗的骨骼肌細胞凋亡的增齡性改變。有研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌細胞HSP70可與Apaf-1結合阻斷Caspase-9前體的募集，抑制Caspase-9激活及細胞凋亡過程[8]。據(jù)此推測增齡可能降低骨骼肌細胞HSP70與Apaf-1的結合，引起內(nèi)源性凋亡信號通路活化，增加骨骼肌凋亡細胞數(shù)量，導致增齡性骨骼肌萎縮。而有氧運動可增加骨骼肌細胞HSP70與Apaf-1結合量，抑制結合至復合物上的Caspase-9轉化為Cleaved Caspase-9，減少切割并活化下游效應Caspase酶，抑制細胞凋亡信號通路的活性，減少骨骼肌凋亡細胞數(shù)量，增加骨骼肌質(zhì)量和力量。這一假設可能是有氧運動抑制骨骼肌細胞凋亡、改善增齡性骨骼肌萎縮的重要機制之一。

4 總結

本研究發(fā)現(xiàn)60周齡小鼠腓腸肌發(fā)生增齡性骨骼肌萎縮，其發(fā)生機制可能與HSP70與Apaf-1結合量下降、骨骼肌細胞線粒體介導內(nèi)源性凋亡信號通路激活有關；30周有氧運動干預可增加骨骼肌細胞HSP70與Apaf-1的結合、抑制線粒體介導的內(nèi)源性凋亡信號通路的活化，延緩增齡性骨骼肌萎縮。有氧運動介導骨骼肌細胞HSP70表達增加可通過抑制細胞凋亡、延緩骨骼肌萎縮，這可能是運動延緩增齡性骨骼肌萎縮的機制之一。未來將進一步研究該假設中的其他關鍵點，深入探索細胞凋亡在運動抗衰老過程的作用機制，進一步充實完善運動抗衰老理論基礎，為指導運動防病健身提供實驗依據(jù)。

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The Role of Heat Shock Protein 70 in Exercise-attenuating Sarcopenia

Chu Xiaolei1，Wang Wei1，Xie Lingjian2，Liu Sujuan2，Liu Shanyun3，F(xiàn)u Li2
1 Department of Rehabilitation，Tianjin Hospital，Tianjin 300211，China 2 Department of Physiology and Pathophysiology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China 3 Tianjin Institute of Physical Education，Tianjin 300381，China Corresponding Author:Fu Li，Email:lifu@tmu.edu.cn

ObjectivesTo observe the changes of apoptosis-related proteins during the development of sarcopenia and to explore the effect and mechanism of long-term aerobic exercises and heat shock pro?tein 70（HSP70）on those changes for the natural aging C57BL/6 mice.MethodsAfter 1 week of ac?climatization，50 27-week-old male C57BL/6 mice were randomly divided into a young sedentary con?trol（YS）group，an old sedentary control（OS）group and an old exercises（OE）group.After the grip-strength was measured the mice from group YS were sacrificed at the age of 28 weeks.The mice from group OE exercised on a flat treadmill at 12m/minute for 50 min 3 or 4 times a week for 30 weeks with the intensity of 75%VO2max.At the age of 60 weeks，the mice of group OS and OE were killed after their grip-strength was measured.The gastrocnemius muscle of each group were isolated and weighted，and the sarcopenia index（SI）was measured.Then the total protein of the gastrocnemius mus?cle was extracted.HSP70 and cleaved caspase-9 expression were examined.The binding rate of HSP70 and Apaf-1 was measured using Co-Immunoprecipitation.TUNEL staining was performed to detect the apoptosis of the gastrocnemius muscle.Results（1） Compared with group YS，SI of group OS de?creased significantly by 23.09%，but significant increase was observed in group OE compared to group OS by 30.48%.（2）The grip strength per gram of body weight of group OS decreased significantly by 42.74%compared to group YS，while that of group OE increased significantly by 21.51%compared to group OS.（3） The apoptosis index increases by 475.28%with age.However，the index decreased by 46.41%in group OE over group OS.（4） Western blotting showed that the expression of cleaved cas?pase-9 increased significantly by 45.4%in group OS compared to group YS，while that of group OE decreased significantly by 33.4%compared to group OS.（5） The binding rate of HSP 70 with Apaf-1 of group OS decreased significantly by 67.11%compared to group YS，while that of group OE in?creased significanlty by 306.31%compared to group OS.Conclusions（1）Gastrocnemius atrophy occur?ring to mice of 60 weeks can be significanlty delayed through 30-week exercises training.（2） The in?creasing apoptosis may be involved in the development of age-related sarcopenia and 30-week exercis?es can significantly attenuate such apoptosis in rodent skeletal muscle.（3）Aerobic exercises increases HSP70/Apaf-1 interaction，which might play an important role in reducing age-related cellular damage and cell death in the skeletal muscle of rats.

exercise，HSP70，apoptosis，sarcopenia

2017.05.01

天津市應用基礎與前沿技術研究計劃項目（14JCYBJC27300）；國家自然科學基金（31571220）

第1作者：褚曉蕾，Email:chuxiaolei8@163.com；

傅力，Email：lifu@tmu.edu.cn