張麗琴, 劉 聰, 肖九長, 鄒淑慧

(贛州市人民醫(yī)院, 江西 贛州 341000)

MTS法與儀器MIC法檢測耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素敏感性的差異

張麗琴, 劉 聰, 肖九長, 鄒淑慧

(贛州市人民醫(yī)院, 江西 贛州 341000)

目的了解耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)臨床分布特點，分析菌株產(chǎn)酶情況及驗證替加環(huán)素的體外抗菌活性。方法分析某院2015年1—12月臨床患者送檢標本中分離的53株CRKP的藥敏結(jié)果，對目標菌株進行改良Hodge試驗檢測碳青霉烯酶，同時采用EDTA協(xié)同試驗檢測金屬β-內(nèi)酰胺酶，使用MIC測試條(MTS)確認儀器MIC法中替加環(huán)素藥敏結(jié)果。結(jié)果53株CRKP科室分布主要為重癥監(jiān)護病房(ICU)14株，占26.42%，燒傷科13株(24.53%)；標本來源主要為痰23株(43.40%)，創(chuàng)面分泌物15株(28.30%)；年齡分布主要為≥60歲患者，檢出35株(66.04%)。CRKP對替加環(huán)素的敏感率最高(96.2%)。經(jīng)改良Hodge試驗確認有48株產(chǎn)碳青霉烯酶，陽性率90.6%，同時15株產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶。儀器MIC法判讀為替加環(huán)素耐藥的菌株經(jīng)MTS法驗證后均應(yīng)判讀為敏感。結(jié)論該院CRKP主要產(chǎn)碳青霉烯酶，其中部分菌株可產(chǎn)2類不同的β-內(nèi)酰胺酶；替加環(huán)素在藥敏試驗中對CRKP具有良好的抗菌活性，經(jīng)儀器MIC法檢測為替加環(huán)素耐藥的菌株須進行MTS法確認。

肺炎克雷伯菌; 碳青霉烯類; 改良Hodge試驗; EDTA協(xié)同試驗; 替加環(huán)素MTS法； 耐藥性

[Chin J Infect Control，2017，16(9)：845-848,869]

全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，肺炎克雷伯菌的臨床分離率僅次于大腸埃希菌，但肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥率遠高于大腸埃希菌，已由2014年的6.4%上升為2015年的7.6%，給臨床抗感染治療帶來越來越多的困難與挑戰(zhàn)。因此，了解耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的臨床分布及產(chǎn)碳青霉烯酶的現(xiàn)狀，對于醫(yī)院感染控制和流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 某院2015年1—12月臨床患者送檢標本中分離的53株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae,CRKP)，已剔除同一患者相同部位檢出的重復(fù)菌株。

1.2 儀器與試劑 法國梅里埃公司生產(chǎn)的Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)及配套的GN、AST-GN16卡；血平板、MH平板購自廣州迪景公司；厄他培南紙片為英國Oxoid公司產(chǎn)品；EDTA協(xié)同試驗所需的IP/IPI條為法國梅里埃公司產(chǎn)品；替加環(huán)素MTS條為意大利Liofilchem公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 改良Hodge試驗 按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)M100-S24進行[1]，將0.5麥氏單位的大腸埃希菌ATCC 25922用生理鹽水稀釋10倍后涂布于MH平板，中間貼厄他培南(10 μg)紙片，用接種環(huán)挑取受試菌自紙片外緣向平板邊緣劃線接種，35℃孵育過夜，次日，厄他培南抑菌圈處出現(xiàn)矢狀生長者為產(chǎn)碳青霉烯酶的待檢菌。

1.3.2 EDTA協(xié)同試驗 采用IP/IPI試條進行協(xié)同試驗[2]。試條兩端含有梯度濃度抗生素，其中一端含亞胺培南(IP)，另一端含亞胺培南加EDTA(IPI)，將試條一面標有MIC刻度向上貼于涂布有待測菌株的MH平板上，同時做陽性和陰性對照。結(jié)果判讀：IPI處的MIC小于或等于IP處MIC 3個倍比稀釋度時(或比值≥8)，可確證該菌株產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶。

1.3.3 替加環(huán)素MTS法 將0.5麥氏單位的菌液涂布于MH平板上，室溫放置至表面干后，將MTS試條標有刻度一面朝上貼在平板表面，35 ℃孵育過夜，次日讀取結(jié)果時，應(yīng)當在80%抑菌處讀取MIC值，即通過肉眼觀察判斷明顯抑菌點，而忽略可能蔓延到終點周圍的菌斑或細小的微菌落。判讀標準參照美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的標準及文獻[3]，MIC≤2 μg/mL為敏感、4 μg/mL為中介、≥8 μg/mL為耐藥。

1.4 質(zhì)控菌株 質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌 ATCC 700603，均購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。產(chǎn)IMP-1和VIM-2金屬酶的銅綠假單胞菌為陽性對照菌株，由上海復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院惠贈。

2 結(jié)果

2.1 CRKP分布情況 53株CRKP科室分布為重癥監(jiān)護病房(ICU)14株，占26.42%，燒傷科13株(24.53%)，新生兒科、呼吸科、泌尿外科等其他科室共檢出26株(49.06%)；標本來源分布主要為痰23株(43.40%)，創(chuàng)面分泌物15株(28.30%)，血、尿、腹腔積液等標本共檢出15株(28.30%)；年齡分布主要為≥60歲患者，檢出35株(66.04%)，<60歲18株(33.96%)。

2.2 CRKP藥敏情況 53株CRKP除對替加環(huán)素的敏感率為96.2%外，僅對阿米卡星、左氧氟沙星的敏感率為35.8%、28.3%，對其他常見抗菌藥物的敏感率均<25%。詳見表1。

表153株CRKP對常見抗菌藥物的藥敏結(jié)果(%)

Table1Antimicrobial susceptibility testing results of 53 CRKP(%)

抗菌藥物耐藥率敏感率哌拉西林/他唑巴坦90．67．5阿莫西林/克拉維酸96．20．0頭孢唑林100．00．0頭孢曲松100．00．0頭孢吡肟75．513．2頭孢哌酮/舒巴坦90．67．5頭孢西丁84．99．4氨曲南88．711．3亞胺培南100．00．0阿米卡星64．235．8慶大霉素81．117．0妥布霉素73．615．1替加環(huán)素0．096．2左氧氟沙星69．828．3環(huán)丙沙星73．624．5呋喃妥因71．713．2復(fù)方磺胺甲口惡唑79．220．8

注：中介未列出

2.3 改良Hodge試驗、EDTA協(xié)同試驗及替加環(huán)素MTS法結(jié)果 53株CRKP經(jīng)改良Hodge試驗有48株產(chǎn)碳青霉烯酶，陽性率90.6%，同時進行EDTA協(xié)同試驗發(fā)現(xiàn)15株產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶。使用MTS法對53株經(jīng)儀器GN-16卡檢測的CRKP的替加環(huán)素(TGC)進行驗證后發(fā)現(xiàn)，儀器MIC法報告TGC敏感株的符合率為100%(35/35)，中介在內(nèi)的非敏感株的符合率僅11.1%(2/18)，TGC耐藥株經(jīng)MTS條確認其MIC值均≤2 μg/mL，應(yīng)判讀為敏感。詳見表2。

3 討論

表2 53株CRKP的改良Hodge試驗、EDTA協(xié)同試驗及替加環(huán)素藥敏結(jié)果

近年來，隨著治療嚴重感染的碳青霉烯類抗生素的臨床使用不斷增加，使細菌逐漸獲得了耐藥性，導(dǎo)致CRKP的檢出率不斷上升。本文報道的CRKP標本來源主要來自60歲以上的老年人，以ICU和燒傷科為主，與文獻[4-5]報道的CRKP感染的危險因素一致。尤其注意燒傷科創(chuàng)面分泌物中CRKP的大量檢出，提示醫(yī)院感染的可能性，為防范燒傷科CRKP感染暴發(fā)，醫(yī)院感染管理部門和燒傷科應(yīng)引起重視，進一步加強CRKP的篩查和監(jiān)測，做好接觸隔離等一系列防控措施。研究結(jié)果表明替加環(huán)素是藥敏試驗結(jié)果中敏感率最高的抗菌藥物，臨床醫(yī)生可根據(jù)藥敏結(jié)果采用聯(lián)合用藥方案治療多重耐藥菌，其療效優(yōu)于單藥治療[6-7]。

大量研究[8-10]表明產(chǎn)碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機制之一。以肺炎克雷伯菌為代表的腸桿菌科細菌鑒定出的各種碳青霉烯酶分屬于Ambler分類中的A類、B類和D類β-內(nèi)酰胺酶。KPC酶這一最常見的碳青霉烯酶是目前最具臨床意義的A類β-內(nèi)酰胺酶；VIM、IMP和NDM為最常見的3類B類金屬β-內(nèi)酰胺酶。CLSI推薦改良Hodge試驗作為懷疑產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科的確證試驗對KPC型碳青霉烯酶的檢測敏感性和特異性均>90%[1]，這點在本研究中再次得到確認。5株CRKP表型陰性，但其EDTA協(xié)同試驗陽性，提示產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶為該菌株水解碳青霉烯類抗生素的耐藥機制；另有10株CRKP在改良Hodge試驗陽性的同時EDTA協(xié)同試驗也為陽性，提示同時產(chǎn)兩類以上β-內(nèi)酰胺酶的CRKP不在少數(shù)。當然，此次研究僅針對表型進行篩查，具體的基因型仍需進一步深入研究。另外鑒于這些由質(zhì)粒介導(dǎo)的碳青霉烯酶極易在不同菌種中橫向傳播，造成碳青霉烯耐藥性的擴散。因此，臨床微生物實驗室應(yīng)進一步提升能力建設(shè)，提高CRKP等多重耐藥菌的檢測水平，配合醫(yī)院感染管理部門加強抗菌藥物臨床合理應(yīng)用的監(jiān)管，避免抗菌藥物濫用和過度使用，從而有效延緩細菌耐藥性的發(fā)生。

CLSI推薦采用肉湯稀釋法作為檢測替加環(huán)素體外藥物敏感性的金標準。MTS法與肉湯稀釋法相關(guān)性最好，Vitek-2 GN16卡檢測結(jié)果高于肉湯稀釋法[11-13]，一致性較低。不同檢測方法對替加環(huán)素藥敏結(jié)果存在差異[14-17]。文中GN16藥敏卡檢測CRKP對替加環(huán)素敏感性結(jié)果的差異高于何翠娥等[18]的報道，盡管如此，仍可作為常規(guī)方法檢測肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素的敏感性，而MTS條價格昂貴，不適用于臨床常規(guī)檢測。針對文中替加環(huán)素非敏感株的符合率低這一現(xiàn)象，除可能與本次試驗非敏感株樣本數(shù)量較少有關(guān)外，一方面可能與肺炎克雷伯菌黏稠的菌落不易調(diào)配合適的藥敏濃度有一定的關(guān)系；另一方面儀器采用光電比濁法進行MIC的檢測，會存在拖尾現(xiàn)象，容易將S誤報為I或R。通過此次MTS法與GN16藥敏卡符合性的驗證得出日常工作中出現(xiàn)替加環(huán)素中介或耐藥的菌株時，必須使用MTS法進行確認，特別在對待CRKP等多重耐藥或泛耐藥菌時，更應(yīng)該注重替加環(huán)素藥敏結(jié)果的真實性，以確保臨床在治療多重耐藥菌或泛耐藥菌的抗菌藥物選擇上獲得重要支持。

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(本文編輯：熊辛睿、陳玉華)

Differenceinsusceptibilityofcarbapenem-resistantKlebsiellapneumoniaetotigecyclinedetectedbyMTSandinstrumentalMICassay

ZHANGLi-qin,LIUCong,XIAOJiu-chang,ZOUShu-hui

(GanzhouPeople’sHospital，Ganzhou341000,China)

ObjectiveTo explore clinical distribution characteristics of carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae(CRKP), analyze enzyme production of strains and verify the in vitro antimicrobial activity of tigecycline.MethodsAntimicrobial susceptibility testing results of 53 strains of CRKP isolated from clinical specimens of patients in a hospital from January to December 2015 were analyzed, carbapenemase production of target strains was detected by modified Hodge test, metallo-β-lactamase was detected by EDTA synergy test, minimum inhibitory concentration(MIC) of tigecycline susceptibility testing result detected by instrument was confirmed by MIC test strip(MTS method).Results53 CRKP strains were mainly isolated from patients in intensive care unit (n=14, 26.42%) and burn unit(n=13, 24.53%); sputum(n=23, 43.40%) and wound secretion(n=15, 28.30%) were the main specimen sources; isolation rate of CRKB was highest in the elderly≥60 years old, 35 strains(66.04%)of CRKP were isolated. CRKP was most sensitive to tigecycline(96.2%). The modified Hodge test showed that 48 strains(90.6%) produced carbapenemases and 15 strains produced metallo-β-lactamase. MICs of tigecycline-resistant strains detected by instrument were all confirmed as susceptibility by MTS.ConclusionCRKP mainly produce carbapenems in this hospital, some strains can produce two types of different β-lactamases; antimicrobial susceptibility testing showed that tigecycline has good antimicrobial activity against CRKP, tigecycline-resistant strains detected by instrument must be confirmed by MTS method.

Klebsiellapneumoniae; carbapenem; modified Hodge test; EDTA synergy test; tigecycline MTS method; drug resistance

2016-07-25

張麗琴(1981-)，女(漢族)，江西省贛州市人，副主任技師，主要從事微生物鑒定及耐藥機制研究。

鄒淑慧 E-mail:364235529@qq.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.09.013

R378.2

A

1671-9638(2017)09-0845-05