付娟 劉培?

隱丹參酮聯(lián)合曲美替尼誘導胃癌細胞凋亡作用及其機制

付娟 劉培?

目的 研究隱丹參酮增強MEK抑制劑曲美替尼誘導胃癌細胞MGC803凋亡的作用及其分子機制。方法 選用對數(shù)生長期的MGC803細胞，將其分為對照組、隱丹參酮組、曲美替尼組和隱丹參酮組/曲美替尼組聯(lián)合用藥組。采用CCK-8法檢測隱丹參酮對曲美替尼增殖的影響，PI/Annexin-V雙標記流式細胞術檢測凋亡率的變化，Western blot檢測STAT3及ERK等激酶的變化以及凋亡相關蛋白Caspase-3、Caspase-9和PARP的水平。結果 隱丹參酮顯著增強曲美替尼對MGC803細胞的增殖抑制和凋亡誘導作用，細胞的促凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9和PARP顯著激活；曲美替尼可顯著抑制MGC803細胞ERK磷酸化水平，但同時可見STAT3磷酸化水平明顯升高，而隱丹參酮聯(lián)合曲美替尼可同時顯著抑制ERK和STAT3的磷酸化水平。結論 STAT3在曲美替尼作用胃癌細胞MGC803的過程中被顯著激活，聯(lián)合應用STAT3抑制劑隱丹參酮可逆轉STAT3的活化，從而增強曲美替尼誘導MGC803凋亡作用。本研究為MEK抑制劑曲美替尼和STAT3抑制劑隱丹參酮聯(lián)合治療胃癌提供了新的實驗依據(jù)，為胃癌的臨床治療提供新的選擇。

曲美替尼 隱丹參酮 胃癌 STAT3 細胞凋亡

胃癌是我國發(fā)病率居第二位﹑病死率居第三位的惡性腫瘤，5年總體生存率僅為30%，嚴重威脅著人類健康［1］。胃癌患者多數(shù)在就診時已處于進展期，即便是根治性切除，局部復發(fā)率仍高達＞50%［2］。分子靶向治療具有高效﹑低毒等特點，成為繼手術﹑化療﹑放療后的一種新的胃癌治療手段。MEK抑制劑曲美替尼（Trametinib）是一種高特異性的﹑有效的MEK1/2抑制劑，通過靶向抑制MEK1和MEK2，可有效抑制腫瘤的生長［3］，但臨床實驗表明，曲美替尼單獨用藥療效欠佳，臨床上多與其他藥物聯(lián)合使用［4］。隱丹參酮（Cryptotanshinone，CPT）是來自中藥丹參的單體化合物，具有抑制腫瘤細胞增殖﹑誘導腫瘤細胞凋亡及促進腫瘤細胞分化等多種抗腫瘤活性。本研究觀察CPT酮聯(lián)合曲美替尼誘導胃癌細胞凋亡的作用，為曲美替尼聯(lián)合用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞﹑藥物及主要試劑 胃癌MGC803細胞系購自中國科學院上海細胞庫；MEK抑制劑曲美替尼（Trametinib）﹑STAT3抑制劑CPT購自Selleck；胎牛血清購自南美GIBCO公司；胰酶﹑PBS﹑PIMI-1640培養(yǎng)基購自杭州科易生物技術有限公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）購自日本同仁公司；RIPA細胞裂解液購于Beyotime公司；蛋白酶抑制劑﹑磷酸酶抑制劑購于Merck公司；1.5M Tris-CI PH8.8﹑1M Tris-CI PH6.8﹑1M Tris-CI PH7.4購自北京普利萊基因技術有限公司；30%丙烯酰胺﹑PVDF膜（0.2μm）﹑蛋白濃度測定試劑盒﹑ECL顯影試劑購自美國BIO-RAD公司；一抗ERK﹑pERK﹑STAT3﹑pSTAT3Tyr705﹑β-actin﹑PARP﹑Cleaved-casepase3﹑Cleaved-casepase9等以及二抗均購自美國CST公司。1.2 細胞培養(yǎng) 胃癌MGC803細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)于37℃﹑5%CO2和95%濕度的細胞培養(yǎng)箱。細胞單層貼壁生長，每2天按1：3傳代培養(yǎng)。

1.3 CCK-8檢測細胞增殖 MGC803制成3.5～5×104/ ml的細胞懸液，以200μl/孔接種于96孔板，培養(yǎng)過夜。不同濃度的Trametinib或CPT單獨或聯(lián)合處理細胞24h，0.01%的DMSO處理細胞作為空白對照。每孔加入20μl的CCK-8，混勻后繼續(xù)孵育1～4h左右，Thermo VARIOSKAN FLASH多功能酶標儀以450nm波長檢測吸光度值，計算細胞的存活率和各組藥物的抑制率。

1.4 Annexin V-FITC流式細胞術檢測細胞凋亡/ PI MGC803細胞以15～18×105每孔接種于6孔板，培養(yǎng)過夜，10μm的Trametinib﹑15μm的CPT單獨或聯(lián)合處理細胞24h，0.01%的DMSO處理細胞為空白對照。不含EDTA的胰酶收集細胞，PBS清洗一遍后重懸于100 μl的1×Binding Buffer，加5μl Annexin V-FITC 室溫避光孵育15min，然后加入碘化丙啶（PI）染料5μl繼續(xù)孵育5min，補加400μl 1×Binding Buffer，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.5 Western blot檢測蛋白表達水平及蛋白磷酸化水平 MGC803細胞正常培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)瓶，Trametinib﹑CPT單獨或聯(lián)合處理細胞，0.01%的DMSO處理細胞為空白對照。RIPA細胞裂解液（含有蛋白酶抑制劑﹑磷酸酶抑制劑）收集各組細胞，提取細胞總蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離不同大小蛋白，電轉移至PVDF膜（300mA﹑2h）。轉膜結束后，5%脫脂奶粉室溫封閉2h。一抗（稀釋比例1：1000）4℃孵育過夜，以β-actin為內部參考用1×TBST （pH 7.5 1mol/L Tris·HCL，NaCl，0.2% Tween-20） 清洗3次，10min/次。二抗（稀釋比例1：1000）室溫孵育2 h。用1×TBST清洗3次后，將ECL顯影液均勻加至膜上，凝膠成像系統(tǒng)Chemi Dox XRS（BIO-RAD）采集圖像。

2 結果

2.1 CPT和曲美替尼協(xié)同抑制胃癌細胞MGC803的增殖作用 與對照組相比，Trametinib 7.5μm﹑10μm和CPT 7.5μm作用24h對胃癌細胞MGC803的增殖均無明顯抑制作用（見圖1A和圖1B）；CPT 10μm和15μm具有一定的抑制作用，但CPT（10μm和15μm）和Trametinib（10μm）聯(lián)合作用時，抑制效果明顯增強（P＜0.05）（見圖1B），說明兩種藥物對MGC803具有協(xié)同抑制作用，抑制率達到（78.99±5.07）%。

2.2 CPT和曲美替尼協(xié)同誘導胃癌細胞MGC803凋亡作用 為觀察Trametinib和CPT對細胞MGC803凋亡的影響，采用Annexin V-FITC/PI流式細胞術檢測細胞凋亡率。Trametinib（15μm）或CPT（10μm）處理細胞24h后，細胞凋亡率分別為17.51%和51.95%，而二者聯(lián)合處理組的細胞凋亡率為94.11%，Trametinib和CPT具有明顯的協(xié)同誘導凋亡作用。提取細胞總蛋白，Western blot檢測PARP等凋亡標記蛋白的活化，聯(lián)合用藥組PARP﹑Casepase3和Casepase9均明顯被活化，說明Trametinib與CPT協(xié)同作用于MGC803細胞可誘導細胞發(fā)生凋亡。

圖1 CPT和曲美替尼協(xié)同抑制胃癌細胞MGC803的增殖

2.3 曲美替尼對胃癌MGC803細胞STAT3和ERK磷酸化水平的影響 Trametinib是高特異性MEK1/2抑制劑，可顯著抑制MEK-ERK信號通路，作者檢測了Trametinib對ERK的抑制作用。10μm Trametinib處理MGC803細胞不同時間，Western blot檢測ERK﹑STAT3等蛋白的磷酸化水平和蛋白表達水平。Trametinib處理細胞2h即可顯著抑制ERK磷酸化水平，而ERK蛋白表達水平在2～16h均無明顯變化，說明Trametinib可有效抑制MGC803細胞MEK-ERK通路。但同時可見，Trametinib處理細胞8h后STAT3磷酸化明顯持續(xù)活化，而STAT3蛋白表達水平無明顯變化。以上結果提示，Trametinib在抑制MEK-ERK通路后，可能導致了STAT3的旁路激活，STAT3的激活可導致MGC803對Trametinib的敏感性降低。

2.4 CPT聯(lián)合曲美替尼處理胃癌細胞MGC803后STAT3和ERK磷酸化水平的變化 10μm Trametinib與15μm CPT單獨或聯(lián)合處理MGC803細胞8h，Western blot檢測ERK﹑STAT3等蛋白的磷酸化水平和蛋白表達水平。結果顯示，Trametinib單獨處理細胞可顯著抑制ERK磷酸化，但同時可明顯激活STAT3磷酸化；而CPT單獨處理細胞可顯著抑制STAT3磷酸化，同時明顯激活ERK磷酸化水平；當Trametinib和CPT聯(lián)合處理細胞時，發(fā)現(xiàn)STAT3和ERK的磷酸化水平均被顯著抑制。結果說明，Trametinib和CPT對MGC803的協(xié)同誘導凋亡作用可能是源于對STAT3和ERK的聯(lián)合抑制。

3 討論

Ras/Raf/MEK/ERK通路的異常與腫瘤的發(fā)生密切相關，由于其導致細胞增殖失控和凋亡受阻，因此可作為腫瘤治療的一個靶點。MEK抑制劑曲美替尼是一種高特異性﹑有效的MEK1/2抑制劑，通過對MEK蛋白的作用，影響ERK的活性，抑制細胞增殖［5-7］。但有研究表明，和其他靶向藥物一樣，曲美替尼治療一定時間后，可導致STAT3的異常激活，使腫瘤細胞對曲美替尼的敏感性明顯降低，降低藥物療效［8］。信號傳導和轉錄激活因子（STAT3）與腫瘤關系密切，異常活化的STAT3信號通路通過對下游靶基因的轉錄激活作用，促進腫瘤細胞增殖和浸潤轉移，抑制細胞凋亡，促進腫瘤血管生成，其異常活化與腫瘤的發(fā)生﹑發(fā)展及預后密切相關。本研究中，曲美替尼處理胃癌細胞MGC803 8h后即可見STAT3磷酸化水平顯著上升，曲美替尼單獨處理24h對MGC803并無明顯的增殖抑制作用，說明STAT3的激活可能對胃癌細胞曲美替尼敏感性有一定影響，曲美替尼聯(lián)合STAT3抑制劑可能具有更強的抗腫瘤作用。

CPT是從丹參中提取的單體化合物，具有抗菌消炎﹑降溫﹑抗氧化等作用，近年多項研究證實其具有較好的抗腫瘤活性。有研究表明，CPT可抑制STAT3的磷酸化﹑抑制STAT3二聚體形成及入核，從而抑制STAT3的活性［9］。本研究結果也顯示，CPT可顯著抑制STAT3磷酸化水平，CPT和曲美替尼明顯協(xié)同誘導MGC803發(fā)生凋亡。同時可以看到，CPT單獨處理細胞MGC803后可見ERK磷酸化水平明顯上升，曲美替尼單獨處理細胞MGC803后STAT3磷酸化明顯上升，而CPT聯(lián)合曲美替尼處理細胞后ERK和STAT3磷酸化水平均顯著降低，預示二者的協(xié)同誘導凋亡作用與其分別抑制STAT3和ERK的活性有關。

本研究結果表明，曲美替尼抑制ERK活性的同時可導致STAT3的活化，而CPT抑制STAT3的同時可導致ERK的活化，而聯(lián)合用藥后可同時有效抑制ERK和STAT3，從而達到更好的抗腫瘤效果。關于對下游靶基因的調控以及對細胞周期凋亡等的影響需進一步研究。

綜上所述，分子靶向藥物已成為腫瘤治療的一個重要研究方向，研究腫瘤發(fā)病機制及藥物作用機制對腫瘤的靶向治療非常重要。靶向藥物單獨應用時容易出現(xiàn)耐藥性，降低藥物的治療效果，聯(lián)合用藥是腫瘤治療的必然趨勢。本研究為MEK抑制劑和STAT3抑制劑聯(lián)合治療胃癌提供了新的理論依據(jù)，有望為胃癌的臨床治療提供新的選擇。

［1］ 吳楠蝶,魏嘉,劉寶瑞．胃癌分子靶向治療的研究進展．醫(yī)學研究生學報,2014,27(12):1318-1322．

［2］ 汝童,劉鐵夫．胃癌診斷的研究進展．醫(yī)學綜述,2014,20(24): 4475-4477．

［3］ Sogabe S, Togashi Y, Kato H, et al． MEK inhibitor for gastric cancer with MEK1 gene mutations．Molecular Cancer Therapeuti cs,2014,13(12):3098-3106．

［4］ Flaherty KT, Infante JR, Daud A, et al．Combined BRAF and MEK Inhibition in Melanoma with BRAF V600 Mutations．New England Journal of Medicine,2012,367(18):91-92．

［5］ Yamaquchi T, Kakefuda R, Tajima N, et al． Antitumor activities of JTP-74057 (GSK1120212), a novel MEK1/2 inhibitor, on colorectal cancer cell lines in vitro and in vivo． International Journal of oncology, 2011,39(1):23-31．

［6］ Kim KB,Kefford R,Pavlick AC,et al．Phase II study of the MEK1/ MEK2 inhibitor Trametinib in patients with metastatic BRAF-mutant cutaneous melanoma previously treated with or without a BRAF inhibitor．Journal of Clinical Oncology Official Journal of the American Society of Clinical Oncology,2013,31(4):482-489．

［7］ 鄭宇靜,封宇飛．MEK1/2抑制劑曲美替尼的藥理作用與臨床評價．中國新藥雜志,2014,23(15):1723-1725．

［8］ Zhao C, Xiao H, Wu X, et al． Rational combination of MEK inhibitor and the STAT3 pathway modulator for the therapy in K-Ras mutated pancreatic and colon cancer cells．Oncotarget,2015, 6(16): 14472-14487．

［9］ Shin DS, Kim HN, Shin KD, et al． Cryptotanshinone inhibits constitutive signal transducer and activator of transcription 3 function through blocking the dimerization in DU145 prostate cancer cells． Cancer Research,2009,69(1):193-202．

Objective To investigate the synergistic effects of combining Cryptotanshinone （CPT） and MEK1/2 inhibitor trametinib on inducing apoptosis in human gastric cancer cell MGC803 and associated mechanisms. Methods The MGC803 cells at logarithmic growth phase were divided into CPT group， trametinib group， CPT/trametinib combination group and control group. The cell proliferation and cell apoptosis were detected by CCK8 assay and AnnexinV/PI staining， respectively. The expression levels of p-ERK， p-STAT3 and the cleaved form of caspases and PARP were tested by western blot. Results Cryptotanshinone signifi cantly enhanced the anti-proliferative and pro-apoptotic effects of trametinib in MGC803 cells. Apoptosis induced by combination of CPT and trametinib was accompanied with increased expression of cleaved -caspase-3， caspase-9 and PARP. Further studies revealed that trametinib signifi cantly suppressed the phosphorylation of ERK， while increased the phosphorylation of STAT3. The combination of CPT and trametinib signifi cantly decreased the phosphorylation of both of ERK and STAT3. Conclusion STAT3 is signifi cantly activated in gastric cancer cell MGC803 when treated with trametinib. The STAT3 inhibitor CPT can reverse the activation of STAT3， thereby enhance the anti-cancer effect of trametinib in MGC803. This study provides new experimental evidence for treatment of gastric cancer with combination of CPT and MEK inhibitor. Our strategy would provide new choice for clinical treatment of gastric cancer.

Trametinib Cryptotanshinone Gastric carcinoma STAT3 Apoptosis

310053 浙江中醫(yī)藥大學（付娟）

310006 浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院（劉培）

*通信作者