唐曉華 董文靜 駱豐 陳琳 章浙忠?

·實驗研究·

冬凌草甲素對胃癌Sgc-7901細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的影響

唐曉華 董文靜 駱豐 陳琳 章浙忠?

目的 通過體外無菌培養(yǎng)Sgc-7901細(xì)胞，觀察加入冬凌草甲素后，Sgc-7901細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響，評價冬凌草甲素對Sgc-7901細(xì)胞炎性因子的變化差異，探討冬凌草甲素抗腫瘤的機(jī)制，為臨床治療胃癌提供新的理論依據(jù)。方法 無菌培養(yǎng)Sgc-7901細(xì)胞，CCK-8實驗篩選冬凌草甲素作用24h后抑制Sgc-7901細(xì)胞增殖的最佳作用濃度；液相芯片分析系統(tǒng)測定冬凌草甲素對Sgc-7901細(xì)胞IL-2、IL-4、IL-6、IL-10以及TNF-α炎性因子的影響。結(jié)果 CCK-8實驗結(jié)果顯示，冬凌草甲素能抑制Sgc-7901細(xì)胞增殖，并且呈劑量依賴性，且IC50分別是66.88μm；液相芯片分析系統(tǒng)檢測冬凌草甲素處理前后Sgc-7901細(xì)胞IL-2、IL-4、IL-6、IL-10以及TNF-α炎性因子差異表達(dá)結(jié)果顯示：冬凌草甲素組與空白對照組比較，部分炎性因子表達(dá)下調(diào)。結(jié)論 冬凌草甲素可以抑制Sgc-7901細(xì)胞的增殖，下調(diào)了Sgc-7901細(xì)胞中IL-6等炎性因子的分泌，從而達(dá)到抗腫瘤的作用。

冬凌草甲素 Sgc-7901 炎性細(xì)胞因子

據(jù)國內(nèi)外腫瘤流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，隨著生存壞境的日益惡化，人類生活飲食等生存方式的改變，惡性腫瘤的發(fā)病率和病死率呈明顯上升的趨勢，惡性腫瘤已經(jīng)成為我國乃至全球性的公共健康問題［1］，嚴(yán)重威脅人類的生活質(zhì)量。冬凌草具有清熱解毒﹑消炎止痛﹑抗腫瘤之功效［2-3］，素有“人間仙草”之美稱。冬凌草甲素（Oridonin，Ori）是從冬凌草中提取的二萜類化合物，是抗腫瘤的主要活性成分，是中藥中的光譜抗生素。研究表明，冬凌草甲素對胃癌﹑胰腺癌等腫瘤細(xì)胞有一定的療效［4］，而細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性細(xì)胞因子與胃癌﹑胰腺癌等腫瘤細(xì)胞有一定的相關(guān)性，當(dāng)炎性因子比例失調(diào)時，可刺激腫瘤細(xì)胞惡性生長，血管和淋巴管生成以及腫瘤的浸潤，因此作者認(rèn)為冬凌草甲素在一定程度上可以引起胃癌細(xì)胞炎性因子的改變。目前，傳統(tǒng)的手術(shù)治療以及輔助放化療仍是胃癌的主要治療方式，然而手術(shù)治療無法徹底根除胃癌細(xì)胞，細(xì)胞二次復(fù)發(fā)率高，且放化療有明顯的毒副作用。因此，探索尋求一種新型的治療胃癌的方式以及藥物成為今后重要的研究熱點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人胃癌細(xì)胞Sgc-7901購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

1.2 主要試劑 冬凌草甲素（HPLC≥98%）（TAUTO BIOTECH）；RPMI 1640培養(yǎng)液（浙江吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；DMEM培養(yǎng)液（浙江吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；0.25%胰蛋白酶（浙江吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；PBS緩沖液［pH（7.2±0.1）］（浙江吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；無支原體胎牛血清（FB）（浙江天杭生物科技有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司）；Cell Counting Kit-8（CCK-8試劑盒）（碧云天生物技術(shù)研究所）；人細(xì)胞因子磁珠面板（美國 EMD Millipore公司）。

1.3 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（美國 Thermo公司，型號HEPA CLASS 100 3111）；低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司，型號SC-3610）；恒溫水浴箱（上海森信實驗儀器有限公司，型號DK-S24）；高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司，型號5541R）；Luminex 200 液相懸浮芯片系統(tǒng)（美國Luminex 公司，型號LX10009118401）。

1.4 方法 （1）人胃癌細(xì)胞Sgc-7901培養(yǎng)：人胃癌細(xì)胞Sgc-7901培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640，在37℃﹑5% CO2的恒定條件培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度＞80%，緩慢棄去原培養(yǎng)液，加入適量含EDTA的0.25%胰酶溶液，37℃﹑5% CO2培養(yǎng)箱中作用2～3 min，于倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞間隙增大或皺縮成圓形時，立即棄去胰酶，加入2倍體積含10%FBS的完全培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)輕柔吹打使細(xì)胞脫落，1000r/min離心5min收集細(xì)胞并棄去上清液，用適量培養(yǎng)液重懸細(xì)胞使細(xì)胞成為單細(xì)胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度接種于新細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。（2）CCK-8法檢測冬凌草甲素抑制BXPC-3/PANC-1﹑Sgc-7901﹑Hct 116細(xì)胞增殖實驗：將培養(yǎng)好的Sgc-7901細(xì)胞以5.0×104個/ml傳代培養(yǎng)于96孔板中，每孔100μl，于37℃﹑5% CO2培養(yǎng)箱孵育24h左右，待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，按分組分別加入含不同濃度冬凌草甲素的培養(yǎng)液100μl，使其終濃度為0﹑16﹑32﹑64﹑128μm，并設(shè)置調(diào)零孔，每組5個重復(fù)孔，96孔板四周用PBS填充，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后從培養(yǎng)箱中取出，以酶標(biāo)儀570 nm處測定OD值。（3）液相芯片分析系統(tǒng)檢測冬凌草甲素處理前后對Sgc-7901細(xì)胞炎性因子差異表達(dá)：將培養(yǎng)好的Sgc-7901細(xì)胞接種于24孔板，每孔接種3×104個/2×104個細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)60%左右時，按分組進(jìn)行處理：對照組更換新的培養(yǎng)液，冬凌草甲素實驗組更換成含66.88μm冬凌草甲素的培養(yǎng)液液，每組設(shè)3個重復(fù)孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)12h﹑24h和36h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，2000r/min離心10min，取上清，-80℃保存?zhèn)溆?。取出試劑盒和樣本，按儀器操作說明操作檢測，最后在滴定板所有孔中加入150μl鞘液，搖床上震蕩5min后，使微球呈懸浮狀態(tài)，將板子置入Luminex 200TM，執(zhí)行軟件后，保存并分析MFI結(jié)果，計算樣品中的炎癥細(xì)胞因子濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素對Sgc-7901細(xì)胞增殖活力的影響 由圖1和圖2可知，冬凌草甲素能顯著抑制Sgc-7901細(xì)胞增殖，并且呈劑量依賴性，通過SPSS17.0軟件計算可得：作用時間為24h時冬凌草甲素抑制Sgc-7901細(xì)胞增殖的IC50為66.88μm。

2.2 冬凌草甲素對Sgc-7901細(xì)胞分泌炎性因子表達(dá)的影響 通過液相芯片系統(tǒng)檢測冬凌草甲素作用前后人胃癌Sgc-7901細(xì)胞IL-2﹑IL-6﹑IL-10﹑TNF-α以及IFN-g等炎性因子差異表達(dá)。實驗結(jié)果顯示：冬凌草甲素能有效的不同程度下調(diào)Sgc-7901細(xì)胞IL-6分泌。用66.88μm濃度的冬凌草甲素作用于Sgc-7901細(xì)胞12h，24h和36h后，對照組，冬凌草甲素實驗組（12h組﹑24h組﹑36h組）的IL-6分別為（1.93±0.21）pg/ml﹑（1.4±0.1）pg/ml﹑（1.33±0.29）pg/ml﹑（1.23±0.21）pg/ml。與對照組比較，冬凌草甲素實驗組IL-6的表達(dá)明顯下降（P＜0.05）。IL-2﹑IL-10﹑TNF-α以及IFN-g等炎性因子差異表達(dá)不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 冬凌草甲素對Sgc-7901細(xì)胞OD值的影響

圖2 冬凌草甲素對Sgc-7901細(xì)胞抑制率的影響（%）

3 討論

冬凌草，味苦甘，性微寒，具有清熱解毒﹑消炎止痛﹑抗腫瘤之功效［2-3］。冬凌草甲素是從冬凌草中提取的二萜類化合物，為抗腫瘤的主要活性成分。對于冬凌草甲素，有研究報道：冬凌草甲素對胃癌有一定的療效［4］。冬凌草甲素能刺激p21waf1蛋白高表達(dá)，擾亂細(xì)胞進(jìn)程而抑制細(xì)胞增殖。李娜等［5］發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素在體外可顯著抑制人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的增殖，且誘導(dǎo)其凋亡作用，由此可以初步推測冬凌草甲素可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖。

胃癌在臨床上是主要常見的惡性消化道腫瘤之一，據(jù)中國腫瘤流行病學(xué)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，胃癌發(fā)病率高居前二位，且發(fā)病率呈上升趨勢，給人類的生存和發(fā)展帶來了巨大威脅。目前常用的治療方法有藥物治療﹑手術(shù)治療﹑放射治療，但這種方式給患者的后期生活質(zhì)量帶來了無窮的痛苦。因此，尋一種新的治療手段或者探究一種有用的抗消化道腫瘤新藥是目前的重點。

胃癌的發(fā)病機(jī)制目前仍不明確，其發(fā)生﹑發(fā)展﹑浸潤以及轉(zhuǎn)移是一個多方因素相互影響的復(fù)雜過程，具有“慢性炎癥”的表現(xiàn)，而炎癥因子在胃癌的生成過程中起到至關(guān)重要的作用。通過上述實驗發(fā)現(xiàn)，用66.88μm濃度的冬凌草甲素作用于Sgc-7901細(xì)胞12h﹑24h和36h后，對照組和冬凌草甲素實驗組（12h組﹑24h組﹑36h組）的IL-6分別為（1.93±0.21）pg/ml﹑（1.4±0.1）pg/ml﹑（1.33±0.29）pg/ml﹑（1.23±0.21）pg/ml。與對照組比較，冬凌草甲素實驗組IL-6的表達(dá)明顯下降（P＜0.05）。研究表明：IL-6是一種前炎因子，可以通過體外腫瘤細(xì)胞自體分泌，其與IL-1﹑腫瘤壞死因子一起誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的急性期，啟動免疫應(yīng)答。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，與IL-6相關(guān)的腫瘤血清中IL-6水平增高以及受體表達(dá)異常，因此，IL-6及其受體的平衡失調(diào)常會影響整個機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，最終導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂，誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。液相芯片分析系統(tǒng)檢測，統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，IL-2﹑IL-10﹑TNF-α以及IFN-g等炎性因子差異表達(dá)不明顯（P＞0.05），考慮本實驗只針對體外無菌的人胃癌Sgc-7901細(xì)胞培養(yǎng)，無機(jī)體免疫系統(tǒng)參與，因此難以檢測到IL-2﹑IL-10﹑TNF-α以及IFN-g等炎性因子。研究發(fā)現(xiàn)，IL-4和IL-10等抗炎因子通過抑制IL-6等促炎因子的分泌，改變腫瘤的微環(huán)境，造成腫瘤細(xì)胞的增殖［6］?？寡滓蜃雍痛傺滓蜃酉嗷ヒ种譬p相互作用，當(dāng)兩者失調(diào)時，腫瘤細(xì)胞生存的微環(huán)境改變，造成腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，在一些無胃炎等發(fā)病基礎(chǔ)的原發(fā)性消化道腫瘤中發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中伴有大量炎性細(xì)胞的浸潤以及炎性因子表達(dá)的上升。因此，在體外培養(yǎng)的Sgc-7901細(xì)胞中，雖然L-2﹑IL-10﹑TNF-α以及IFN-g等炎性因子未明確表達(dá)。炎癥與腫瘤之間的相關(guān)作用機(jī)制復(fù)雜，作者將通過動物實驗進(jìn)一步探討冬凌草甲素抗胃癌的作用機(jī)制，為中藥抗腫瘤提供了新的思路和新的方向。

［1］ 陳萬青,鄭榮壽,曾紅梅,等．2011年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析．中國腫瘤,2015,24(1):1-10．

［2］ 劉淑云,譚英姿,范明松,等．冬凌草甲素研究進(jìn)展．中國當(dāng)代醫(yī)藥,2012,19(13):17-18．

［3］ 高世勇,王瓏．冬凌草的化學(xué)和藥理作用研究．哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2014,30(1):1-6．

［4］ 劉家云,魏敏,顧琴龍．冬凌草甲素抗腫瘤的研究進(jìn)展．中國新藥與臨床雜志,2010,29(2):81-84．

［5］ 李娜,金平,張春潔．冬凌草甲素誘導(dǎo)人卵巢癌 SKOV3細(xì)胞凋亡及其機(jī)制．腫瘤防治研究,2013,40(1):36-41．

［6］ Noguchi S,Hattori M,Sugiyama H,et al．Lactobacillus plantarum NRIC1832 enhances IL-10 production from CD4+T cells in vitro．Biosci Biochem,2012,76(10):1925-1931．

Objective To observe the effect of the expression of infl ammatory cytokines in Sgc-7901 after adding the oridonin and to evaluate oridonin on the changes of infl ammatory cytokines in Sgc-7901 and the effects of oridonin on anti-tumor mechanism through SGC-7901 cells cultured in vitro by sterile，then provide a new theoretical basis for the clinical treatment of gastric cancer. Methods Sgc-7901 cells fostered in sterile culture，through CCK-8 experiment，the optimal concentration to inhibit the proliferation of Sgc-7901 cells were screened to oridonin after 24h. Liquid chip analysis system for determination of oridonin on the effect of IL-2，IL-4，IL-6，IL-10 and TNF-α in Sgc-7901 cells. Results CCK-8 experiment results showed that oridonin could inhibit the proliferation of Sgc-7901 cells in a dose-dependent manner，and the IC50 was 66.88μm. The results of Liquid chip analysis system that to test the differential expression of IL-2，IL-4，IL-6，IL-10 and TNF-α after oridonin treated Sgc-7901 cells before and after showed that partial infl ammatory factors expression down regulated，the oridonin group with the blank control group were compared. Conclusion Oridonin can inhibit the proliferation of Sgc-7901 cells，and reduce the secretion of IL-6 and other infl ammatory factors in Sgc-7901 cells，so as to achieve anti-tumor effect.

Oridonin Sgc-7901 Infl ammatory cytokines

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2016ZB038）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)校級科研基金項目（2015ZY10）

310000 浙江省中醫(yī)院

*通信作者