張?jiān)螺x 潘嬙微 呂杰強(qiáng)? 鄭園園 童郁

人乳頭瘤病毒E6/E7mRNA檢測(cè)在不典型鱗狀細(xì)胞患者中的臨床應(yīng)用

張?jiān)螺x 潘嬙微 呂杰強(qiáng)? 鄭園園 童郁

目的 探討人乳頭瘤病毒（HPV）E6/E7mRNA檢測(cè)在無明確診斷意義的不典型鱗狀細(xì)胞（ASC-US）患者中的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 對(duì)320例ASC-US患者進(jìn)行HPV E6/E7mRNA和高危型HPV（HR-HPV）DNA檢測(cè)，結(jié)合病理學(xué)診斷資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 CINⅡ+級(jí)和CINⅢ+級(jí)的HPV E6/E7mRNA陽性率分別高于CINⅡ-級(jí)和CINⅢ-級(jí)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；不同等級(jí)宮頸病變的HPV E6/ E7mRNA拷貝數(shù)不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），且宮頸病變級(jí)別與mRNA拷貝數(shù)之間呈正相關(guān)。HPV E6/E7mRNA與HR-HPV DNA檢測(cè)CINⅡ+級(jí)和CINⅢ+級(jí)的靈敏度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩者特異度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。結(jié)論 HPV E6/E7mRNA檢測(cè)作為ASC-US的分流指標(biāo)更確切有效，是目前ASC-US患者是否陰道鏡轉(zhuǎn)診的較佳分流策略。

E6/E7mRNA 人乳頭瘤病毒 無明確診斷意義的不典型鱗狀細(xì)胞

宮頸癌是女性最常見的婦科惡性腫瘤之一，HPV感染是宮頸癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素。99.7%的宮頸癌細(xì)胞中可以檢測(cè)到高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）［1］。如何及早篩查和預(yù)防宮頸癌尤為重要。液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查（TCT）是一種較先進(jìn)的宮頸細(xì)胞學(xué)檢查技術(shù)，其中無明確診斷意義的不典型鱗狀細(xì)胞（ASC-US）是最常見的宮頸細(xì)胞學(xué)異常結(jié)果［2］，同時(shí)存在宮頸癌前病變，甚至宮頸癌的可能。如何對(duì)ASC-US患者進(jìn)行分流處理一直是宮頸病變?cè)\治中存在的難點(diǎn)和爭(zhēng)論點(diǎn)。本研究對(duì)ASC-US患者同時(shí)檢測(cè)HPV E6/E7mRNA和HR-HPV DNA，并行陰道鏡檢查和宮頸活檢，以探討HPV E6/E7mRNA檢測(cè)在ASC-US患者中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2013年10月至2015年4月在溫州市人民醫(yī)院婦科門診就診，TCT結(jié)果為ASC-US的患者320例，年齡21～65歲，中位年齡37歲，均無宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）史﹑盆腔放射治療史﹑子宮切除史，排除妊娠，取材前3d內(nèi)無性生活史。

1.2 方法 （1）TCT檢測(cè)：宮頸刷插入宮頸外口旋轉(zhuǎn)5周，采集宮頸表面及宮頸管內(nèi)脫落細(xì)胞，將細(xì)胞洗脫在新柏氏膜式液基液中，用TCT專用制片機(jī)制成薄層涂片，經(jīng)巴氏染色后鏡檢。顯微鏡下觀察分析脫落細(xì)胞形態(tài)，按照2001年TBS系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)診斷為ASCUS。將剩余標(biāo)本置于8℃～25℃保存。（2）HPVE6/ E7mRNA檢測(cè)：采用TCT剩余標(biāo)本，Quantivirus法支鏈DNA雜交捕獲原理定量檢測(cè)14種HR-HPV（16﹑18﹑31﹑33﹑35﹑39﹑45﹑51﹑52﹑56﹑58﹑59﹑66和68）E6/E7mRNA的表達(dá)，試劑盒購自河南中美合資科蒂亞生物技術(shù)有限公司，結(jié)果經(jīng)電腦軟件換算為拷貝數(shù)，以拷貝數(shù)≥1copy/ml為陽性。（3）HPV DNA檢測(cè)：采用DNA導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)，使用HPV分型基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)（上海凱普生物化學(xué)有限公司），檢測(cè)21種HPV亞型，其中13種高危亞型（16﹑18﹑31﹑33﹑35﹑39﹑45﹑51﹑52﹑56﹑58﹑59和68），1種HR-HPV陽性即為陽性。（4）陰道鏡檢查及宮頸活檢：由本院陰道鏡?？漆t(yī)師對(duì)本組患者行陰道鏡檢查，并對(duì)可疑病灶進(jìn)行定位活檢，未見明顯異常者行宮頸3﹑6﹑9﹑12點(diǎn)常規(guī)活檢和宮頸管搔刮。根據(jù)病理檢查結(jié)果分為正常/炎癥﹑CINⅠ級(jí)﹑CINⅡ級(jí)﹑CINⅢ級(jí)﹑宮頸癌。以病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，以CINⅡ+級(jí)（包括CINⅡ級(jí)﹑CINⅢ級(jí)和宮頸癌）和CINⅢ+級(jí)（包括CINⅢ級(jí)和宮頸癌）為研究終點(diǎn)，分別以CINⅡ-級(jí)（包括正常/炎癥和CINⅠ級(jí)）和CINⅢ-級(jí)（包括正常/炎癥﹑CINⅠ級(jí)和CINⅡ級(jí)）為對(duì)照組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；非正態(tài)分布以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV E6/E7mRNA﹑HR-HPV DNA檢測(cè)結(jié)果與病理診斷比較 由表1可見HPV E6/E7mRNA總陽性率低于HR-HPV DNA的陽性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。各組間HPV E6/E7mRNA陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。CINⅡ+級(jí)和CINⅢ+級(jí)的HPV E6/E7 mRNA陽性率分別高于CINⅡ-級(jí)和CINⅢ-級(jí)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.001）；HPV E6/E7mRNA和HR-HPV DNA兩種方法對(duì)CINⅡ+級(jí)檢出率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 病理診斷及HPV E6/E7mRNA、HR-HPV DNA檢測(cè)結(jié)果［n（%）］

2.2 不同級(jí)別宮頸病變的HPV E6/E7mRNA拷貝數(shù)結(jié)果 HPV E6/E7mRNA拷貝數(shù)呈非正態(tài)分布，故用中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示。對(duì)各組HPV E6/E7mRNA拷貝數(shù)進(jìn)行分析（見表2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。將宮頸組織病理結(jié)果與HPV E6/E7 mRNA水平進(jìn)行Spearman等級(jí)相關(guān)分析，兩者相關(guān)系數(shù)r=0.523（P＜0.001），提示HPV E6/E7 mRNA水平與組織學(xué)病變程度之間存在正相關(guān)性。

表2 不同級(jí)別宮頸病變的HPV E6/E7mRNA拷貝數(shù)比較

2.3 HPV E6/E7mRNA和HR-HPV DNA檢測(cè)對(duì)CINⅡ+級(jí)和CINⅢ+級(jí)的診斷價(jià)值 兩種方法檢測(cè)CINⅡ+級(jí)和CINⅢ+級(jí)的靈敏度﹑陽性預(yù)測(cè)值（PPV）﹑陰性預(yù)測(cè)值（NPV）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但兩者特異度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

3 討論

ASC-US有潛在高級(jí)別CIN的風(fēng)險(xiǎn)，甚至是宮頸癌可能，故應(yīng)十分重視對(duì)ASC-US患者的管理。近年將HR-HPV DNA檢測(cè)用于ASC-US患者的分流已被普遍用于臨床。但有研究指出＞80%的婦女一生中會(huì)感染HPV，而＞90%的感染會(huì)在8～24個(gè)月內(nèi)會(huì)被自身的免疫系統(tǒng)清除，僅＜10%的HR-HPV會(huì)持續(xù)感染進(jìn)一步發(fā)展為高級(jí)別CIN甚至宮頸癌［3］。因?yàn)镠PV一旦感染，即可檢測(cè)到，故HR-HPV DNA檢測(cè)假陽性率高，將其作為ASC-US的分流指標(biāo)在臨床上存在較多爭(zhēng)議，在歐洲仍未被推薦為首選的宮頸癌篩查方法［4］。研究已證實(shí)，HPVE6/E7蛋白持續(xù)性高表達(dá)是HPV感染導(dǎo)致宮頸發(fā)生癌變的必要條件。在HPV病毒整合至宿主細(xì)胞后，HPV病毒過度表達(dá)E6/E7，同時(shí)E6/E7蛋白通過抑制Rb﹑P53等抑癌基因功能﹑干擾細(xì)胞周期調(diào)控﹑免疫逃逸等機(jī)制最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生癌變［5］。HPVE6/ E7mRNA更能準(zhǔn)確地反映HPV病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制轉(zhuǎn)錄的活動(dòng)狀態(tài)，對(duì)于預(yù)測(cè)宮頸病變惡性轉(zhuǎn)化和宮頸癌早期篩查具有重要臨床意義。有研究建議采用HPV E6/E7mRNA檢測(cè)作為ASC-US的分流指標(biāo)［6］。

有文獻(xiàn)報(bào)道HPVE6/E7mRNA水平與宮頸病變的嚴(yán)重程度相關(guān)。Ratnam等［7］研究發(fā)現(xiàn)隨著宮頸病變的加重，HPVE6/E7mRNA陽性率也隨之增加。張鳳芹等［8］研究發(fā)現(xiàn)CIN患者的HPV E6/E7mRNA拷貝值顯著高于無宮頸病變者的HPV E6/E7mRNA拷貝值。本研究發(fā)現(xiàn)，CINⅡ+級(jí)和CINⅢ+級(jí)的HPV E6/E7 mRNA陽性率高于CINⅡ-級(jí)和CINⅢ-級(jí)組，且不同等級(jí)宮頸病變的HPV E6/E7mRNA拷貝數(shù)不同，且宮頸病變級(jí)別與mRNA拷貝數(shù)之間呈正相關(guān)。表明在ASC-US患者中，HPV E6/E7mRNA表達(dá)水平增加，預(yù)示著宮頸病變進(jìn)展可能性大。而HPV E6/E7 mRNA和HR-HPVDNA檢測(cè)相比，對(duì)CINⅡ+級(jí)的檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在兩種檢測(cè)結(jié)果均陽性的情況下，HPV E6/E7mRNA拷貝水平在宮頸病變嚴(yán)重程度的評(píng)估和處理方法的指導(dǎo)上具有更重要的意義。

本研究還發(fā)現(xiàn)兩種HPV檢測(cè)方法具有相似的靈敏度﹑PPV和NPV，但HPV E6/E7mRNA檢測(cè)的特異度明顯提高。Dockter J等［9］以CINⅢ+級(jí)作為研究終點(diǎn)，分析與HR-HPV DNA檢測(cè)相比，HPV E6/E7mRNA檢測(cè)的靈敏度﹑PPV和NPV均相似，但特異度明顯升高。作為新一代的生物標(biāo)記物，HPV E6/E7mRNA檢測(cè)得到的臨床靈敏度和預(yù)測(cè)值與HR-HPV DNA檢測(cè)相似，而在臨床特異度方面，比HR-HPV DNA檢測(cè)有了顯著提高。相比HR-HPV DNA檢測(cè)，HPV E6/E7mRNA檢測(cè)對(duì)高級(jí)別CIN的診斷價(jià)值更高。因此，若將HPVE6/E7mRNA檢測(cè)用于ASC-US的分流，可比HR-HPV DNA檢測(cè)減少陰道鏡轉(zhuǎn)診率的同時(shí)并不降低靈敏度即高級(jí)別宮頸病變的檢出率，可以更精確地選擇高危人群，減少由過度治療造成患者一系列的并發(fā)癥，并能減少醫(yī)療資源的浪費(fèi)。

［1］ Tommasino M．The human papillomavirus family and its role in carcinogenesis．Semin Cancer Biol,2014,26(1):13-21．

［2］ Eversole GM,Moriarty AT,Schwartz MR,et al．Practices of participants in the college of American pathologists interlaboratory comparison program in cervicovaginal cytology,2006．Arch Pathol Lab Med,2010,134(3):331-335．

［3］ Kjaer SK, Breugelmans G, Munk C, et al． Population based prevalence, type and age-specific distribution of HPV in women before introduction of an HPV-vaccination program in Denmark．Int J Cancer, 2008,123(8):1864-1870．

［4］ Lie AK,Kristensen G．Human papillomavirus e6/e7 mRNA testing as a predictive marker for cervical cancinoma．Expert Rev Mol Diagn,2008,8(4):405-415．

［5］ McCloskey R,Menges C,Friedman A,et al．Human papillomavirus type 16 E6/E7 upregulation of nucleophosmin is important for proliferation and inhibition of differentiation．J Virol,2010, 84(10): 5131-5139．

［6］ Sorbye SW,Fismen S,Gutteburg J,et al．HPV mRNA is more specific than HPV DNA in triage of women with minor cervical lesions．PLoS One,2014,9(11):e112934．

［7］ Ratnam S,Coutlee F,Fontaine D,et al．Clinical performance of the pretect hpv-proofer E6/E7 mRNA assay in comparison with that of Hybrid Capture 2 test for identification of women at risk of cervical cancer．J Clin Microbi01,2010,48(8):2779-2785．

［8］ 張鳳芹,張清泉,侯素平,等．應(yīng)用支鏈DNA技術(shù)檢測(cè)宮頸高危人乳頭瘤病毒E6/E7 mRNA．國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2013,34(6):705-706．

［9］ Dockter J,Schroder A,Hill C,et al．Clinical performance of the APTIMA HPV Assay for the detection of high-risk HPV and high-grade cervical lesions．J Clin Virol,2009,45(1):55-61．

Objective To investigate the clinical value of human papillomavirus E6/E7mRNA test in patients with atypical squamous cell of undetermined signifi cance（ASC-US）. Methods Three hundred and twenty patients with ASC-US had HPVE6/E7 mRNA and high-risk（HR）HPV DNA testing.The testing results combined with pathological diagnosis were analyzed. Results The positive rate of HPV E6/E7 mRNA for cervical intraepithelial neoplasia（CIN）II+ and CINIII+ were higher than that of CINII- and CINIII-，and the difference was statistically signifi cant（P＜0.001）.HPV E6/E7mRNA copy number of different grades of cervical lesions was signifi cantly different（P＜0.001）.It was confi rmed that there was positive correlation between the level of cervical lesion and the copies of mRNA.There were no signifi cantly difference（P＞0.05）in sensitivity，positive predictive value，negative predictive value between HPV E6/E7 mRNA test and HR-HPV DNA test for CINII+ and CINIII+，but the specifi city showed statistically signifi cantly difference（P＜0.001）. Conclusion HPVE6/E7mRNA test is more effective in triage of patients with ASC-US，and is currently a better triage test for patients with ASC-US whether or not colposcopy referral.

E6/E7mRNA Human papilloma virus Atypical squamous cell of Undetermined signifi cance

325000 浙江省溫州市人民醫(yī)院（張?jiān)螺x 潘嬙微鄭園園 童郁）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院（呂杰強(qiáng)）

*通信作者