馬國(guó)祥 丁茜萍 鄧海華 楊振漢

黃芪多糖對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠的療效及其作用機(jī)制研究

馬國(guó)祥 丁茜萍 鄧海華 楊振漢

目的 探討黃芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)對(duì)大鼠阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)模型大鼠的療效及其作用機(jī)制。方法 將48只SPF大鼠隨機(jī)分成3組，每組各16只：對(duì)照組、模型組和治療組；模型組和APS治療組采用Aβ25-35(80 pmol/μL)雙側(cè)腦室注射大鼠誘導(dǎo)AD模型，模型制備成功后APS治療組給予APS(400 mg/kg)灌胃，1次/d，連續(xù)60 d；對(duì)照組和模型組給予等劑量生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)60 d；治療結(jié)束后采用水迷宮實(shí)驗(yàn)(MWM)評(píng)價(jià)各組大鼠定位航行能力和記憶能力；MWM實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死各組大鼠獲取海馬行常規(guī)HE染色觀察病理組織學(xué)變化，行Western-blot檢測(cè)海馬組織中淀粉樣蛋白(amyloid peptide protein，APP)、β-淀粉樣蛋白(amyloid peptide-β，Aβ)、磷酸化微管相關(guān)蛋白(Phosphorylation tau，p-tau)、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3beta，GSK3)和蛋白磷酸酯酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)等蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 與模型組相比，APS治療組可顯著改善大鼠的定位航行能力(P<0.01)與學(xué)習(xí)記憶能力(P<0.01)；HE染色表明APS治療組可修復(fù)Aβ25-35所致的大鼠海馬損傷；Western-blot表明與模型組相比，ASP治療組APP，Aβ，p-tau，GSK3β和BACE1的蛋白水平下調(diào)(P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.05，P<0.01)，PP2A 的蛋白水平上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 APS對(duì)Aβ25-35所致的AD具有保護(hù)作用。

黃芪多糖 阿爾茨海默病 作用機(jī)制

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是與年齡相關(guān)的多發(fā)于老年人群中的一種常見(jiàn)疾病，其以海馬依賴性學(xué)習(xí)和記憶障礙以及行為障礙為主要特點(diǎn)[1]。研究表明，海馬組織中淀粉樣蛋白(amyloid peptide protein，APP)、β-淀粉樣蛋白(amyloid peptide-β，Aβ)、磷酸化微管相關(guān)蛋白(Phosphorylation tau，p-tau)、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3beta，GSK3)和蛋白磷酸酯酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)等調(diào)控海馬神經(jīng)元的死亡，參與AD病情的發(fā)生發(fā)展[2]。因此，可調(diào)控上述蛋白在海馬組織中的表達(dá)被認(rèn)為是治療和緩解AD病情的重要因素之一。

黃芪(Milkvetch Root)是常用中藥之一，味甘，性溫，其藥用迄今已有2000多年的歷史，具有益氣固表、利水消腫等功效[3]。黃芪多糖(Astragalus Polysaccharides，APS)由中國(guó)的傳統(tǒng)草本藥物黃芪中抽提，是黃芪的主要活性成分，在降血糖、抗腫瘤、抗炎等方面發(fā)揮重要作用[4]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，APS 可對(duì)AD模型中海馬組織的超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[5]。本研究擬在此基礎(chǔ)上采用Aβ25-35(80 pmol/μL)雙側(cè)腦室注射復(fù)制AD模型并給予APS干預(yù)，通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)(MWM)評(píng)價(jià)各組大鼠定位航行能力和記憶能力，HE染色觀察海馬病理組織學(xué)變化，Western-blot檢測(cè)海馬組織中APP，Aβ，p-tau和GSK3β等相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，以評(píng)價(jià)ASP對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)AD模型的療效及其作用機(jī)制，為AD預(yù)防及其治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF大鼠48只(由南方科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，雌雄兼用，體重(260±20)g，批號(hào)為NFTU201608。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用遵循國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。Aβ25-35購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；APP，BACE 1和Aβ等一抗購(gòu)自Cell Signaling Technology 公司；蘇木精，伊紅染液購(gòu)自南京碧云天生物科技有限公司。其余國(guó)產(chǎn)試劑均為分析純。

1.2 動(dòng)物模型的制備與治療

參照文獻(xiàn)[6]，將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成3組：對(duì)照組16只、模型組16只、ASP治療(治療)組16只。APS治療組和模型組中大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉后將大鼠固定于立體定位儀上，選擇雙側(cè)海馬CA l區(qū)為注射靶區(qū)，于前囟向后3.0 mm、中線旁開(kāi)2.2 mm處、用牙科鉆鉆開(kāi)顱骨，腦表面垂直進(jìn)針2.8 mm，將Aβ25-35緩慢注入(1 μL/min)，留針10 min以保證溶液充分彌散，然后緩慢撤針，常規(guī)縫合，飼養(yǎng)1個(gè)月后APS治療組給予APS (400 mg/kg)灌胃，1天/d，連續(xù)60 d。對(duì)照組和模型組給予等劑量生理鹽水灌胃，1天/d，連續(xù)60 d。

1.3 行為學(xué)檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[7]，治療結(jié)束后采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)(MWM)評(píng)價(jià)各組大鼠定位航行能力和空間探查能力。儀器水深20 cm，水溫(25±1)℃，平臺(tái)放于第4象限，沒(méi)于水下1 cm，第1～4 d為訓(xùn)練時(shí)間，每次訓(xùn)練60 s；第5 d為測(cè)試時(shí)間，觀察并記錄大鼠到達(dá)平臺(tái)位置的逃避潛伏期(escapelatency)(s)和游泳路徑，以此來(lái)衡量大鼠的定位航行能力，反映大鼠學(xué)習(xí)獲得能力指標(biāo)；如果大鼠在60 s內(nèi)未能找到平臺(tái)，逃避潛伏期記為60 s；在第6 d時(shí)撤去平臺(tái)，檢測(cè)并記錄在60 s內(nèi)大鼠在第4象限所花的時(shí)間和進(jìn)入該象限的次數(shù)以衡量大鼠的空間探查能力，反映大鼠記憶能力。

1.4 組織病理學(xué)觀察

參照文獻(xiàn)[8]，行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后每組隨機(jī)處死8只大鼠，以空氣栓塞法處死，迅速獲取各組海馬組織并置于4%甲醛溶液中，石蠟包埋，切片，行常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織結(jié)構(gòu)。

1.5 相關(guān)蛋白表達(dá)水平

參照文獻(xiàn)[9]，行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后空氣栓塞處死各組剩余8只大鼠，獲取海馬組織于無(wú)菌EP管中，加入含1%PMSF的RIPA裂解液1 mL；將組織用超聲波破碎儀粉碎30 s(冰上操作)，冰上放置30 min，4 ℃ 12000 r/min離心20 min，提取上清液；然后用BCA法進(jìn)行蛋白水平測(cè)定，且進(jìn)行灌膠上樣SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)所需適時(shí)終止電泳；采用半干法轉(zhuǎn)膜，封閉，洗膜，按照對(duì)應(yīng)分子量切割后分別置于1∶400稀釋的APP，BACE 1和Aβ等一抗溶液中，4 ℃雜交過(guò)夜，第2 d用洗膜液漂洗后加入1∶1000稀釋的二抗，搖床上雜交1 h，然后取出用洗膜液沖洗，然后加ECL顯色劑進(jìn)行顯色檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 大鼠定位航行能力測(cè)試

模型組游泳軌跡紊亂無(wú)目的且沒(méi)有穿越平臺(tái)(圖1)，而對(duì)照組和ASP治療組大鼠游泳軌跡大部分圍繞第4象限(平臺(tái)區(qū))，并最終尋找到第4象限中的平臺(tái)(圖1)；與對(duì)照組比較，模型組大鼠潛伏期及游泳距離明顯增加(圖1)。此外，與模型組比較，APS治療組第5 d的逃避潛伏期有所降低(圖1)且大鼠第5 d的平均逃避延遲時(shí)間也有所下降(P<0.05)。

圖1 A為水迷宮實(shí)驗(yàn)航行測(cè)試第5d大鼠的熱紅外游泳軌跡；B為大鼠第5d的逃避潛伏期；C為大鼠第5d的平均逃避延遲時(shí)間 與模型組比較，☆P<0．05，★P<0．01

2.2 大鼠空間探查能力測(cè)試

第6 d撤去平臺(tái)后在60 s內(nèi)對(duì)照組大鼠在水迷宮中游行路徑主要分布在第4象限(原平臺(tái)區(qū))(圖2)且在第4象限中的游行距離以及穿越平臺(tái)區(qū)次數(shù)大于模型組和APS治療組。與模型組比較，APS治療組大鼠在第4象限中游行路徑頻率較高(圖2)，且其在第四象限中游行的距離，以及穿越平臺(tái)區(qū)次數(shù)大于模型組(P<0.01，P<0.05)。

2.3 組織病理學(xué)觀察

對(duì)照組海馬組織未見(jiàn)海馬神經(jīng)畸形(圖3)。模型組CA1區(qū)錐形細(xì)胞呈松散排列，神經(jīng)元顯著丟失(圖3)。與模型組比較，ASP治療組海馬組織病理學(xué)顯著改善(圖3)。

2.4 APP，BACE 1和Aβ蛋白表達(dá)水平

對(duì)照組APP，Aβ，p-tau，GSK3β和BACE1的蛋白水平表達(dá)較低，PP2A的蛋白水平表達(dá)較高。與對(duì)照組比較，模型組APP，Aβ，p-tau，GSK3β和BACE1的蛋白水平表達(dá)較高(P均<0.01)，PP2A的蛋白水平表達(dá)較低(P<0.01)。與模型組比較，ASP治療組APP，Aβ，p-tau，GSK3β和BACE1的蛋白水平下調(diào)(P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.05，P<0.01)，PP2A 的蛋白水平上調(diào)(P<0.05)。

3 討 論

本研究采用Aβ25-35(80 pmol/μL)雙側(cè)腦室注射復(fù)制AD模型并給予APS干預(yù)，通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)各組大鼠定位航行能力和記憶能力，HE染色觀察海馬病理組織學(xué)變化，Western-blot檢測(cè)海馬組織中APP，Aβ，p-tau和GSK3β等相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示APS可顯著改善模型大鼠的定位航行能力與學(xué)習(xí)記憶能力，可修復(fù)Aβ25-35所致的大鼠海馬損傷。此外，APS還可通過(guò)下調(diào)AD模型海馬組織APP，Aβ，p-tau，GSK3β和BACE1表達(dá)水平以及上調(diào)PP2A 的蛋白表達(dá)水平來(lái)緩解AD的進(jìn)程。以上結(jié)果顯示，APS對(duì)Aβ25-35所致的AD具有保護(hù)作用，可望成為一種預(yù)防和治療AD的新策略。

圖2 A為水迷宮空間測(cè)試第6d大鼠的熱紅外游泳軌跡；B為大鼠在水迷宮中游行距離分布；C為大鼠穿越平臺(tái)區(qū)次數(shù) 與模型組比較，☆P<0．05，★P<0．01

圖3 各組大鼠海馬組織HE染色(×200倍) A為對(duì)照組；B為模型組；C為ASP治療組

圖4 A為海馬組織APP，Aβ，p?tau，GSK3β，BACE1和PP2A蛋白的表達(dá)水平；B為海馬組織APP，Aβ，p?tau，GSK3β，BACE1和PP2A蛋白的相對(duì)表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，#P<0．05，△P<0．05；與模型組比較，?P<0．05，▲P<0．01

目前AD的治療主要包括膽堿能藥物、腦細(xì)胞代謝激活劑、腦血循環(huán)促進(jìn)劑、鈣離子拮抗劑、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子以及抗氧化劑等[10]。其中挖掘中藥中活性成分來(lái)緩解和治療AD已成為一種新的思路[11]。黃芪為傳統(tǒng)補(bǔ)氣類中藥，具有抗衰老，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，抗應(yīng)激和抗炎等廣泛的藥理作用[3]。其活性成分APS具有降血糖、抗腫瘤、抗炎和提高免疫力等功效[12]。本研究以APS為活性成分探討了其對(duì)AD的療效，結(jié)果表明APS灌胃治療AD大鼠具有一定的療效。

AD模型大鼠行為學(xué)評(píng)價(jià)主要采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，利用其獲取的熱紅外軌跡數(shù)據(jù)和時(shí)間對(duì)AD大鼠的定位航行能力和記憶能力進(jìn)行觀察，此法獲得數(shù)據(jù)確鑿準(zhǔn)確，可有效地對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析[13]。本研究在此基礎(chǔ)上觀察了APS對(duì)AD大鼠行為學(xué)的影響，結(jié)果顯示ASP治療組大鼠游泳軌跡大部分圍繞平臺(tái)進(jìn)行，并最終尋找到平臺(tái)且大鼠潛伏期及游泳距離明顯縮短。APS可改善大鼠的定位航行能力和記憶能力。

AD的發(fā)病機(jī)制尚不清晰，在AD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中Aβ是大腦皮質(zhì)老年斑的主要成分，由APP水解而來(lái)，由細(xì)胞分泌，在細(xì)胞基質(zhì)沉淀聚積后具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性作用，是引起阿爾茨海默病的重要物質(zhì)。Tau蛋白為含磷酸基蛋白，正常成熟腦中Tau蛋白分子含2～3個(gè)磷酸基，而AD患者腦的Tau蛋白則異常過(guò)度磷酸化，每分子Tau蛋白可含5～9個(gè)磷酸基，并喪失正常生物功能。此外，GSK3β促進(jìn)海馬神經(jīng)元的凋亡，而PP2A促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞增殖分化[14-16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ASP可下調(diào)APP，Aβ，p-tau和GSK3β等的蛋白表達(dá)水平，上調(diào)PP2A的蛋白表達(dá)水平。

本研究論證了APS對(duì)AD的療效及其作用機(jī)制，但是僅觀察了大鼠中Aβ25-35所致的AD模型，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將考察其在AD轉(zhuǎn)基因模型以及其他種屬動(dòng)物模型中的療效。

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(2016-10-11收稿)

Effect of astragalus polysaccharide and mechanism on Alzheimer 's disease rats

MaGuoxiang，DingQianping，DengHuahai，etal.

DepartmentofMedicine,FuyongPeople'sHospitaofShenzhenBaoanDistrict,Shenzhen518103

Objective To discuss the effect and mechanism of astragalus polysaccharide (APS) on Alzheimer's disease (AD) rats.Methods Forty-eight SPF rats were randomly divided into three groups named the control group, the model group and the treatment group. The model of AD was induced by injection of Aβ25-35 (80 pmol/μL) in APS group and model group. Rats in the APS group were treated with APS (400 mg/kg) orally once a day for 60 days, while the control group and the model group were given equal-dose saline by gavage once a day for 60 days. After treatment had been carried out, the ability of navigation and memory was evaluated by water maze test (MWM). And then, rats in all groups were sacrificed to obtain the hippocampus. HE staining was used to observe the histopathological changes, expression levels of APP，Aβ，p-tau，GSK3β，BACE1and PP2A protein in hippocampus were detected by western blot.Results Compared with the model group, APS could significantly improve the ability of learning and memory (P<0.01) and improve the ability of locating navigation (P<0.01). The consequences of HE staining showed that the rat hippocampus injury induced by Aβ25-35 could be repaired by APS treatment. Western blot analysis showed that the levels of APP, Aβ, p-tau, GSK3β and BACE1 were down-regulated, while the protein level of PP2A was up-regulated (P<0.05) in ASP group which compared with the model group (P<0.05,P<0.01,P<0.01).Conclusion APS had a protective effect on Aβ25-35-induced AD model, and it was supposed to be a strategy for the prevention and treatment of AD.

Astragalus polysaccharides Alzheimer’s disease Mechanism

518103 深圳市寶安區(qū)福永人民醫(yī)院內(nèi)科

R285.8

A

1007-0478(2017)04-0323-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.04.011