葉繁翔++譚佳麗++何錦艷+葉丹+徐紅貞+歐陽婧

摘要：干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）是一種具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)功能的細胞因子，主要由活化的T細胞和自然殺傷（Natural killer）細胞產生。干擾素因其重要的免疫調節(jié)功能而被廣泛地應用于疾病的診斷及治療過程。本研究主要對干擾素-γ誘生、作用機制、生物學活性、畜禽IFN-γ基因多態(tài)性與疾病的關系以及畜禽干擾素開發(fā)等的研究現狀進行綜述，以期為畜禽干擾素-γ的深入研究及其在畜禽生產中的應用奠定一定的理論基礎。

關鍵詞：干擾素-γ（interferon-γ）；基因多態(tài)性；抗病

中圖分類號：S852.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）16-3001-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.16.001

Research Progress of Interferon-γ in Livestock and Poultry

YE Fan-xiang， TAN Jia-li， HE Jin-yan， YE Dan， XU Hong-zhen， OU-YANG Jing

（College of Life Science of Jiangxi Science and Technology Normal University/Jiangxi Key Laboratory of Bioprocess，Nanchang 330013，China）

Abstract： Interferon-γ （IFN-γ） is a kind of cytokine which is mainly produced by activated T cells and natural killer cells. It has the functions of antiviral， anti-tumor and immune regulation. Interferon is widely used in the diagnosis and treatment of diseases due to its important immune regulatory function. This article mainly summarized interferon-γin following aspects including the production， mechanism of action， biological activity， the relationship between gene polymorphisms and diseases， and interferon development， in order to provide insight into further studies of poultry interferon-γand its application in poultry production.

Key words： interferon-γ； gene polymorphism； disease resistance

20世紀30年代，許多病毒學家在研究兩種病毒感染同一宿主細胞時，發(fā)現存在兩種病毒相互拮抗的現象，由此提出了病毒間相互干擾的概念。當Isaacs等[1]在1957年進行雞胚細胞流感病毒感染試驗時首次發(fā)現了一種能干擾和抑制病毒復制的細胞分泌物，故將其取名為“干擾素”。隨后的1970年又因發(fā)現γ干擾素具有更強的免疫調節(jié)功能將其命名為“免疫干擾素”。Lin等[2]研究發(fā)現，來自淋巴細胞培養(yǎng)上清中存在一種IFN，但抗原性不同于以往發(fā)現的IFN，遂又將其區(qū)別于IFN-α和IFN-β等Ⅰ型IFN命名為Ⅱ型IFN。1980年國際干擾素委員會定義了干擾素，認為干擾素是一類在同種細胞上具有抗病毒活性的蛋白質，其活性的發(fā)揮又受細胞基因組的調節(jié)和控制，涉及RNA和蛋白質的合成。IFN-γ主要由活化的T細胞和NK細胞產生，能夠激活巨噬細胞分泌抗炎癥因子、刺激MHCⅡ分子的表達，能夠促進B細胞分化、產生抗體及免疫球蛋白類別轉換[3，4]。自發(fā)現以來，干擾素的研究是細胞因子研究當中最為活躍、進展最快的領域之一，也是分子生物學、臨床醫(yī)學、免疫學、遺傳學和腫瘤學等相關領域的研究熱點[5]，同時畜禽干擾素-γ研究也備受關注。

1 干擾素-γ的誘生

干擾素是誘生蛋白，自然狀態(tài)下干擾素基因處于沉默狀態(tài)，只有經過刺激后才表達。故將能使干擾素表達的物質稱為“干擾素誘生劑”，常見的干擾素誘生劑包括以下四類：①病毒[6]、細菌等病原體；②細菌內外毒素、放線菌酮等分泌物質；③細菌脂多糖（LPS）、植物血凝素（PHA）、刀豆素（ConA）[7]等有絲分裂原；④人工合成的梯洛龍、聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸（PolyI：C）等藥物制劑[8]。

2 干擾素的作用機制

干擾素并不直接作用于效應分子的基因上進行調控，而是通過受體介導的信號轉導系統(tǒng)引發(fā)一系列的生化反應，最終使效應分子基因表達，即干擾素通過與細胞膜上的特異性受體結合，引發(fā)級聯(lián)性的信號放大過程，并最終將信號傳遞到細胞核內，對系列相關基因的表達進行調控[9]。

INF作用于細胞的經典JAK-STAT信號通路為，首先INF與細胞上的受體結合，與受體相聯(lián)的JAKs對STATS磷酸化，STATS中的特異酪氨酸殘基被JAKs磷酸化激活后，與磷酸化酪氨酸的Sre同源區(qū)2（SH2）相互作用形成同體或異體二聚體；然后STAT二聚體結合到基因的γ-激活序列（Gamma-activated sequence，GAS）上驅使臨近基因的表達；不同的GAS偏好不同的STAT二聚體建立特異性反應；此外，STATI-2異體二聚體和STAT1同體二聚體都可以結合到一種干擾素調節(jié)因子（interferon regulatory factor，IRF）家族成員p48上，組成一個三體結構物；STATI-2異體二聚體與p48結合而成的三體結構稱INF激活的基因因子3（IFN-stimulated gene factor3，ISGF3），它同一個結構上與GAS完全不同的IFN激活的調節(jié)序列（IFN-Stimulated regulatory elements，ISREs）結合[10-12]。endprint

繼JAK-STAT信號通路被發(fā)現介導干擾素γ引發(fā)的各種細胞反應后，研究人員在此基礎上獲得了一些新的發(fā)現，原來除了STAT1依賴途徑外，還有不依賴STAT1途徑，且兩種途徑在IFN-γ介導的各種生物學反應達到平衡[13]。近年來有研究表明IFN-γ引發(fā)的信號通路除了JAK-STAT信號通路外，還有一些其他的物質，諸如MAP激酶、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3-K）、鈣離子/鈣調素依賴的蛋白激酶（CaMKII）和核轉錄因子kappa B（NF-κB）同樣參與了JAK-STAT信號通路，或者形成一些新的信號通路發(fā)揮作用[14，15]。

3 干擾素的生物學活性

Ⅰ型干擾素主要包括α型和β型，IFN-α及IFN-β共用同一類受體，對病毒感染進行免疫應答并產生免疫抗體蛋白，而Ⅱ型干擾素只包含一種，即IFN-γ，其作用與Ⅰ型干擾素不同，除產生一系列免疫應答反應外，還具有免疫系統(tǒng)調節(jié)的功能，其抗病毒活性不是殺滅病毒而是抑制病毒的活性。因其既對DNA病毒有抑制作用又對RNA病毒有抑制作用，故將其稱為“廣譜病毒抑制劑”。除此之外，IFN-γ還可以與細胞外基質相連的形式存在，通過旁鄰方式控制細胞的生長，進而起到抑制腫瘤生長的作用[16]。

3.1 抗病毒作用

抑制病毒的繁殖和生長是干擾素的基本功能之一，干擾素對高等生物的生存至關重要，因為它們?yōu)榭褂《镜那趾μ峁┝说谝坏婪谰€，比免疫反應要早幾小時至幾天的時間。干擾素受體缺損的小鼠對病毒的感染特別敏感，由此可看出干擾素抗病毒作用的重要性。干擾素抗病毒具有廣譜性，但對細胞抗病毒作用是間接的，而且是非特異性的。當干擾素與細胞表面的干擾素受體結合后，可誘導細胞內產生有酶活性的抗病毒蛋白（AVP）。已知的AVP至少有3種，蛋白激酶、磷酸二酯酶和2-5A合成酶，前2種能破壞細胞核糖體轉譯病毒蛋白質，后一種降解mRNA，有的AVP還能抑制轉錄酶的活性，阻止mRNA的形成，還有的能抑制病毒DNA和RNA的合成。因此可以說干擾素是通過AVP間接地抑制病毒復制而達到抗病毒作用的[17]。

3.2 干擾素抗腫瘤功能

研究表明MHC在腫瘤免疫方面起著重要作用，惡性腫瘤細胞常有MHC表達降低或丟失的現象。腫瘤細胞MHC抗原的丟失是腫瘤細胞逃避機體免疫監(jiān)視的原因之一。而近來研究發(fā)現INF能誘導細胞MHCⅠ、Ⅱ類抗原的表達，并能使MHC表達降低或丟失的惡性腫瘤細胞MHC表達增強，也可使MHC表達無降低或丟失的惡性腫瘤細胞的MHC表達進一步增強，從而增強腫瘤的免疫原性及T細胞對腫瘤細胞的識別能力，增強對腫瘤抗原的提呈作用，激活機體免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細胞[18]。

IFN調節(jié)MHC表達主要在轉錄水平上，其可加速MHC轉錄過程，并增強其表達。Michael等[19]通過檢測去除IFN作用后轉錄下降速率、穩(wěn)定狀態(tài)下的mRNA水平及細胞膜表面蛋白表達水平的高低。證明IFN-γ誘導MHCⅡ類抗原表達主要是作用于轉錄水平，而不是轉錄后水平。因Ⅰ型干擾素及Ⅱ型干擾素受體不同，且對MHC啟動子的要求也不同，因而IFN對MHC的誘導表達作用有強弱。

3.3 IFN-γ的免疫調節(jié)作用

Ⅰ型干擾素可增強主要組織相容性復合物Ⅰ（MHCⅠ）類分子表達，而強烈抑制MHCⅡ類分子表達，而Ⅱ型干擾素可促進MHCⅡ類分子表達，兩類干擾素的協(xié)同調節(jié)作用，使機體處于最佳免疫應答狀態(tài)。此外INF-γ的生成可促進Th0細胞向Th1細胞分化，而抑制Th2細胞的生成，由于Th1細胞和Th2細胞分別介導機體細胞免疫和體液免疫，因此 INF-γ可根據不同病原感染，與其他細胞因子（如IL-4等）共同作用對機體進行免疫干預，實現免疫系統(tǒng)防御功能[20]。

IFN-γ能刺激MHCⅠ及MHCⅡ表達上調，并通過抗原呈遞細胞（Antigen-presenting cells，APCs）提高抗原呈遞效率。除此之外，IFN-γ還參與淋巴細胞的成熟及分化過程。并且還能增強自然殺傷細胞的活力、調控B細胞分泌抗體[21]。

4 畜禽IFN-γ基因多態(tài)性與疾病發(fā)生的相關研究

有關人IFN-γ基因多態(tài)性方面的研究較多，而畜禽IFN-γ基因多態(tài)性與綜合抗病力報道較少，中國農大張勤等人采用全基因組關聯(lián)性分析方法（Genome-wide association study，GWAS）對豬種的細胞活性因子及免疫球蛋白G等免疫相關性狀做了一系列的分析，其中包括利用豬SNP 60K芯片發(fā)現了62 163個單核苷酸多態(tài)性位點（Single nucleotide polymorphism，SNP），接著采用單個位點回歸模型篩選出了46 079個單核苷酸多態(tài)性位點。最后找出了與免疫性狀相關的32個顯著性SNP位點，其中與IFN-γ水平顯著性相關的SNP 有6個，17個SNP位于之前報道過的免疫相關QTL（Quantative Trait Loci）區(qū)域，此項研究為探究影響豬免疫力性狀的因果突變位點奠定了基礎[22]。此外該課題組還發(fā)現IRF1（Interferon regular factor 1）及IRF2基因的SNP與血清中IFN-γ的表達量顯著相關，認為其是與豬免疫力性狀相關的候選基因[23，24]。

王大力等[25]采用PCR-SSCP技術和最小二乘法對豬IFN-γ基因多態(tài)性及部分免疫指標進行了關聯(lián)分析，其試驗結果顯示，豬IFN-γ基因的內含子1內T825C位點多態(tài)性對血清IgG含量有著顯著影響，且3種基因型間AB-型要高于AA-型，并達到了顯著水平，BB-型高于AA-型但差異不顯著；而T2370C位點對Ig M含量的影響CC-型顯著高于CD-型和DD-型；G5301A位點多態(tài)性對IgG含量的影響EE-型顯著高于EF-型。云南農業(yè)大學冀斌[26]對紅原雞IFN-γ啟動子多態(tài)性及MHC單倍型對禽流感免疫效果的影響進行了研究。研究表明該實驗所取的兩類基因均有豐富的多態(tài)性，其中IFN-γ-316A/G基因型與高致病性禽流感病毒HPAIV特異性抗體水平存在關聯(lián)，結果顯示A等位基因攜帶個體可能具有較強的HPAIV抗病力。endprint

5 畜禽干擾素-γ開發(fā)的相關研究

目前國內外對于畜禽干擾素開發(fā)應用研究主要是利用基因工程的技術手段構建表達載體，并導入受體細胞或者基因工程菌中以獲得其蛋白產物作疫苗佐劑用，下面主要以豬、雞、鴨干擾素研究為例進行闡述。

5.1 豬干擾素-γ開發(fā)

中國是世界養(yǎng)豬大國，在豬的養(yǎng)殖過程中易受流感病毒、口蹄疫病毒等的感染，使養(yǎng)殖業(yè)遭受巨大的損失，因此開發(fā)出高效的干擾素疫苗是當務之急。潘曉梅等[27，28]將豬IFN-γ基因克隆至原核表達載體pET-30a，構建PET-30a-pIFN-γ重組表達載體，導入寄主菌BL21（DE3）后用IPTG誘導表達，將表達后產物使用鎳親和層析柱純化，純化后的產物經SDS-PAGE及Western blot分析證實為高純度的重組pIFN-γ，經過一系列生物活性實驗發(fā)現重組pIFN-γ能有效抑制偽狂犬病毒和口蹄疫病毒的復制，并在高濃度時可誘導傳代細胞凋亡。趙偉鴿等[29，30]采用同樣的技術路線純化獲得了高純度重組IFN-γ蛋白。其研究為豬IFN-γ相關的基因工程生物制品的開發(fā)奠定了可靠的基礎。

雖然IFN-γ干擾素疫苗在對抗病毒方面取得了一定的效果，但畢竟其抗病毒能力不及IFN-α及IFN-β，故Kim等[31]將豬α干擾素及γ干擾素基因一起剪接到腺病毒DNA上形成能夠分泌α干擾素及γ干擾素的重組腺病毒，此法得到的重組腺病毒能快速、高效獲得干擾素蛋白以對抗手足口病病毒的感染。

5.2 禽類干擾素的開發(fā)

近年來禽流感蔓延世界各地，不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失，而且還威脅人的生命。因此研發(fā)高效的禽類干擾素是未來干擾素開發(fā)的發(fā)展方向?？v觀國內外禽類干擾素的開發(fā)，主要集中在雞和鴨的干擾素上，對重組鴨IFN-γ的生物活性分析顯示，其對機體的刺激作用遠遠低于重組雞IFN-γ的作用，僅為其活性的1/16，造成刺激作用差別如此之大的具體原因尚未知，推測可能與干擾素的結構和作用機制有關[32]。

目前重組干擾素-γ在雞和鴨中抗病毒研究效果很好，Sawant等[33]將雞IFN-γ基因及IL-4（interleukin-4）基因連接到pVIVO2載體上，然后通過RT-PCR體外檢測IFN-γ基因及IL-4（interleukin-4）基因的表達，將重組DNA導入到雞受體細胞內發(fā)現能產生對抗新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）的抗體。而且IFN-γ基因重組載體導入細胞后細胞免疫反應增強。

當前鴨IFN-γ的主要應用體現在對鴨乙型肝炎病毒和H11N9 AIV的防治上。鴨IFN-γ具有較好的治療鴨乙型肝炎治療效果，且鴨肝炎治療模型有著作為人類乙肝治療模型的開發(fā)潛力。Saade等[34]為提高基因疫苗的效力，將IL-2及IFN-γ兩種細胞活性因子基因分別連接到質粒上與DHBV疫苗混合后后將其注射到新生鴨體內，在第21周的時候發(fā)現注射了鴨IFN-γ的新生鴨乙肝病毒數明顯減少，并且注射了鴨IFN-γ及IL-2的鴨子分別有57%和25%個體已經檢測不到病毒DNA的存在了。研究者由此得出結論IFN-γ基因與DNA疫苗共同作用可以提高疫苗的效力，有助于對抗鴨乙型肝炎病毒。

研究人員通過克隆分析鴨IFN-γ基因序列，發(fā)現鴨與雞的IFN-γ核苷酸序列有著80%的同源性，而與其他哺乳動物的同源性只有21%～34%，這說明了禽類γ-干擾素基因有效編碼區(qū)是高度保守的，為今后制備通用型的禽類Ⅱ型干擾素提供了基礎條件[35]。

6 展望

目前國內外學者對畜禽干擾素-γ的各種機理及其在畜禽抗病中的應用開展了許多卓有成效的研究，但目前尚未真正揭示畜禽干擾素-γ的作用機理，畜禽干擾素-γ在畜禽生產中的應用也尚需時日。但隨著現代分子生物學技術的迅猛發(fā)展，尤其是現代組學、系統(tǒng)生物學等新型技術的使用，相信畜禽干擾素-γ的各種機理將得到很好地解析，同時結合現代免疫學技術的使用也必將使畜禽干擾素-γ造福于畜禽生產實踐。

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