薛祝林，劉 楠，張英俊

（中國農(nóng)業(yè)大學草地研究所，北京100193）

隨著我國規(guī)?；?、標準化奶牛產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，對高品質(zhì)飼草料的需求量將越來越大，且牧草品質(zhì)的優(yōu)劣與畜產(chǎn)品質(zhì)量的好壞密切相關。苜蓿（Medicagosativa）、燕 麥（Avena.sativa）、羊 草（Leymuschinensis）、黑麥草（Loliumspp.）等優(yōu)良牧草品質(zhì)的優(yōu)劣和消化率的高低能夠很大程度上影響到畜牧業(yè)的發(fā)展，如草產(chǎn)品的生產(chǎn)、流通及動物生產(chǎn)性能等。苜蓿作為世界上廣泛種植的牧草［1］，推廣、利用及評價其營養(yǎng)品質(zhì)與飼用價值就顯得尤為重要［2］。

由于傳統(tǒng)實驗室方法檢測牧草化學成分需要周期較長、耗費勞動力且成本高，尤其在大批量樣品測定和育種材料篩選時受到一定的限制［3］。近紅外反射光譜技術（near infrared reflectance spectroscopy，NIRS）以其分析速度快，不需要化學試劑，減少環(huán)境污染，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好，成本低，易于在線分析等特點被廣泛應用［4］。NIRS在國內(nèi)外廣泛用于農(nóng)牧產(chǎn)品和食品中的蛋白質(zhì)、水分、脂肪、淀粉等營養(yǎng)成分的快速檢測［5］，草地植被氮素含量估測［6］，粗飼料品質(zhì)檢測及分級指數(shù)的在線分析等［7］。以往的營養(yǎng)價值參數(shù)研究主要集中于局部地區(qū)采集樣品，建立定標模型，且預測指標主要為常規(guī)營養(yǎng)成分，纖維素、能量和消化率方面鮮有報道。本研究的意義在于尋求和建立適合中國苜蓿主產(chǎn)區(qū)干草草捆的近紅外預測模型，探討利用NIRS預測苜蓿草捆營養(yǎng)品質(zhì)、能量和消化率等方面的可行性，建立快速、高效的近紅外預測模型，促進畜牧業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 取樣設備

使用C60美國貝斯特取樣器，一個鋒利的，長度90cm，直徑約為1.90cm中空金屬裝置，取樣器手柄底端附帶可充電池。

1.2 材料來源

分別于黑龍江、內(nèi)蒙古、甘肅、寧夏、河北、山東等苜蓿主產(chǎn)區(qū)共6省份23個采樣點，采集不同品種、茬次、生育期、管理水平的苜蓿干草草捆樣品，共采集14個苜蓿品種229份干草樣品。

1.3 苜蓿干草草捆取樣方法

取樣原則：取樣時應嚴格按照取樣計劃，遵循取樣操作規(guī)程及取樣的代表性和隨機性原則，多點取樣。取樣器頂端的切割面與取樣器的軸成90度，于草捆兩端扎口線之間取樣，避開草捆邊緣15cm以上，垂直鉆入草捆中40cm深度鉆取樣品，選取20捆以上，每捆一芯，采20芯代表一批干草；對于大批次的干草（100～200t）或者具有高差異性的干草，抽取35芯［8］。取樣結束后將混合的20個取芯樣品，放在密閉性能良好的聚乙烯塑料袋中，在低溫、避光、隔熱條件下保存。

1.4 化學成分測定方法

粗蛋白（CP）采用凱氏定氮法GB/T6432-94；粗脂肪（EE）采用索氏抽提法 GB/T 6433-94；粗灰分（Ash）按照GB/T6438-92方法；中性洗滌纖維（NDF）參照GB/T20806-2006方法；酸性洗滌纖維（ADF）按照NY/T1459-2007；酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）按 GB/T20805-2006；鈣（Ca）采用高錳酸鉀滴定 法（GB/T6436-2002）；磷（P）采用分光光度法（GB/T6437-2002）。每個試樣取兩個平行樣測定，取平均值。根據(jù)苜蓿干草捆樣品的CP，ADF，NDF值，計算各樣品的代謝能（Metabolizable Energy，ME），DMI［9］，DDM，RFV［10］值。各值預測模型如下：

1.5 消化率的測定

選用5頭日糧一致且裝有永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛，作為瘤胃液供體動物。瘤胃液于晨飼前1h內(nèi)采集，經(jīng)4層紗布過濾后等體積混勻，置于39℃恒溫水浴鍋中備用。方法參照龐德公等［11］，使用移液器向各瓶中加入50mL pH 6.85的緩沖液［12］，預熱至39℃，之后向發(fā)酵瓶中接入瘤胃液25 mL，通入氮氣3～5s以驅(qū)除空氣后，立即蓋上膠塞并旋緊瓶蓋進行發(fā)酵，所有發(fā)酵瓶在恒溫生化培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48h后，使用200目尼龍袋收集殘渣，測定苜蓿DM 消化率（IVDMD）、NDF消化率（NDFD）、ADF消化率（ADFD）。

1.6 近紅外預測模型的建立

1.6.1 主要儀器與軟件 使用FOSS公司的NIR System5000近紅外光譜分析儀。工作參數(shù)：波長范圍，1100～2500nm；波長間隔2nm，每個樣品重復裝樣及掃樣3次，取平均值，并轉(zhuǎn)化為log1/R形式記錄光譜數(shù)據(jù)。定標軟件為WinISIⅢ；工作條件：室溫25℃穩(wěn)定。

1.6.2 模型的建立與驗證 將樣品均按3∶1隨機分為定標集和驗證集［13］。使用 WinISIⅢ軟件，采用改進的偏最小二乘法（MPLS），結合散射處理、導數(shù)、平滑等不同的光譜預處理和數(shù)學處理方法，用定標集樣品建立模型。建模時用全局距離（GH）、“X”和“T”檢驗對光譜異常值進行剔除；當GH≥10，X≥10和T＞2.5時，則被認為是光譜值超常樣品，剔除。模型內(nèi)部采用交叉驗證，防止過擬合現(xiàn)象。根據(jù)定標標準偏差（SEC）、交叉驗證決定系數(shù)（1-VR）、交叉驗證標準誤差（SECV）、預測標準誤差（SEP）等指標評價，確定最優(yōu)模型［14］。驗證集樣品對最優(yōu)模型進行外部驗證，評價其外部預測能力［15］。最后，用交叉驗證相對分析誤差RPDCV和外部驗證相對分析誤差RPDP對模型進一步評價［16］：RPDCV 和 RPDP大于3，說明定標效果良好，建立的模型可以用于實際檢測；2.5≤RPD＜3，表示模型滿足以篩選牧草品質(zhì)為目的粗略分析；RPD＜2.5，說明該模型的預測精度有待進一步提高。

2 結果與分析

2.1 紫花苜蓿營養(yǎng)成分化學分析結果

苜蓿定標集、驗證集的常規(guī)營養(yǎng)成分分析結果如表1所示。以絕干物質(zhì)為基礎，定標集苜蓿的CP，NDF，ADF，DM，Ash，EE，Ca，P含量的大小范圍分別為13.72%～22.23%，29.05%～61.89%，23.06%～50.37%，90.77%～93.91%，6.95%～17.80%，0.63%～2.67%，0.74%～3.10及0.10%～0.28%，平均含量分別為17.41%，47.68%，39.15%，92.16%，10.72%，1.46%，1.66%，0.20%。標準差分別為2.20%，6.85%，5.42%，0.57%，2.07%，0.41%，0.46%，0.048%，其 中NDF的標準差最大，達到6.85%，ADF標準差次之為5.42%，其次為CP標準差（2.20%），這說明牧草樣品的NDF，ADF，CP在很大程度上受物候期，品種和管理水平的影響。驗證集所有樣品的CP，NDF，ADF，Ash，EE，Ca，P含量的大小范圍均介于定標集之間。

表1 定標集和驗證集樣品成分化學分析結果Table 1 Chemical analyzing results of calibration and validation samples

由表2可知，ME含量的標準差最小，定標集和驗證集分別僅為0.32%和0.40%。RFV的偏差最大，定標集和驗證集分別可達28.25%和27.65%，定標集和驗證集的大小范圍分別為79.37%～227.11%和83.91%～210.38%，校正集和驗證集中最小值、平均值、最大值和標準差都比較接近，樣品間變異幅度較大，很大程度上可以覆蓋可能出現(xiàn)的RFV變化范圍，樣品具有較強的代表性。

表2 纖維素、消化率和能量分析數(shù)據(jù)Table 2 Chemical analyzing results of cellulose，digestibility and ME

2.2 紫花苜蓿營養(yǎng)成分模型的建立與評價

不同化學成分相關的含氫官能團類型或含量不同，光譜吸收就會有差異，建模的光譜處理方法和參數(shù)設置也就不同［17］。本試驗利用 WinISIⅢ定標軟件，采用改進的MPLS，結合不同光譜處理和數(shù)學參數(shù)設置，對定標集樣品建模，觀察統(tǒng)計數(shù)據(jù)列SECV和1-VR值的高低，找出SECV值最低，1-VR值最高的模型，即為篩選出的最佳模型，建立的模型效果衡量指標采用RPDCV。由表3結果可知，RFV，NDF的RPDCV值最高分別為4.54和4.34，CP和ADF的RPDCV值均高于3，說明RFV，NDF，ADF和CP的模型能用于實際含量的分析。此外，Hemicellulose和IVDMD的RPDCV值介于2.5～3之間，說明兩者的模型能夠用于粗略分析，需要對定標集樣品進一步擴充和完善以提高預測的準確度。反之，其他指標的RPDCV值均低于2.5，預測效果較差。

表3 化學成分模型參數(shù)Table 3 Results of spectrum treatment parameters by MPLS models

2.3 模型的外部驗證

校正模型建立后，采用外部驗證的方法用驗證集樣品對模型的預測效果進行驗證，通過RSQ，SEP，RPDP評價模型實際預測效果，進一步檢驗其優(yōu)劣。外部驗證結果表明，預測值與牧草RFV化學值的預測決定系數(shù)最高達0.935，其次是NDF預測決定系數(shù)為0.932，CP為0.918，此外ADF，Hemicellulose，IVDMD的預測決定系數(shù)范圍介于0.79～0.87之間；RPDP值與預測決定系數(shù)呈相似趨勢，說明預測模型的預測準確性較高，可用近紅外光譜技術預測苜蓿中RFV，NDF，ADF和CP的含量。NDFD和ADFD的預測相關系數(shù)最低，預測模型對這些指標的預測效果較差（表4）。

表4 驗證集樣品評價定標模型預測結果Table 4 Results of validation samples to evaluate MPLS models

3 討論

近紅外光譜技術作為一種間接測量方法，其預測模型的優(yōu)劣往往會受到諸多因素影響，其中包括儀器的性能和工作條件、定標樣品的數(shù)量和代表性、粉碎粒徑及均勻度、化學分析值的誤差大小以及光譜處理方法等都會對結果造成影響［18］。應用NIRS技術快速評價牧草的營養(yǎng)價值是配制動物日糧的關鍵［19］，苜蓿作為優(yōu)質(zhì)的粗飼料因其營養(yǎng)豐富，適口性好，家畜采食量高而在全世界被廣泛種植，國內(nèi)外眾多學者對此進行了大量研究，且取得了比較滿意的成果。

早在1976年Norris以苜蓿、高羊茅（Festuca arundinacea）和雀麥草（Cynodondactylon）為研究對象，預測了 CP，ADF，NDF，ADL，IVDMD 和DMI［20］。Gislum［21］等成功建立了多年生黑麥草和紫羊茅的CP含量預測模型，取得了很好的預測效果，預測值與化學值的相關系數(shù)在0.97～0.98之間。Dale應用NIRS建立苜蓿CF，NDF，ADF含量預測模型，相關系數(shù)介于0.93～0.95之間，且RPD均大于4.0［22］，這與本試驗結果相似，NDF和ADF的RPDP值分別為4.18和3.02。石丹［23］等首次建立了適合中國北方的羊草干草NDF和ADF預測模型，這對于羊草品質(zhì)的快速評價、準確篩選具有重要意義。陳鵬飛［24］等研究表明，青貯苜蓿 DM，ADF，NDF和CP均能準確預測，發(fā)酵品質(zhì)除乙酸和丁酸預測較差外，其他指標如銨態(tài)氮、pH和乳酸預測效果較好；聶志東［25］建立了紫花苜蓿干草和羊草常規(guī)養(yǎng)分含量的預測模型，均取得了良好的預測效果。許瑞軒［26］等研究了田間快速估測苜蓿鮮草品質(zhì)對于適時刈割的意義，結果表明DM，NDF，ADF模型可以進行粗略的定量分析，且滿足田間快速估測的要求。

本試驗采集了來源于不同產(chǎn)區(qū)、不同生育期及不同品種的苜蓿干草樣品，樣品分布范圍較廣，化學成分含量變異較大，具有較強的代表性，且所有的試驗樣品采取統(tǒng)一的干燥、粉碎和裝樣等前處理方式和化學分析方法，以消除系統(tǒng)誤差的影響。RFV，NDF，CP，ADF等的 RPDCV 值均高于3，說明NIRS技術能夠用于這些指標的實際含量分析。

牧草中的營養(yǎng)成分是評價其營養(yǎng)價值的主要指標，但含量的高低不能反映被家畜消化、代謝和利用的程度。研究牧草的營養(yǎng)物質(zhì)消化率，分析牧草被家畜利用狀況，能夠更深層次地判定牧草的實際營養(yǎng)價值［27］。胡超等應用NIRS技術，采用不同的回歸算法和光譜預處理方法，建立了菊苣IVDMD的預測模型，IVDMD預測值與化學值的相關系數(shù)達到0.95，結果表明NIRS預測菊苣IVDMD是可行的［28］。嚴旭等的結果與此類似，NIRS能夠?qū)厦Ⅺ淚VDMD進行準確分析，預測相關系數(shù)大于0.94，RPD為6.62［29］。本試驗中，IVDMD 的 RPDP 為2.51，能夠用于日常分析，但是NDFD和ADFD預測不成功，這主要是由于該試驗中苜蓿干草樣品是在體外發(fā)酵培養(yǎng)，瘤胃液活性受動物個體、年齡、身體狀況等方面的影響［30］，并對試驗誤差的放大效應所致。Brogna［31］等研究了定標集樣本數(shù)共316、驗證集299的意大利苜蓿干草的NDFD的預測模型，結果表明NIRS能夠?qū)σ獯罄俎DFD進行準確預測，進一步說明NIRS準確性的高低取決于足夠多的樣本數(shù)量且能夠代表樣本整體的差異性，涵蓋品種、年際間、生長條件、收獲時期、干燥方式等方面的差異性。

牧草可提供能值的高低也是評定其營養(yǎng)價值的主要依據(jù)［32］。牧草中營養(yǎng)物質(zhì)的組成及其消化率均可導致能值的不同［33］。Krachunov［34］利用 NIRS預測苜蓿中ME的含量，SEC和SEP分別僅為0.20和0.24。本試驗中ME的SEC和SEP分別為0.16和0.28，RPDCV和RPDP均低于2，預測效果較差，一方面可能由于ME最大值與最小值偏差較??；另一方面由于ME是通過ADF和CP化學值計算而得，計算結果很大程度上依賴于各自化學值的準確度，誤差受到不同指標測定步驟的增加而累積，導致ME誤差隨著計算公式進一步擴大［35］。

本研究中對DM，EE，Ash，Ca，P等的預測效果較差這一結論與李潔等研究結果一致［36］，除樣品間差異性較小、實驗室測定誤差較大等原因之外，樣品中這些成分在生物體內(nèi)的含量少，靈敏度低，礦物質(zhì)與近紅外光譜反映的有機物結構信息關系較差等均會導致預測效果較差［37］。

4 結論

本研究采集了我國苜蓿主要產(chǎn)區(qū)的干草草捆樣品，探討了利用NIRS技術建立苜蓿營養(yǎng)品質(zhì)及消化率的預測模型，其中 RFV，CP，NDF，ADF，IVDMD等預測結果良好，可用于苜蓿的快速評價和實際含量分析；但是礦物質(zhì)元素、脂肪等低靈敏度成分的含量，仍需沿用傳統(tǒng)檢測方法，或進一步對預測模型進行優(yōu)化。后續(xù)應擴大取樣范圍并加強年際間苜蓿樣品的收集，對模型進行持續(xù)的維護和更新；還需要篩選結果重現(xiàn)更佳的能量和消化率檢測方法，降低化學測定的誤差，從而實現(xiàn)苜蓿草產(chǎn)品品質(zhì)的精準預測與廣泛應用。