張 騫，李秀珍，張運(yùn)清，孫香麗，徐 艷，閆中正

（華東師范大學(xué)河口海岸學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200062）

1 引言

海三棱藨草（Scirpusmariqueter）是莎草科（Cyperaceae）藨草屬（Scirpus）的多年生草本植物，是由唐進(jìn)和汪發(fā)纘于1961年聯(lián)合發(fā)表的一個(gè)新雜交種，僅分布于我國(guó)東部沿海地區(qū)，主要集中在上海南匯、金山、奉賢、崇明三島、九段沙以及江蘇省啟東市的潮灘濕地潮間帶［1］。海三棱藨草是中國(guó)特有種，同時(shí)也是潮灘濕地上典型的先鋒物種，在崇明東灘、九段沙等地由其形成的海濱天然草場(chǎng)，可以為鸻鷸類、雁鴨類、鶴類、鷗類等多種國(guó)家級(jí)保護(hù)候鳥提供越冬及天然的覓食、活動(dòng)、休憩場(chǎng)所［2］。由于之前人們對(duì)海三棱藨草的生態(tài)價(jià)值及功能缺乏必要的了解，因此在對(duì)潮灘濕地開發(fā)和應(yīng)對(duì)外來(lái)物種入侵的過(guò)程中未能給予足夠的保護(hù)。目前，海三棱藨草的生存已受到嚴(yán)重的威脅。

氮元素是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素之一。土壤氮素適宜時(shí)，植物生長(zhǎng)旺盛，生物量增加；氮素含量過(guò)剩時(shí)，植物生長(zhǎng)受到抑制、病蟲害抵抗力下降、且往往伴隨發(fā)育不良［3-4］。Cruz等［5］人對(duì)木薯（Manihotesculentacrantz）葉的氮添加試驗(yàn)表明，適量的氮水平能夠增加植物體內(nèi)的葉綠素、有機(jī)質(zhì)含量，增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)能力及呼吸作用；曹健等［6］人對(duì)氮素添加量和烤煙（Nicotianatabacum）植物各器官元素含量的影響進(jìn)行研究表明，在一定施氮范圍內(nèi)，各器官含氮量均隨施氮量的增加而升高；李亞靜等［7］人通過(guò)對(duì)兔眼藍(lán)漿果（VacciniumasheiReade）施加不同濃度氮肥，發(fā)現(xiàn)施氮量過(guò)多會(huì)導(dǎo)致其產(chǎn)量下降、生長(zhǎng)不良和凍害嚴(yán)重。

目前，氮過(guò)剩已成為長(zhǎng)江口的主要環(huán)境問(wèn)題之一［8］：唐洪杰在對(duì)長(zhǎng)江口水域富營(yíng)養(yǎng)化近30年變化的研究中發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)江口水域無(wú)機(jī)氮年均濃度由20世紀(jì)80年代初期的4μmol·dm-3左右迅速增加到21世紀(jì)初期的26μmol·dm-3左右，已超過(guò)國(guó)家二類海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)［9］，并引發(fā)東海赤潮的年年發(fā)生。海三棱藨草作為長(zhǎng)江口潮灘濕地的主要鹽沼植被類型之一，氮素濃度過(guò)高對(duì)其生長(zhǎng)的影響尚待研究。因此，為了探究不同氮濃度對(duì)海三棱藨草生長(zhǎng)及生理特性指標(biāo)的影響，精確評(píng)估海三棱藨草在不同程度氮過(guò)剩條件下的吸收凈化能力，本研究于2015年在崇明東灘以海三棱藨草群落為研究對(duì)象，通過(guò)外源添加不同濃度的氮，模擬不同土壤氮素環(huán)境對(duì)海三棱藨草生長(zhǎng)和生理特征的影響，以期為富營(yíng)養(yǎng)化背景下對(duì)海三棱藨草的種群保護(hù)提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 研究區(qū)概況

崇明東灘鳥類國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)（121°50′～122°05′E，31°25′～31°38′N），位于長(zhǎng)江入海口，是我國(guó)重要的潮灘濕地，也是海三棱藨草的主要分布區(qū)之一。保護(hù)區(qū)地處中亞熱帶北緣，屬海洋性季風(fēng)氣候，溫和濕潤(rùn)，年平均日照時(shí)數(shù)為2137.9h，無(wú)霜期長(zhǎng)達(dá)229d；年平均氣溫為15.3℃，1月平均氣溫最低，為2.8℃，7月月均溫最高，為27.5℃；降水充沛，年降水量1022mm，主要集中在4-9月份，占全年降水的71%，相對(duì)濕度82%［10］。土壤類型為潮灘鹽土，適宜鹽生化草本植物群落的自然生長(zhǎng)［11］。

2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2015年3月植株萌發(fā)期，在崇明東灘東旺沙海三棱藨草單一種群內(nèi)開展。選取長(zhǎng)勢(shì)相近的植株，設(shè)置大小為1m×1m的樣方，樣方之間間隔2m以上。樣地土壤全氮含量約50mg·kg-2，據(jù)此設(shè)置1，2，4，8倍土壤全氮含量的外源氮素，以不施加外源氮素的樣方為對(duì)照組，總共5組處理，每組樣方設(shè)置3個(gè)重復(fù)，氮素施加濃度分別為0，50，100，200和400mg·kg-1（以 N0，N1，N2，N3和 N4表示）。以尿素（含氮46.3%）作為施氮肥料在低潮位時(shí)人工施入，每月1次，共6次；在施氮后210天采集土壤和植物樣品，現(xiàn)場(chǎng)測(cè)量株高、植株密度等生長(zhǎng)指標(biāo)；功能葉片采樣后迅速放入裝有冰袋的保溫箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室立即放入液氮速凍。由于潮灘地區(qū)潮汐作用強(qiáng)烈，施加的氮素勢(shì)必受潮汐影響而濃度降低，因此參考土壤全氮含量來(lái)表征樣方內(nèi)氮素水平（表1）；使用環(huán)刀采集表層30cm深度土壤樣品，在樣方內(nèi)采用5點(diǎn)采樣法，現(xiàn)場(chǎng)混合裝入自封袋，帶回實(shí)驗(yàn)室做進(jìn)一步分析。

表1 各施氮水平樣方內(nèi)土壤全氮含量Table 1 Soil total nitrogen content under different nitrogen addition levels

2.3 指標(biāo)測(cè)定

2.3.1 地上、地下生物量 地上生物量：在野外將樣方內(nèi)的植株地上部分齊根割取，帶回實(shí)驗(yàn)室用蒸餾水沖洗干凈，105℃殺青2h并烘干至恒重，稱重后得到地上生物量（g·m-2）。

地下生物量：考慮到海三棱藨草為潮灘先鋒植物，根系較淺，因此樣方內(nèi)割取掉地上部分后，用鐵鍬挖取20cm×20cm×20cm的土塊，沖洗至沒(méi)有泥土，僅殘留有植物根系，之后的測(cè)量方法與地上生物量相同。

2.3.2 土壤、植物氮素含量 采集的土壤樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，用上述方法殺青并置于50℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，后用木錘將大塊土塊敲碎，再經(jīng)研磨后過(guò)100目篩網(wǎng)，用VarioIII元素分析儀（德國(guó)ELEMENTAR公司）對(duì)土壤全氮含量進(jìn)行測(cè)定。

植物樣品將地上、地下部分分開，帶回實(shí)驗(yàn)室用蒸餾水沖洗干凈，105℃殺青2h，之后放入烘箱于65℃烘干至恒重，后續(xù)操作與土壤氮素測(cè)定相同。

根據(jù)地上、地下的生物量和植物全氮濃度，可以計(jì)算各施氮水平下植株的氮儲(chǔ)量：植物氮儲(chǔ)量（g·m-2）= 地上生物量（kg·m-2）×地上部分全氮濃度（g·kg-1）+ 地下生物量（kg·m-2）×地下部分全氮濃度（g·kg-1）。

2.3.3 葉綠素含量測(cè)定 采用丙酮乙醇混合液法［12］，取約0.05g成熟葉片，用剪刀剪碎后放入試管并加入10mL丙酮、乙醇混合液（丙酮∶無(wú)水乙醇：水=4.5∶4.5∶1），保證葉片與提取液充分接觸，密封后置于避光處3天，待葉片完全變白時(shí)將提取液用分光光度計(jì)于OD645，OD663處檢測(cè)吸光度，根據(jù)Arnon公式［13］計(jì)算樣品的葉綠素含量。

其中V表示提取液最終體積（mL），W表示樣品鮮重（g），葉綠素濃度單位為mg·g-1FW。

2.3.4 丙二醛（MDA）濃度測(cè)定 丙二醛（MDA）作為膜質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，其濃度可用來(lái)表征植物的受脅迫程度和衰老程度［14］。本研究采用硫代巴比妥酸法測(cè)定植物葉片中的 MDA含量［15］。具體方法如下：取約0.2g成熟葉片剪碎放入研缽中，加入5mL 10%的三氯乙酸溶液（TCA）在冰浴環(huán)境下充分研磨，移至試管中，在高速帶溫控離心機(jī)內(nèi)于9000rpm，4℃條件下離心5min。取1.5mL上清液加入1.5mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液（TBA）（溶解于10%TCA溶液中），于沸水浴中反應(yīng)15min后迅速轉(zhuǎn)移到冰浴中冷卻，并于6000rpm，25℃條件下離心5min，取上清液用分光光度計(jì)于OD532，OD600，OD450下測(cè)定吸光度，并按照以下公式計(jì)算樣品MDA濃度（單位：μmol·g-1FW）

CMDA=6.45×（OD532-OD600）-0.56×OD450

2.4 數(shù)據(jù)分析

本文采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和最小顯著差異法（LSD）對(duì)不同施氮水平的植株高度、植株密度、生物量、全氮含量、葉綠素和MDA濃度等指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（α=0.05）。分析前先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布、方差齊性檢驗(yàn)，對(duì)不符合方差齊性的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析均在SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行處理，圖表數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，采用Origin 8.0作圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 施氮對(duì)海三棱藨草生長(zhǎng)特征及生物量的影響

不同施氮水平對(duì)海三棱藨草生長(zhǎng)發(fā)育影響顯著。隨施氮水平的增加，海三棱藨草株高、密度及生物量均呈現(xiàn)先增加后降低的規(guī)律（圖1），且變化存在顯著性差異：植株高度在N2處理下呈現(xiàn)最高值（76.7±7.8cm），與 N1，N3處理無(wú)顯著差異，相比無(wú)施氮處理N0升高近35%，后隨施氮水平的增加而降低；植株密度在N1處理下最高，為298.3±50.1株·m-2，與N2，N3，N4處理無(wú)顯著性差異，相比N0增加近51%；總生物量在N3處理時(shí)達(dá)到最高值525.6±33.6g·m-2，與N2處理無(wú)顯著差異，相比N0增加近40%。各施氮濃度下海三棱藨草的根冠比均在0.71±0.07范圍內(nèi)，無(wú)顯著性差異（表2）。

圖1 不同施氮水平對(duì)海三棱藨草植株高度、植株密度和生物量的影響Fig.1 Plant height（A），density（B）and biomass（C）of Scirpusmariqueter under different levels of nitrogen addition

表2 各施氮水平樣方內(nèi)植物根冠比Table 2 Root/shoot ratio under different nitrogen fertilizer rates

綜合考慮各生長(zhǎng)指標(biāo)，在長(zhǎng)江口潮灘濕地環(huán)境下，生境中氮素含量達(dá)到約N2，N3處理（施氮100，200mg·kg-1）水平時(shí)，最適宜海三棱藨草的生長(zhǎng)，且高度、密度及生物量等指標(biāo)均達(dá)到較高水平；若氮素含量繼續(xù)升高，海三棱藨草的生長(zhǎng)則受到抑制，各指標(biāo)停止增長(zhǎng)并出現(xiàn)下降趨勢(shì)。

3.2 施氮對(duì)海三棱藨草含氮量的影響

隨施氮水平增加，海三棱藨草地上、地下部分的全氮濃度均高于對(duì)照組N0（圖2），且存在顯著性差異。其中，地上部分全氮濃度逐漸升高，在N3處理（施氮200mg·kg-1）達(dá)到最高值13.1±0.46 g·kg-1，相比N0增長(zhǎng)約30%，N4處理（施氮400 mg·kg-1）不再增高且與N3處理無(wú)顯著差異；地下部分全氮濃度隨施氮水平的增加而增加，在N4處理時(shí)達(dá)到9.61±1.26g·kg-1，相比對(duì)照組增加約52%。

海三棱藨草的植株氮儲(chǔ)量隨施氮水平增加呈先增后減的變化趨勢(shì)（圖3）。且地上、地下變化趨勢(shì)相似，均在N3處理時(shí)達(dá)到最高儲(chǔ)量，此時(shí)植株總氮儲(chǔ)量為5.9g·m-2，相比無(wú)施氮處理增加約85%。

3.3 施氮對(duì)海三棱藨草生理特征的影響

海三棱藨草葉片中葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素的濃度隨施氮水平的增加呈先增加后停止增長(zhǎng)的趨勢(shì)（圖4）；并在N3處理下達(dá)到最高值，但與N1，N2和N4處理無(wú)顯著性差異，相比無(wú)施氮處理葉綠素a提高約36%，葉綠素b提高約39%，總?cè)~綠素提高約37%。

圖2 不同施氮水平對(duì)海三棱藨草植株全氮濃度的影響Fig.2.Total nitrogen concentration of Scirpusmariqueter under different levels of nitrogen addition

圖3 不同施氮水平對(duì)海三棱藨草氮儲(chǔ)量的影響Fig.3Nitrogen reserves of Scirpusmariqueter under different levels of nitrogen addition

本試驗(yàn)中，海三棱藨草葉片丙二醛（MDA）濃度隨施氮水平的增加先降低后緩慢升高（圖5），MDA濃度在N1處理達(dá)到最低值0.93±0.08 μmol·g-1，相比 N0處理降低約26%，與 N2，N3，N4處理無(wú)顯著差異。

圖4 不同施氮水平對(duì)海三棱藨草葉綠素濃度的影響Fig.4 Chlorophyll content of Scirpusmariqueter under different levels of nitrogen addition

圖5 不同施氮水平對(duì)海三棱藨草MDA濃度的影響Fig.5 MDA content of Scirpusmariqueter under different levels of nitrogen addition

4 討論

目前，判斷元素對(duì)植物生長(zhǎng)的影響主要通過(guò)與正常生長(zhǎng)特征指標(biāo)（對(duì)照組）進(jìn)行對(duì)比。本研究中，隨著氮素添加濃度的升高，海三棱藨草在株高、密度和生物量等方面呈先增加后降低的趨勢(shì)，但均高于或與對(duì)照組無(wú)顯著差異，說(shuō)明長(zhǎng)江口的氮過(guò)剩環(huán)境會(huì)顯著促進(jìn)海三棱藨草的生長(zhǎng)發(fā)育，并在短期內(nèi)不會(huì)受到氮抑制。前人研究認(rèn)為，外源氮素的輸入將促進(jìn)植物細(xì)胞伸長(zhǎng)，從而提高植物的長(zhǎng)勢(shì)［16］；在本試驗(yàn)中，外源氮在0～100mg·kg-1范圍內(nèi)時(shí)，海三棱藨草株高有顯著增長(zhǎng)，但超過(guò)該范圍后，株高停止增長(zhǎng)并在400mg·kg-1施氮水平下顯著下降（圖1）。說(shuō)明在長(zhǎng)江口潮灘濕地環(huán)境下，施加外源氮素達(dá)到約100mg·kg-1時(shí)，對(duì)海三棱藨草長(zhǎng)勢(shì)的促進(jìn)效果達(dá)到最佳，濃度繼續(xù)升高將無(wú)法起到促進(jìn)效果，甚至抑制植物個(gè)體的生長(zhǎng)。楊宇等［17］人在草原生態(tài)系統(tǒng)的氮添加試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，氮素的施加對(duì)植物分蘗沒(méi)有明顯的影響，但會(huì)降低植株的死亡率，從而可在一定程度上提高種群密度；在50mg·kg-1的施氮處理下海三棱藨草種群密度有顯著增加（圖2），但施氮量超過(guò)50mg·kg-1后，海三棱藨草群落密度停止增加并在施氮超過(guò)200mg·kg-1后顯著降低，這表明高濃度氮素對(duì)該種植物生長(zhǎng)產(chǎn)生脅迫作用，致使種群密度下降［18］。

根冠比可以反映植物地下與地上部分的相關(guān)性，在氮素充足時(shí)，大部分氮素與光合產(chǎn)物用于地上部分生長(zhǎng)，供應(yīng)根部的比例相對(duì)較小，根冠比低［19］；但在本研究中，各施氮水平下海三棱藨草的根冠比未出現(xiàn)顯著性差異（表2），原因可能在于海三棱藨草特殊的球莖繁殖模式，導(dǎo)致在養(yǎng)分充足時(shí)，地上部分會(huì)將一定養(yǎng)分轉(zhuǎn)入地下形成地下球莖，經(jīng)休眠后在第二年發(fā)育出新的植物個(gè)體［20］，因此減少了地上部分的生物量并增加到地下，致使海三棱藨草地下生物量隨氮素增加產(chǎn)生顯著性差異，從而減小了各施氮濃度下根冠比的差異，并造成地下生物量在不同氮濃度下的顯著差異（圖3）。

氮元素是葉綠素的主要組分之一，葉片中約75%的氮元素儲(chǔ)存在葉綠素中［21］；氮素濃度的大小強(qiáng)烈影響著植物組織的結(jié)構(gòu)，從而影響到葉片光合功能。葉綠素含量增加后，植物需通過(guò)改變形態(tài)性狀（株高增高、生物量增加）和群落特征（植株密度增加）來(lái)保持其生理過(guò)程的穩(wěn)定［22-23］。本研究中，氮添加濃度較低時(shí)，葉綠素含量的增加可能是一種植物的保護(hù)性反應(yīng)，通過(guò)增加天線色素在捕光色素復(fù)合體中的比例，從而促進(jìn)了植物的光合效率，也增強(qiáng)了對(duì)弱光的利用率，這與前人的相關(guān)研究結(jié)果一致［24-25］；而當(dāng)施氮水平超過(guò)50mg·kg-1后，過(guò)高的氮素含量加快了植物的生命活動(dòng)、同時(shí)推進(jìn)其衰老進(jìn)程，從而阻礙了葉綠素濃度的有效積累［26-27］，導(dǎo)致葉片葉綠素濃度不再顯著升高（圖4）。

丙二醛濃度的增加是植物細(xì)胞受損的直接表現(xiàn)，較高的丙二醛濃度說(shuō)明組織的保護(hù)能力減弱，植株衰老速率加快［28］。本研究中，施氮處理的海三棱藨草葉片MDA濃度均低于無(wú)施氮處理，說(shuō)明長(zhǎng)江口的海三棱藨草在自然條件下便處于一種較高脅迫的狀態(tài)，這主要是源于潮灘濕地較高的土壤鹽度和較強(qiáng)的潮汐作用。不同濃度的施氮水平對(duì)葉片MDA濃度也有著非線性的影響：其中以N1處理（施氮50mg·kg-1）最低（圖5）；這說(shuō)明在一定的濃度范圍內(nèi)，環(huán)境中氮素濃度的增加會(huì)緩解葉片膜脂過(guò)氧化，減緩老化過(guò)程，但過(guò)高的氮素濃度可能會(huì)加劇過(guò)氧化反應(yīng)，使海三棱藨草提前衰老，這與廖德志等人對(duì)榿木（Alnus formosana）的氮添加試驗(yàn)結(jié)論一致［30］。

潮灘植物在生長(zhǎng)過(guò)程中主要通過(guò)吸收并在植物體內(nèi)固定氮元素，從而達(dá)到對(duì)環(huán)境中氮的凈化，因此植物體的氮儲(chǔ)量可作為衡量潮灘植物吸收和凈化能力的重要指標(biāo)。植物的氮儲(chǔ)量主要由氮濃度和生物量共同影響，本研究中，植物地上和地下部分的氮素濃度隨施氮水平的增加均有顯著提高（圖2），且在添加濃度達(dá)到200mg·kg-1時(shí)植物氮素濃度達(dá)到最高，而400mg·kg-1的氮添加水平下，植物體內(nèi)氮素濃度仍處于較高水平，說(shuō)明海三棱藨草在氮素濃度較高的環(huán)境下會(huì)保持較高的吸收能力。同時(shí)，由于生物量隨施氮濃度增加而出現(xiàn)顯著的先升后降趨勢(shì)（圖1c），植物總的氮儲(chǔ)量也呈現(xiàn)出顯著的先升后降趨勢(shì)，并于200mg·kg-1施氮濃度下達(dá)到最大氮素儲(chǔ)量（圖3），超過(guò)該范圍后，海三棱藨草的總氮儲(chǔ)量會(huì)下降，對(duì)氮素的吸收和凈化能力也將隨之降低。目前崇明東灘海三棱藨草群落帶土壤全氮水平約為50mg·kg-1，尚未達(dá)到抑制海三棱藨草生長(zhǎng)的程度，因此海三棱藨草仍可在長(zhǎng)江口富營(yíng)養(yǎng)化加劇的背景下較好地生長(zhǎng)發(fā)育，并發(fā)揮其氮素吸收和凈化功能。

5 結(jié)論

（1）隨施氮濃度的增加，海三棱藨草的生長(zhǎng)總體呈低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的規(guī)律。其中100～200 mg·kg-1的氮素施加量顯著提高了海三棱藨草的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)和葉片葉綠素含量，相比無(wú)施氮處理，植株高度提高約35%；植株密度提高約50%；總生物量提高約40%；葉片總?cè)~綠素濃度提升約37%。

（2）海三棱藨草植株的氮儲(chǔ)量在施氮200mg·kg-1處理時(shí)達(dá)到最大值5.9g·m-2，超過(guò)該水平后，氮儲(chǔ)量顯著降低，對(duì)氮素的吸收和凈化能力逐漸減弱。

（3）目前長(zhǎng)江口潮灘濕地的土壤全氮含量尚未達(dá)到抑制海三棱藨草生長(zhǎng)的水平，氮過(guò)剩環(huán)境有利于該植物的生長(zhǎng)發(fā)育，并可以較好地發(fā)揮其氮素吸收和凈化功能。