雷杰

摘 要：Veriflow?檢測系統(tǒng)是一種基于分子生物學(xué)的測定方法，可準確檢測乳制品、肉制品、整雞淋洗液和即食食品中的沙門氏菌。該檢測方法將PCR檢測與快速、可視化的垂直流層析法相結(jié)合，不需要純化樣品、凝膠電泳或基于熒光素擴增目標菌，后期沒有復(fù)雜的數(shù)據(jù)分析過程。針對8個不同的食品和環(huán)境基質(zhì)的檢測結(jié)果表明：對于含量極低的沙門氏菌（人工接種或自然存在），Veriflow沙門氏菌檢測（SS）都表現(xiàn)出很高的檢測靈敏度。通過對檢測結(jié)果陽性率的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，Veriflow檢測結(jié)果與FDA微生物分析手冊BAM的方法和美國農(nóng)業(yè)部食品安全與檢驗局微生物實驗室方法USDA/FSIS MLG的結(jié)果沒有顯著差異。包容性、排他性、性能穩(wěn)定性等研究結(jié)果均表明Veriflow SS是一款穩(wěn)定、可靠的產(chǎn)品，能高靈敏性、高選擇性、高包容性地檢測環(huán)境表面、乳制品、肉、整雞淋洗液和各類即食食品中的沙門氏菌。

關(guān)鍵詞：沙門氏菌屬 Veriflow 包容性 排他性 靈敏度

引言

致病菌帶給企業(yè)和消費者的危害不言而喻，各國政府和企業(yè)都對食源性致病菌的快速診斷寄予厚望，這也使各種檢測方法層出不窮。美國Veriflow DNA簽名捕獲技術(shù)的致病菌、腐敗菌檢測系統(tǒng)，以其快速、準確、可視化等特點在各種檢測方法中獨樹一幟，是一項具有創(chuàng)新性的分子檢測技術(shù)，即使在未經(jīng)凈化處理的樣品基質(zhì)中也能高靈敏、高精確的檢測目標菌。

1 材料和方法

1.1 材料

a.標準菌株：性能穩(wěn)定性和批間穩(wěn)定性測試中陽性樣本和陰性樣本的培養(yǎng)物，分別采用鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 14028）和枸櫞酸桿菌（ATCC 8090）；包容性和排他性測試菌株分別采用104株不同血清型沙門氏菌菌株和35株非沙門氏菌。

b.樣品基質(zhì)：生牛肉（20%的脂肪）、牛奶（2%的脂肪）、整雞淋洗液、熱狗。

1.2 Veriflow沙門氏菌（SS）檢測原理和檢測流程

Veriflow SS是一種基于PCR和DNA簽名捕獲技術(shù)的檢測方法，將PCR與DNA簽名探針和垂直層析流系統(tǒng)相結(jié)合，能夠提供特異的、高靈敏度的靶標分子簽名檢測和快速、易解的檢測結(jié)果。

本研究中，對各種基質(zhì)進行采樣、增菌和PCR擴增，獲得沙門氏菌屬的特異性擴增產(chǎn)物。然后將PCR擴增產(chǎn)物直接滴加到層析卡盒的樣本視窗里，再加入4滴緩沖液，僅需3分鐘即可產(chǎn)生反應(yīng)信號。拉動檢測卡盒上的開關(guān)，觀察檢測結(jié)果。出現(xiàn)一條紅色質(zhì)控線，表示層析卡盒工作正常。質(zhì)控線和檢測線都出現(xiàn)表示沙門氏菌屬陽性，而只出現(xiàn)質(zhì)控線，則表示為陰性結(jié)果（如圖1所示）。

1.3 穩(wěn)定性驗證研究

性能穩(wěn)定性（魯棒性）驗證研究：目的是評估Veriflow SS PCR操作步驟中的微小改變（樣本煮沸時間、緩沖液滴加量或?qū)游隹ê蟹磻?yīng)時間）是否能影響其檢測性能（如表1）。

批次間穩(wěn)定性驗證研究：選擇2013年9～10月間的3個批次Veriflow SS檢測系統(tǒng)，批號依次為ML 0025、ML 0028和ML 0029，在放置0、6和12個月的時間點進行實驗（如表2所示）。每個批次對應(yīng)的時間點，各用10個陽性樣本和5個陰性樣本。

包容性和排他性研究：用Veriflow SS檢測104株沙門氏菌屬菌株和35株排他性菌株。

1.4 Veriflow SS與FDA推薦沙門氏菌檢測方法對比

食品基質(zhì)檢測方法比較：不同的食品基質(zhì)接種不同血清型的沙門氏菌，食品基質(zhì)的每個樣品中均加入稀釋24h的肉湯培養(yǎng)物，充分混合，在4℃下平衡48～72h。通過3種檢測濃度下的陽性樣品個數(shù)，來計算MPN。

整雞胴體檢測方法比較：實驗開始前兩批各20個樣本一直保存在4±2℃。每份樣本用400mL IS BPW進行淋洗，從每份雞肉淋洗液中各取36mL和30mL，分別用于Veriflow SS和FDA推薦方法檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 性能穩(wěn)定性和批次穩(wěn)定性研究

性能穩(wěn)定性實驗結(jié)果證明：操作步驟的變動不會影響Veriflow SS的測試性能。實驗結(jié)果符合AOAC-RI PTM要求的分數(shù)計算，且所有的陽性樣本都經(jīng)FDA和USDA參考方法確認。這些結(jié)果表明，某些測試參數(shù)的變化不會直接影響Veriflow SS的測定性能。

批次間穩(wěn)定性實驗清晰地表明：3個批次的Veriflow SS不同使用時間點的測定性能都保持一致。同時，這些結(jié)果也說明Veriflow SS在12個月的使用期限間，均能保持穩(wěn)定的測定性能。

2.2 包容性和排他性研究

該實驗結(jié)果表明：Veriflow SS能準確的檢測104株不同的沙門氏菌屬。與包容性結(jié)果一致，排他性研究結(jié)果也證明Veriflow SS能準確區(qū)分沙門氏菌屬和其他細菌。

2.3 食品基質(zhì)檢測方法結(jié)果比較

食品基質(zhì)檢測結(jié)果：3個不同接種水平的樣品，低濃度的檢測樣中，Veriflow SS檢測方法和FDA 參考方法陽性檢出率無顯著差異，所有的只接種干擾菌的樣本，通過兩種方法的檢測結(jié)果均為陰性，故兩種方法統(tǒng)計學(xué)上不存在顯著性差異。

整雞胴體檢測結(jié)果：基于POD統(tǒng)計分析，兩種方法不存在顯著性差異（陽性樣品均采用參考方法確認）。

3 討論和結(jié)論

上述檢測結(jié)果說明：與FDA和USDA參考方法相比，對于乳、肉、整雞和即食食品等8種基質(zhì)中104種沙門氏菌的檢測，Veriflow SS與FDA和USDA參考方法的檢測結(jié)果無顯著差異，具有很好的特異性、準確性和可靠性。在整個試驗過程中，沒有出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果。與參考方法相比，Veriflow不需要復(fù)雜樣品制備，僅需18～24h就可以得到準確的檢測結(jié)果，大大短于參考方法3～4天的檢測時間。因此，本研究的結(jié)果表明：Veriflow沙門氏菌檢測系統(tǒng)是一種靈敏、可靠和簡單易操作的快速致病菌檢測方法。

參考文獻：

[1] U.S. Food and Drug Administration （2001） Bacteriological Analytical Manual， Ch. 5， “Salmonella，” https：//www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm.endprint