黃榮祥，余嵐嵐，朱晨雁，馬 亮，聶 琨，何文波

(福建省廈門麥克奧迪醫(yī)學檢驗所 361006)

無醛固定液與醛類固定液對細胞核DNA及細胞質著色的影響

黃榮祥，余嵐嵐，朱晨雁，馬 亮，聶 琨，何文波

(福建省廈門麥克奧迪醫(yī)學檢驗所 361006)

目的 旨在探究無醛固定液與醛類固定液對細胞核DNA及細胞質著色的影響。方法 通過運用DNA定量分析系統(tǒng)(ICM)對分別經過8種不同固定液固定的細胞核DNA含量(IOD)、離散系數(CV)、DNA指數(DI)、細胞核面積進行測量，聯合細胞學染色，分析不同固定液對核DNA及細胞質染色的影響。結果 醛類固定液優(yōu)于無醛固定液，固定液中的甲醛對Feulgen-eosin聯合染色有重要影響。結論 采用醛類固定液進行后固定，硫堇對細胞核DNA染色，與細胞學染色相結合，獲得了良好的染色效果，為后續(xù)的多技術聯合診斷提供依據。

病理學；定量；圖像細胞測定；細胞,固定化；DNA

自從1924年Feulgen和Rossenbeck等建立了DNA-Feulgen染色法以來，Feulgen染色法仍然是DNA定量測定金標準[1]。DNA定量測定既能反映細胞生長、分化及癌前病變，又能判斷腫瘤性質、預后等情況[2-4]。因此，國內外很多醫(yī)院、實驗室已經廣泛開展[5-7]。這就決定了Feulgen反應的每個環(huán)節(jié)有著非?？量痰囊?。液基標本一放入細胞保存液就會被固定，大部分固定效果都由這一步實現，稱之為標本的前固定。本實驗對Feulgen反應后固定環(huán)節(jié)進行探討，選用病理學中最常用的10%甲醛生理鹽水、甲醛-乙酸-乙醇混合固定液(AAF)、乙酸、乙醇、甲醇、丙酮、15%聚乙二醇及玻姆-施普倫格(Bohm-Sprenger)固定液作為后固定，通過Feulgen染色后，在全自動細胞圖像分析系統(tǒng)中對細胞核DNA含量(IOD)、離散系數(CV)進行測量計算，并對細胞質進行伊紅染色，比較不同固定液對染色的影響，遴選出適合細胞核DNA及細胞質染色的固定液，為Feulgen聯合細胞學染色提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 標本來源 選用廈門麥克奧迪醫(yī)學檢驗所病理細胞室2015年8月至2016年1月，符合實驗要求的婦科宮頸新鮮標本。

1.1.2 主要試劑 10%甲醛生理鹽水(10 mL甲醛+90 mL生理鹽水)；AAF固定液(10 mL甲醛+5 mL乙酸+85 mL 75%乙醇)；乙酸(AR級)、乙醇(AR級)、甲醇(AR級)、丙酮(AR級)、15%聚乙二醇(15 g 聚乙二醇+100 mL蒸餾水)、Bohm-Sprenger固定液(80 mL甲醇+15 mL甲醛+5 mL乙酸)；其余試劑由廈門麥克奧迪醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司提供；

1.1.3 儀器設備 MotiCytometer細胞DNA定量分析系統(tǒng)(ICM)，由廈門麥克奧迪醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 制片 采用自然沉降法制片。將細胞保存瓶在震蕩器上震蕩混勻；往離心管中加入8 mL標本；800×g離心5 min，棄上清；加入2 mL PBS緩沖液稀釋細胞沉淀，震蕩混勻；轉移0.5～1.0 mL細胞混懸液至沉降倉中，沉降10 min；吸棄沉降倉中殘液。

1.2.2 后固定 室溫條件下，將8組來自同一宮頸刷取物的液基細胞片分別放入無醛固定液組(乙酸、乙醇、甲醇、丙酮、15%聚乙二醇)和醛類固定液組(10%甲醛生理鹽水、AAF、Bohm-Sprenger固定液)固定50 min。未進行后固定處理作空白對照。

1.2.3 染色 (1)Feulgen染色:上述固定后的液基細胞片依次進行后續(xù)的酸解、染色、漂洗、脫水、透明，步驟見表1。(2)Feulgen-eosin聯合染色:按表1進行Feulgen染色，脫水至95%乙醇后，置eosin染色數分鐘，無水乙醇脫水，二甲苯透明，封片。

1.2.4 評價 使用MotiCytometer細胞DNA定量分析系統(tǒng)對染色后的細胞DNA片進行掃描。該系統(tǒng)通過顯微鏡上的高精度CCD攝像頭采集細胞核圖像，并借助圖像定量分析軟件對細胞核圖像進行數字化轉換，同時對多個細胞參數進行分析計算，自動對細胞進行識別分類。評價指標,IOD:表示細胞核DNA的積分光密度值，即細胞核DNA含量；DNA指數(DNA index，DI )，DI=(被測細胞DNA-IOD值)/(正常2c細胞DNA-IOD平均值)，當DI=1，代表該細胞為正常2倍體(2c)；CV:表示同一細胞片各細胞DNA含量測定時的差別，CV=標準差/均值×100%。

表1 Feulgen染色流程

染色后的玻片保存于陰涼處；RT為室溫

2 結 果

2.1 固定液比較 從圖1結果顯示，室溫下8種固定液50 min內的固定效果差異顯著，醛類固定液組的IOD值均高于無醛固定液組及空白對照組。固定液對細胞核染色后的CV有不同程度的影響，各處理組的細胞群CV差異見圖2，醛類固定液組的細胞群較為集中分布，所測CV值均小于無醛固定液組。綜合IOD和細胞核CV值，無醛固定液組與空白對照組無差異，提示醛對細胞核DNA染色起至關重要的作用。

圖1 8種固定液對細胞核IOD的影響

圖2 8種固定液對細胞核CV值的影響

2.2 DI-細胞核面積散點圖繪制 室溫條件下，采用8種固定液對宮頸刷取物中的宮頸細胞進行相同時間的固定。無醛固定液固定的標本，峰型較粗(圖3A～F)，無論細胞核面積大小，均有較多的細胞DI值偏離1，提示DNA染色效果差，染色不均，DNA丟失或非特異性著色增強；經醛類固定液固定的標本，峰型較細(圖3G～I)，較為集中，DNA染色效果較好。結果表明，醛類能有效固定DNA，明顯提高染色的特異性。

A:未固定組；B:乙酸組;C:乙醇組;D:甲醇組;E:丙酮組;F:15%聚乙二醇組;G:10%甲醛生理鹽水組;H:AAF組;I:BS組

圖3 各固定液組DI-細胞核面積散定圖

A:未固定組;B:10%甲醛生理鹽水組；C:AAF組;D:Bohm-Sprengr組;E:乙酸組;F:乙醇組;G:甲醇組;H:丙酮組;I:15%聚乙二醇組

圖4 各固定液組細胞形態(tài)(×200)

2.3 固定后的細胞形態(tài) 采用Feulgen染色法對細胞核染色，伊紅對細細胞質進行染色。醛類固定液組Feulgen-eosin聯合染色核漿對比清晰，核漿形態(tài)正常，與未固定組區(qū)別明顯(表2，圖4A～D)。無醛固定液組細胞核著色整體略淡，細胞質著色正常，染色對比度清晰，乙酸、乙醇、15%聚乙二醇固定組細胞核腫脹，除15%聚乙二醇外，其余細胞質形態(tài)正常(表2，圖4E～I)。

表2 8種固定液對宮頸細胞核、漿染色效果比較

3 討 論

目前，病理上使用的固定液種類繁雜多樣，大多通過蘇木素-伊紅(HE)或者巴氏染色的評價來選擇適宜固定、保存病理標本的固定液[8-13]。病理醫(yī)師往往根據這些評價結果，來選擇Feulgen反應固定液，對固定液沒有進行特異性的嚴格、科學的篩選，進而影響Feulgen反應效能，間接影響病理診斷結果的準確性。好的固定液既能在不破壞細胞原有形態(tài)的情況下，以最快的速度達到最理想的固定效果。甲醛滲透性較強，固定均勻，組織收縮輕微，與蛋白質分子交聯，形成不溶性產物，使DNA更好地固定在蛋白質上；乙醇用于糖原、纖維蛋白及彈性纖維的固定，滲透力較甲醛弱，組織收縮力較強，能凝固清蛋白，球蛋白和核蛋白，使DNA對鹽酸保持高敏感性；乙酸滲透性強，組織膨脹較明顯，能沉淀核蛋白，因此染色質固定很快，可較好地保持染色體結構，是染色質良好的固定液。甲醇滲透性強，組織收縮力較乙醇小，固定細胞質效果好，與乙酸結合，能使細胞形態(tài)不變[12,14]。丙酮對組織穿透性強，細胞收縮力強，使蛋白質發(fā)生凝結。因此，本文選用10%甲醛生理鹽水、AAF、乙酸、乙醇、甲醇、丙酮、15%聚乙二醇及Bohm-Sprenger固定液作為評價對象，DNA定量分析系統(tǒng)對觀測結果進行定量的評價。固定后的細胞核DNA可在酸性條件下水解，嘌呤堿基與脫氧核糖之間的糖苷鍵斷開，使DNA鏈暴露出醛基，此時特異性染料與游離醛基一對一地結合，形成具有特定顏色的反應產物，DNA定量分析系統(tǒng)根據顏色深淺將反應產物含量數字化，數字化后的平均IOD值即為細胞片上所有細胞核DNA含量的平均值。平均IOD值越高， DNA含量越高，提示固定的效果越好。CV越小，散點圖分布越窄，提示著色特異性越強。

實驗結果表明，單一固定液要使細胞固定后達到Feulgen染色要求是比較困難的。因此，在提高細胞核DNA測定含量上，混合固定液表現較好。結合細胞質染色，Feulgen-eosin聯合染色首選醛類固定液10%甲醛生理鹽水、AAF、Bohm-Sprenger固定液中的一種。

后固定對Feulgen染色是有作用的，可以影響細胞核大小，以及DNA對酸和染料的接觸。散點圖上的“J”形細胞分布是由不完全染色引起的。大的細胞核被完全染色，小的細胞核只有部分被染色，過小的細胞核不利于細胞核DNA含量的測定[15-16]。醛類固定液中的甲醛對染色有影響。甲醛的含量會影響染色深淺和細胞核大小。但是，甲醛會與硫堇結合，破壞硫堇染色，使染出的顏色偏黃綠色，并產生沉淀。因此，細胞片進入染液之前，要把固定液徹底沖洗干凈，避免固定液污染硫堇染液。

綜上，根據細胞核的結構特點，采用醛類固定液進行后固定，硫堇對細胞核DNA染色，與細胞學染色相結合，獲得了良好的染色效果，為后續(xù)的多技術聯合診斷提供依據。此外，DNA定量分析系統(tǒng)(DNA-ICM)能測定多種細胞核形態(tài)參數，如球形度、偏心率、核致密度等。這些大數據有待科學工作者進一步挖掘，以廣泛、深入了解不同固定液的作用機制。

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Effects of aldehyde-free fixation solution and aldehyde fixation solution on the nucleus DNA and cytoplasm staining

HuangRongxiang,YuLanlan,ZhuChenyan,MaLiang,NieKun,HeWenbo

(XiamenMoticMedicalLaboratory,Xiamen,Fujian361006,China)

Objective To investigate the effect of aldehyde-free fixation solution and aldehyde fixation solution on DNA and cytoplasm of nucleus.Methods The DNA quantification (IOD),discrete coefficient (CV),DNA index (DI) and nucleus area (area) were measured by DNA quantification system (ICM) in 8 different fixation solution;combined with cytological staining,the effects of different fixative solution on nuclear DNA and cytoplasmic staining were analyzed.Results Aldehyde fixation solution was better than aldehyde free fixation solution,the formaldehyde in fixtion solution has important influence on Feulgen-eosin staining.Conclusion Aldehyde fixation solution combined with cytological staining can obtained good dyeing effect,which provides the basis for the subsequent multi-technique joint diagnosis.

pathology;quantitative;image cytometry;cells,immobilized;DNA

黃榮祥(1986-)，本科，主要從事病理細胞學研究。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.23.023

R361+.3

A

1671-8348(2017)23-3241-04

2016-01-10

2017-03-10)

·技術與方法·