尹崇志，聶敏海

(1.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校 404120；2.西南醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院口腔科,四川瀘州 646000)

加味導赤散與維生素B12對大鼠口腔潰瘍血清IL-6及TNF-α水平影響分析

尹崇志1，聶敏海2△

(1.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校 404120；2.西南醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院口腔科,四川瀘州 646000)

目的 探討加味導赤散與維生素B12對大鼠復發(fā)性口腔潰瘍的治療效果及對血清白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的影響。方法 選取SPF級雄性SD大鼠48只，采用隨機數(shù)字表法分為正常組(等量蒸餾水)、模型組(等量蒸餾水)、陽性對照組(左旋咪唑20 mg/kg灌胃治療)、實驗組(使用含有加味導赤散生藥材1 g/mL，1.278 mL/200 g+維生素B1220 μg/kg灌胃)各12只，模型組、陽性對照組、實驗組采用免疫法建立復發(fā)性口腔潰瘍模型，建模后按照對應(yīng)治療方法處理20 d。結(jié)果 陽性對照組、實驗組大鼠的口腔潰瘍數(shù)目、潰瘍持續(xù)時間均顯著低于模型組大鼠(P<0.05)，陽性對照組、實驗組大鼠的潰瘍間隔出現(xiàn)時間均顯著長于模型組大鼠(P<0.05)；陽性對照組、實驗組大鼠的血清IL-6、TNF-α檢測水平均顯著低于模型組大鼠(P<0.05)；模型組的血清IL-6、TNF-α檢測水平顯著高于正常組(P<0.05)；陽性對照組、實驗組大鼠的外周血超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)水平均顯著高于模型組大鼠(P<0.05),丙二醛(MDA)水平顯著低于模型組(P<0.05)。結(jié)論 加味導赤散與維生素B12對大鼠復發(fā)性口腔潰瘍具有治療作用，作用機制可能與減輕炎性反應(yīng)、提高組織的抗氧化能力有關(guān)。

加味導赤散；維生素B12；口腔潰瘍;白細胞介素6；腫瘤壞死因子-α

復發(fā)性口腔潰瘍是一種較為常見的口腔黏膜疾病，其發(fā)病率較高，在我國人群中可達20%，且容易反復發(fā)作、遷延不愈，給人們的日常生活帶來不便[1]?？谇粷兊陌l(fā)病原因和機制目前尚不完全清楚，一般認為是多種因素的綜合作用，如免疫異常、創(chuàng)傷、過度疲勞、激素變化、維生素缺乏等，目前也無針對性的藥物，多數(shù)藥物均為起初有效，而用藥一段時間后效果則大大減小[2]。維生素B12能促使破損皮膚、黏膜及血管內(nèi)皮細胞修復生長，防止傷口感染、惡化，進而促進潰瘍愈合[3]；而導赤散具有清熱瀉火、滋陰祛濕等功效，在治療口腔潰瘍方面具有顯著的療效，但其具體機制目前尚不完全清楚[4]。本研究在傳統(tǒng)導赤散藥方的基礎(chǔ)上進行了改良，并對加味導赤散與維生素B12聯(lián)合應(yīng)用后治療大鼠復發(fā)性口腔潰瘍的效果及對血清白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的影響進行了分析比較，為臨床上治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取SPF級雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量180～200 g，平均(190.0±5.0)g，購自河北醫(yī)科大學動物實驗中心，動物許可證號：SCXK(冀)2015-1-004。

1.2 實驗儀器與藥品 完全弗氏佐劑購自美國Sigma公司，左旋咪唑購自武漢合中化工制造有限公司，IL-6、TNF-α檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物公司，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)、丙二醛(MDA)、維生素B12檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。高速離心機購自上海安亭儀器公司，酶標儀購自德國拜發(fā)儀器公司，電子顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，紫外分光光度計購自日本島津儀器公司。

1.3 造模及分組方法 選取36只SD大鼠均于脊柱兩側(cè)皮內(nèi)注射2～3滴抗原乳化液進行造模，每2周1次，共注射5次，剩余12只作為正常組?？乖榛旱闹苽浞椒▍⒄誂vci等[5]方法：大鼠脫頸處死后取口腔黏膜組織，組織勻漿器勻漿后加入pH為7.4的0.1 mol/L PBS緩沖液，每次免疫動物前加入等量完全弗氏佐劑制備成抗原乳化液。所有36只大鼠均造模成功，并采用隨機數(shù)字表法將其分為3組：模型組、陽性對照組和實驗組，各12只。

1.4 藥品制備 加味導赤散組方如下：生地黃10 g、竹葉15 g、生甘草6 g、通草10 g、生石膏30 g；生石膏先打碎后煎3～5 min，藥材加水浸泡30 min后與生石膏一起直火煎沸60 min，取上清液制成1 g/mL藥液，分裝滅菌后備用。

1.5 干預方法 陽性對照組大鼠于造模后以左旋咪唑20 mg/kg進行灌胃治療，1次/d；實驗組大鼠使用含有加味導赤散生藥材1 g/mL的藥液(按1.278 mL/200 g計算)和20 μg/kg維B12聯(lián)合灌胃治療，1次/d；正常組和模型組均給予等量的蒸餾水處理，所有大鼠均連續(xù)治療20 d。

1.6 血清IL-6、TNF-α檢測 取各組大鼠血漿約5 mL，以3 000 r/min離心10 min后取上清液，采用ELISA法檢測血清中IL-6、TNF-α水平，具體檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.7 蘇木素-伊紅(HE)染色 取各組大鼠新鮮口腔黏膜組織，4%多聚甲醛固定后乙醇脫水，石蠟包埋后做連續(xù)切片，HE染色后電鏡下觀察。

1.8 外周血SOD、GSHPx、MDA測定 取各組大鼠眼眶血約5 mL，室溫放置30 min后以3 000 r/min離心10 min后取上清液。分別取少量血清采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性，采用硫代巴比妥酸法檢測MDA水平，采用DINB顯色法檢測GSHPx活性，具體檢測步驟嚴格按照SOD、GSHPx、MDA檢測試劑盒說明書進行。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的復發(fā)性口腔潰瘍情況 陽性對照組、實驗組大鼠的口腔潰瘍數(shù)目、潰瘍持續(xù)時間均顯著低于模型組大鼠(P<0.05)，陽性對照組、實驗組大鼠的潰瘍間隔出現(xiàn)時間均顯著長于模型組大鼠(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠的復發(fā)性口腔潰瘍情況

a：P<0.05，與模型組比較

2.2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α檢測 陽性對照組、實驗組大鼠的血清IL-6、TNF-α檢測水平均顯著低于模型組大鼠(P<0.05)；模型組的血清IL-6、TNF-α檢測水平顯著高于正常組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠的血清IL-6、TNF-α檢測比較

a:P<0.05，與模型組比較;b:P<0.05,與正常組比較

2.3 各組大鼠外周血SOD、GSHPx、MDA檢測比較 模型組的外周血SOD、GSHPx檢測水平均顯著低于正常組(P<0.05)，MDA水平顯著高于正常組(P<0.05)；陽性對照組、實驗組大鼠的外周血SOD、GSHPx檢測水平均顯著高于模型組大鼠(P<0.05),MDA水平顯著低于模型組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠的周血SOD、GSHPx、MDA檢測比較

a:P<0.05，與模型組比較;b:P<0.05,與正常組比較

2.4 HE染色觀察 HE染色，圖1A為正常組，可見正常組大鼠口腔黏膜組織結(jié)構(gòu)完整、有序，黏膜上皮完整、下方為固有層，由致密的結(jié)締組織構(gòu)成。圖1B為模型組，可見黏膜上皮層淋巴細胞浸潤豐富，溶解破潰，潰瘍底部可見豐富的淋巴細胞、中心粒細胞，毛細血管充盈擴張、管壁增厚、血管內(nèi)皮細胞腫脹、腺體增生明顯。圖1C、D分別為陽性對照組、實驗組，HE染色結(jié)果病變程度顯著低于模型組。

A：正常組；B：模型組；C：陽性對照組；D：實驗組

圖1 HE染色結(jié)果(×100)

3 討 論

復發(fā)性口腔潰瘍，又稱“復發(fā)性阿弗他潰瘍”，是臨床上最為常見的口腔黏膜病，其患病率可高達 20%，位居口腔黏膜病的首位[5]。復發(fā)性口腔潰瘍具有周期性、復發(fā)性、自愈性等特點，患者的臨床表現(xiàn)多為口腔黏膜反復出現(xiàn)圓形或橢圓形的淺表潰瘍，可發(fā)于口腔黏膜的任何部位，局部有明顯的灼熱疼痛，妨礙飲食或說話，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[5]。該病的病因較為復雜，其發(fā)病機制尚不清楚，多認為與局部創(chuàng)傷、精神緊張、食物、藥物、激素水平改變及維生素或微量元素缺乏等有關(guān)，而遺傳因素、系統(tǒng)性疾病因素、免疫因素、感染因素、環(huán)境因素等也與其發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系[6-7]。

目前臨床上多采用聯(lián)合用藥的方式治療復發(fā)性口腔潰瘍，如局部使用西瓜霜、云南白藥等噴劑，補充B族維生素，使用左旋咪唑、多抗甲素等抗菌藥物及免疫制劑，但治療效果并不理想，且長期使用左旋咪唑等制劑具有一定的毒性[8]。近年來，中西醫(yī)聯(lián)合治療復發(fā)性口腔潰瘍也開始逐步應(yīng)用于臨床，且全身治療與局部治療相結(jié)合的臨床效果顯著，不良反應(yīng)也較少[9]。中醫(yī)認為復發(fā)性口腔潰瘍?yōu)榛馃嶙C所致，在治療時應(yīng)以清熱瀉火為主，滋陰祛濕、益氣溫陽為輔，其中導赤散為體現(xiàn)清熱利水養(yǎng)陰治法的經(jīng)典基礎(chǔ)方[10]。導赤散主要由生地、木通、甘草、淡竹葉組成，而本研究所用加味導赤散又添加了生石膏，其不但能清熱養(yǎng)陰，還具有清熱瀉火之功效?，F(xiàn)代醫(yī)學研究也表明，生甘草具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用，而竹葉能擴張毛細血管并疏通微循環(huán)，竹葉、生地、通草和石膏中含有的鉀、鎂、錳、鋅等多種微量元素與復發(fā)性口腔潰瘍密切相關(guān)[11]。而維生素 B12對口腔潰瘍的病損有修復作用，其能加速新生組織生長，并具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力[12]。因此，本研究將加味導赤散與維生素B12聯(lián)合后應(yīng)用于口腔潰瘍模型大鼠，并對其治療效果與陽性對照組、模型組和正常組進行了分析比較。

研究結(jié)果表明，陽性對照組、實驗組大鼠的口腔潰瘍數(shù)目、潰瘍持續(xù)時間均顯著低于模型組大鼠，陽性對照組、實驗組大鼠的潰瘍間隔出現(xiàn)時間均顯著長于模型組大鼠；將各組大鼠組織口腔黏膜組織切片進行HE染色后觀察發(fā)現(xiàn)，陽性對照組、實驗組，HE染色結(jié)果病變程度顯著低于模型組，提示加味導赤散與維生素B12聯(lián)合治療對口腔潰瘍的治療效果較好，其可明顯改善大鼠口腔潰瘍癥狀，且其療效與左旋咪唑基本相當。

IL-6、TNF-α均是較為重要的炎性因子，其與口腔潰瘍的發(fā)病過程也有著一定的關(guān)系[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組的血清IL-6、TNF-α檢測水平顯著高于正常組，而陽性對照組、實驗組大鼠的血清IL-6、TNF-α檢測水平均顯著低于模型組大鼠，提示口腔潰瘍的發(fā)生和發(fā)展與炎性反應(yīng)有關(guān)，而加味導赤散聯(lián)合維生素B12與左旋咪唑均具有一定的抗炎作用，進而抑制口腔潰瘍的發(fā)展。

也有研究表明，復發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)病與氧化損傷有關(guān)，其中MDA的增高可導致細胞結(jié)構(gòu)損傷、通透性增高、細胞內(nèi)環(huán)境紊亂及能量代謝障礙，最終導致細胞水腫、破損或溶解[14]；而SOD、GSHPx作為人體的抗氧化防御系統(tǒng)在清除有害氧自由基和改善微循環(huán)方面發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組的外周血SOD、GSHPx檢測水平均顯著低于正常組，MDA水平顯著高于正常組(P<0.05)；而陽性對照組、實驗組大鼠的外周血SOD、GSHPx檢測水平均顯著高于模型組大鼠，MDA水平顯著低于模型組，提示氧自由基的產(chǎn)生和清除失調(diào)與復發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)病有關(guān)，而加味導赤散聯(lián)合維生素B12可上調(diào)SOD、GSHPx水平，進而清除MDA等自由基，促進口腔潰瘍的修復。但本研究限于研究樣本的不足，且對于加味導赤散與維生素B12治療大鼠復發(fā)性口腔潰瘍的不良反應(yīng)仍需作進一步的研究。

綜上所述，加味導赤散與維生素B12對大鼠復發(fā)性口腔潰瘍具有治療作用，作用機制可能與減輕炎性反應(yīng)、提高組織的抗氧化能力有關(guān)。

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Analysis of the changes of serum IL-6 and TNF-α levels in rats with oral ulcer induced by modified red powder and vitamin B12

YinChongzhi1,NieMinhai2△

(1.ChongqingThreeGorgesMedicalCollege，Chongqing404120,China;2.DepartmentofStomatology,StomatologicalHospitalAffiliatedtoSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To investigate the therapeutic effect of modified powder and vitamin B12on the treatment of recurrent oral ulcer in rats and its effect on serum interleukin -6 (IL-6) and tumor necrosis factor alpha(TNF-α).Methods Forty-eight male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into normal group (equal distilled water),model group (equal distilled water),positive control group (levamisole 20 mg/kg gavage) and experimental group (containing dcsgd crude drugs 1 g/mL,1.278 mL/200 g+B1220 g/kg gavage),each group with 12 rats.Model group,positive control group and experimental group were treated with immunological method to establish the recurrent oral ulcer mode.Each group treated with the corresponding treatment methods for 20 days.Results The oral ulcer number,duration time in positive control group and the experimental group were significantly lower than that in model group rats(P<0.05),ulcer interval time was significantly longer than the rats in the model group (P<0.05);the serum IL-6,TNF-α detection level in positive control group and experimental group were significantly lower than in the model group(P<0.05);serum IL-6,TNF-α detection level in model group were significantly higher than those in normal group(P<0.05);the peripheral blood SOD,GSHPx levels in positive control group and experimental group rats were significantly higher than that in model group(P<0.05),the level of MDA was significantly lower than that in model group (P<0.05).Conclusion Modified powder and vitamin B12have therapeutic effects on recurrent oral ulcer in rats.The mechanism may be related to reducing the inflammatory reaction and improving the antioxidant capacity of the tissue.

modified guide red powder;vitamin B12;oral ulcer;interleukin-6;tumor necrosis factor-α

尹崇志(1980-)，主治醫(yī)師，主要從事口腔修復工作。

△通信作者，E-mail:283912880@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.23.007

R780.2

A

1671-8348(2017)23-3192-03

2017-03-20

2017-04-08)

論著·基礎(chǔ)研究