章 春，馮 健，李家富△

(1.重慶市合川區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科 401520；2.西南醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科,四川瀘州 646000)

槲皮素對TNF-α誘導(dǎo)的乳鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖及P38MAPK、HMGB1蛋白表達(dá)的影響

章 春1，馮 健2，李家富2△

(1.重慶市合川區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科 401520；2.西南醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科,四川瀘州 646000)

目的 研究槲皮素對腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖及P38MAPK、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)表達(dá)的影響。方法 通過胰酶消化法和差速貼壁法獲得純化的心肌成纖維細(xì)胞，應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測心肌成纖維細(xì)胞的增殖，采用Western blot法測定P38MAPK、HMGB1蛋白的表達(dá)。結(jié)果 槲皮素對基礎(chǔ)狀態(tài)下的心肌成纖維細(xì)胞的增殖無影響，但對TNF-α誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞的增殖有抑制作用，且各組細(xì)胞的吸光度(A)值隨槲皮素濃度的增加而減小(P<0.05)，各組細(xì)胞P38MAPK、HMGB1蛋白表達(dá)隨槲皮素濃度的增加而減弱(P<0.05)。結(jié)論 槲皮素對TNF-α誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖有一定地抑制作用，其機(jī)制可能是通過P38MAPK信號通路抑制HMGB1的表達(dá)，參與抑制心肌成纖維細(xì)胞的增殖。

槲皮素；成纖維細(xì)胞；心肌;心室重構(gòu)；高遷移率族蛋白類；絲裂素活化蛋白激酶

心臟重塑是臨床多種心血管疾病發(fā)展的終末病理表現(xiàn)，也是引起心功能不全和心力衰竭的內(nèi)在原因。心臟重塑主要包括兩方面的結(jié)構(gòu)變化：心肌肥厚和心肌纖維化。其中，心肌成纖維細(xì)胞(CFs)是致心肌纖維化的主要作用細(xì)胞，心肌成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)沉積是心肌纖維化的主要表現(xiàn)，因此，抑制心肌成纖維細(xì)胞過度增殖是防止或逆轉(zhuǎn)心臟重塑發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵之一。槲皮素屬黃酮類化合物，存在于許多植物的花、葉、果實(shí)中，在心血管疾病治療方面具有廣泛的藥理作用，如降血壓、抗氧化、抗血小板聚集、抗炎等，對心肌肥厚和心肌纖維化也有一定的逆轉(zhuǎn)作用[1-3]。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)作為一種新發(fā)現(xiàn)的晚期炎性介質(zhì)，可誘導(dǎo)細(xì)胞的遷移、分化和再生，導(dǎo)致細(xì)胞骨架重建，介導(dǎo)炎性反應(yīng)，與缺血性心肌病、心肌缺血再灌注損傷、心室重塑等密切相關(guān)[4-6]。因此，本研究旨在探索槲皮素對心肌成纖維細(xì)胞的影響及HMGB1在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 出生1～4 d SPF級SD大鼠乳鼠[由西南醫(yī)科大學(xué)城北動(dòng)物房提供,生產(chǎn)批號SCXK(川)2013-17]，胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶(美國Sigma公司)，重組人腫瘤壞死因子α(TNF-α)(Pepro Tech公司)，槲皮素(產(chǎn)品號1001182803，美國Sigma公司)，DAPI溶液(江蘇碧云天公司)，兔抗大鼠多克隆波形蛋白抗體(Bioworld公司)，羊抗兔異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)，P38MAPK抑制劑(SB203580，江蘇碧云天公司)，P38MAPK抗大鼠單抗、兔抗大鼠HMGB1抗體(Cell Signaling公司)。

1.2 方法

1.2.1 原代CFs培養(yǎng) 在無菌條件下解剖1～4 d SD大鼠乳鼠，取出心臟，放入盛有PBS液的容器中，反復(fù)沖洗，修剪心臟周圍的神經(jīng)、血管、心房等，沖洗干凈，將心臟剪碎，用37 ℃ 0.125%胰蛋白酶消化分離心臟碎塊，用吸管反復(fù)吹打，收集上清液裝入干凈離心管(此步驟反復(fù)，直至碎塊消失)，加入等體積含10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，800 r/min離心5 min,棄上清液，收集細(xì)胞沉淀并用10%胎牛血清制成細(xì)胞懸液，放入37 ℃、5% CO2孵箱中孵育150 min，利用差速貼壁法獲得心肌成纖維細(xì)胞，細(xì)胞生長融合90%以上按1∶2或1∶3消化傳代，將第2～4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞鑒定 用兔抗大鼠多克隆波形蛋白抗體通過免疫熒光法，在熒光顯微鏡下觀察心肌成纖維細(xì)胞的形態(tài)，結(jié)合其生物學(xué)特性鑒定為CFs。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 取生長良好的第2、3代細(xì)胞，設(shè)置成兩部分，第1部分：空白對照組(不加任何干預(yù)因素)、槲皮素各濃度組(25、50、75、100 μmol/L)；第2部分：空白對照組(不加任何干預(yù)因素)、TNF-α組(終濃度為10 ng/mL)、TNF-α+槲皮素各濃度組(25、50、100 μmol/L)、TNF-α+SB203580組(濃度為10 μmol/L)。

1.2.4 四甲基偶噻唑藍(lán)(MTT)法檢測各組細(xì)胞增殖能力 取對數(shù)生長期的CFs，0.25%胰酶消化制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，接種于96孔板(每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次)，藥物干預(yù)24 h，于干預(yù)結(jié)束4 h前，每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL,孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄孔中培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，避光震蕩10 min，在酶聯(lián)免疫吸附儀波長為490 nm處測定各組細(xì)胞吸光度(A)值，了解細(xì)胞增殖情況。

1.2.5 Western blot法檢測各組細(xì)胞P38MAPK、HMGB1蛋白表達(dá) 取出各組細(xì)胞，PBS洗滌3次，加入150～250 μL已配制好的裂解液，冰上靜置15 min，吸去含蛋白的裂解液放入一新EP管，放入4 ℃ 14 000×g低溫離心機(jī)離心15 min，上清液即為蛋白，根據(jù)碧云天BCA法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線測定蛋白濃度，制備蛋白樣品后上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h后用TBST稀釋的抗大鼠P38MAPK單抗(1∶1 000)、兔抗大鼠HMGB1抗體(1∶1 000)、羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗分別孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)熒光顯像，記錄結(jié)果，并用Quantity One軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1 原代心肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 成功分離培養(yǎng)得到的原代CFs生長至第2天，在倒置顯微鏡下觀察呈橢圓形或不規(guī)則形，細(xì)胞體較大，細(xì)胞質(zhì)透明，多核，無自發(fā)性搏動(dòng)(圖1)。經(jīng)染色后的細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察可見：細(xì)胞呈長梭形，細(xì)胞核被染為藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)被染為紅色，結(jié)合波形蛋白強(qiáng)陽性反應(yīng)結(jié)果可確定為CFs(圖2、3)。

圖1 細(xì)胞生長第2天(白光×200)

圖2 熒光顯微鏡下細(xì)胞核(DAPI×400)

圖3 熒光顯微鏡下細(xì)胞質(zhì)(×400)

A：P38MAPK Western blot圖；B：HMGB1 Western blot圖；C：P38MAPK蛋白表達(dá)分析圖；D：HMGB1蛋白表達(dá)分析圖；1：TNF-α組；2：TNF-α+榭皮素 25 μmol/L組；3：TNF-α+榭皮素 50 μmol/L組；4：TNF-α+榭皮素 100 μmol/L組；5：TNF-α+SB203580組；6：對照組。a：P<0.05，與TNF-α組比較；b：P<0.05，與TNF-α+榭皮素 25 μmol/L比較；c：P<0.05，與TNF-α+榭皮素 50 μmol/L組比較；d：P<0.05，與TNF-α+榭皮素 100 μmol/L組比較。

圖4 各組P38MAPK、HMGB1蛋白表達(dá)情況

2.2 槲皮素對各組細(xì)胞增殖能力影響 MTT法檢測不同濃度槲皮素干預(yù)CFs 24 h后的細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示：與對照組(0.270±0.023)比較，槲皮素各濃度組(25、50、75、100 μmol/L槲皮素組A值分別為0.291±0.027、0.278±0.022、0.277±0.025、0.244±0.021)，對基礎(chǔ)狀態(tài)下的CFs增殖無影響(P>0.05)；此外，結(jié)果還得出：與對照組(0.267±0.004)比較，TNF-α能明顯促進(jìn)CFs增殖，與TNF-α組(0.523±0.052)比較，TNF-α+槲皮素各濃度組(TNF-α+25、50、100 μmol/L榭皮素組A值分別為0.375±0.046、0.319±0.052、0.063±0.004)CFs增殖能力減弱，且呈濃度依賴性(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 各組細(xì)胞P38MAPK、HMGB1蛋白表達(dá)情況 Western blot檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，TNF-α組P38MAPK、HMGB1蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)，與TNF-α組比較，TNF-α+槲皮素各濃度組P38MAPK、HMGB1蛋白表達(dá)逐漸下調(diào)，TNF-α+SB203580組的蛋白也明顯下調(diào)(P<0.05)，提示槲皮素能抑制TNF-α誘導(dǎo)的P38MAPK、HMGB1蛋白表達(dá)上調(diào)，且呈濃度依賴性(P<0.05)，可能是通過阻斷P38MAPK信號通路發(fā)揮的作用。見圖4。

3 討 論

在心肌纖維化、心室重塑的形成過程中，心肌成纖維細(xì)胞為其主要作用細(xì)胞，它占心肌組織2/3的成分，參與細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積，與心臟的發(fā)育、結(jié)構(gòu)、細(xì)胞信號傳導(dǎo)等密切相關(guān)。CFs的過度增殖及細(xì)胞外基質(zhì)合成增加將導(dǎo)致心肌纖維化，最后發(fā)展為心力衰竭，嚴(yán)重危害人類健康。目前，越來越多的研究趨向認(rèn)為，心肌纖維化是一種慢性炎性反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展的結(jié)果。CFs在炎性因子的持續(xù)刺激下，可通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活信號通路，分泌更多的炎性介子，發(fā)生炎性級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)心肌纖維化[7-8]。而TNF-α作為一種炎癥性的細(xì)胞因子，當(dāng)其作用于細(xì)胞時(shí)不僅會(huì)加速心肌細(xì)胞凋亡，刺激CFs增殖[9]，還會(huì)促進(jìn)HMGB1的釋放。HMGB1在幾乎所有的細(xì)胞中都有表達(dá)。近年來，HMGB1作為一種新的晚期炎癥因子，成為許多疾病研究的熱點(diǎn)，在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中也受到重視。P38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶家族體系中的亞系成員，在炎性反應(yīng)致心肌纖維化的過程中發(fā)揮了一定的調(diào)控作用[10-11]。有研究利用P38MAPK抑制劑干預(yù)大鼠CFs，成功地抑制Ⅰ型膠原蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶-1的表達(dá)，抑制CFs增殖，推斷P38MAPK信號通路是CFs增殖形成的途徑之一。而HMGB1要發(fā)揮生物學(xué)功能需通過P38MAPK、核因子-κB(NF-κB)等信號通路起作用。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TNF-α不僅能刺激CFs增殖，還能使炎性蛋白HMGB1表達(dá)上調(diào)，并且可能是通過P38MAPK信號通路參與細(xì)胞增殖的。

槲皮素作為一種具有多種心血管藥理作用的藥物而被廣泛研究，其抑制細(xì)胞增殖作用也受到學(xué)術(shù)界關(guān)注。大量的研究顯示，槲皮素對血管緊張素-Ⅱ、轉(zhuǎn)化生長因子-β等多種因素引起的CFs增殖及基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌具有抑制作用[12-14]，從而起抗纖維化作用。研究結(jié)果顯示，槲皮素對正常生理狀態(tài)下的CFs增殖無影響，但呈濃度依賴性地抑制TNF-α誘導(dǎo)的CFs增殖。槲皮素各濃度組P38MAPK、HMGB1蛋白表達(dá)下調(diào)，呈濃度依賴性，加入P38MAPK抑制劑(SB203580)后，可抑制TNF-α促進(jìn)的CFs增殖程度，并部分抑制P38MAPK、HMGB1蛋白表達(dá)。因此，通過P38MAPK途徑TNF-α可促進(jìn)CFs增殖、HMGB1表達(dá)，使膠原蛋白合成增加、炎性反應(yīng)加重，從而導(dǎo)致心肌纖維化。

綜上所述，槲皮素能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的乳鼠CFs增殖，其機(jī)制可能是通過P38MAPK信號途徑，抑制HMGB1蛋白表達(dá)而發(fā)揮作用的，這為槲皮素在今后的臨床干預(yù)、防治心肌纖維化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects of quercetin on proliferation and expression of P38MAPK and HMGB1 protein in neonatal rat cardiac fibroblasts induced by TNF-α

ZhangChun1,FengJian2,LiJiafu2△

(1.DepartmentofCardiology,People′sHospitalofHechuanDistrict,Chongqing401520,China;2.DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To study the effect of quercetin on proliferation and expression of P38MAPK and HMGB1 protein in neonatal rat cardiac fibroblasts induced by TNF-α.Methods Purified cardiac fibroblasts were obtained by trypsin digestion and differential adherence method.The proliferation of cardiac fibroblasts was detected by MTT assay.The expression of P38MAPK and HMGB1 protein was detected by Western blot.Results Quercetin had no effect on the proliferation of cardiac fibroblasts in the basal state but inhibited the proliferation of cardiac fibroblasts induced by TNF-α,and theAvalue of each group was increased with the increase of quercetin concentration(P<0.05).The exspression of P38MAPK、HMGB1 were decresed with the icrease of quercetin.Conclusion Quercetin may inhibit the proliferation of cardiac fibroblasts induced by TNF-α.The mechanism may be inhibit the expression of HMGB1 through P38MAPK signaling pathway.

quercetin;fibroblasts;myocardiu;ventricular remodeling;high mobility group;proteins;mitogen-activated protein kinase

四川省科技廳國際合作項(xiàng)目(2012HH0011)。

章春(1987-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事心血管內(nèi)科工作。

△通信作者，E-mail:516927149@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.23.006

R542.2+3

A

1671-8348(2017)23-3189-03

2017-03-12

2017-04-13)

論著·基礎(chǔ)研究