潘恩山,李煜罡,朱曉光

(南方醫(yī)科大學中西醫(yī)結合醫(yī)院泌尿外科，廣州 510315)

miR-375通過抑制KLF4促進前列腺癌細胞的遷移和侵襲

潘恩山,李煜罡,朱曉光

(南方醫(yī)科大學中西醫(yī)結合醫(yī)院泌尿外科，廣州 510315)

目的 探討miR-375在前列腺癌(PCa)細胞中的表達、作用及機制。方法 培養(yǎng)細胞，轉染質粒，Transwell分析PCa細胞的遷移和侵襲；qPCR分析miR-375、KLF4 mRNA在PCa細胞中的表達；Western blot分析KLF4蛋白在PCa細胞中的表達；生物信息學分析miR-375的靶基因，雙熒光素酶實驗驗證。結果 miR-375在PCa中高表達，抑制miR-375的表達顯著抑制PCa細胞的遷移和侵襲；通過生物信息學分析miR-375的潛在靶基因含有KLF4，雙熒光素酶實驗驗證KLF4為miR-375的靶基因；KLF4在PCa細胞中表達顯著降低，抑制miR-375的表達能夠顯著促進KLF4蛋白的表達；進一步研究表明抑制KLF4表達可逆轉miR-375 抑制物對PCa細胞的遷移侵襲的抑制作用。結論 miR-375抑制KLF4的表達促進PCa的遷移和侵襲，發(fā)揮癌基因的作用；其可以作為PCa的治療靶點，為PCa的治療提供新的方向。

miR-375;KLF4;前列腺腫瘤;細胞運動;腫瘤侵潤

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是一種嚴重威脅男性生命的惡性腫瘤，在美國、歐洲乃至全世界PCa的發(fā)病率在男性惡性腫瘤中排第2位，僅次于肺癌，其導致的死亡排第5位[1]。PCa在中國的發(fā)病率遠低于西方國家，但是近年來也呈逐年上升的趨勢。據(jù)全國2004-2005年第3次死因回顧抽樣調查發(fā)現(xiàn)，PCa導致的死亡排第13位，其病死率遠低于世界平均水平，然而與1990-1992年死因調查結果相比病死率上升了209.84%；2003-2007 年中國PCa發(fā)病率為8.60/10萬，病死率為3.29/10萬，分別位列第7位和第12位，比2004-2005進一步增加[2]。而至2011年調查發(fā)現(xiàn)PCa在全部癌癥發(fā)病和死亡構成進一步增加[3]。PCa的發(fā)病可能與生活方式、壽命延長、人口老齡化及前列腺特異性抗原(PSA)早期診斷技術的提高有關；而PCa的死亡則和初診患者已局部進展或遠處轉移，喪失了根治性治療的機會相關[4]。由于PCa易發(fā)生遠處轉移，尤其是骨轉移，所以尋找抑制PCa轉移的治療靶點具有重要的意義。

微RNA(microRNA,miRNA)與PCa的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關系。有研究表明miR-146b、miR-320a等在PCa中表達下調，過表達能夠誘導PCa細胞的凋亡，抑制PCa的增殖、遷移和侵襲，在PCa中發(fā)揮抑癌基因的作用[5-6]。而miR-301a、miR-449a和miR-221等在PCa中表達上調，抑制其表達能夠抑制PCa的增殖、遷移和侵襲，在PCa中發(fā)揮癌基因的作用[7-9]。以上研究表明miRNA在PCa中發(fā)揮著癌基因或者抑癌基因的作用，具有很好的穩(wěn)定性和特異性，可以作為潛在的新型腫瘤標志物和治療靶點。miR-375是miRNA的一種，有研究表明miR-375在PCa組織中的表達顯著增加[10]，和PCa的發(fā)生、轉移密切相關，能夠作為早期診斷的標志物[11-12]。miR-375還能通過miR-93/miR-106b/miR-375-CIC-CRABP1信號通路調節(jié)PCa的增殖[13]，但是對miR-375能否調節(jié)PCa的遷移和侵襲及其機制仍不清楚。

本研究通過檢測miR-375在PCa細胞中的表達，明確miR-375在PCa細胞遷移和侵襲中的作用，同時分析miR-375作用的靶基因及信號通路，探討miR-375調節(jié)PCa的遷移和侵襲的機制，為轉移的PCa的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 人正常前列腺上皮細胞RWPE-1和PCa細胞LNCaP、DU145、PC3均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)；10%胎牛血清購自美國Gibco公司；RPMI-1640基礎培養(yǎng)基、TRIzol試劑、Lipofectamine RNAi MAX和Lipofectamine 2000、has-miR-375抑制物、has-miR-375 mimic購自美國Invitrogen公司；siRNA-KLF4合成于上海吉瑪制藥技術有限公司；所有引物購自上海生物工程有限公司；KLF4野生型3′-UTR和突變型3′-UTR由蘇州金唯智合成并連接到psi-CHECK-2載體；TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit購自美國ABI公司；抗KLF4抗體購自美國Abcam公司；其他生化試劑購自上海生物工程有限公司及Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) RWPE-1、LNCaP、DU145和PC3均在含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素G和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中37 ℃、5% CO2進行培養(yǎng)。當細胞融合度大約為80%時用胰酶消化進行傳代。

1.2.2 載體構建及轉染 將處于對數(shù)生長期的PCa細胞種植于6孔培養(yǎng)板中(每孔大約1×105個細胞)，第2天觀察細胞融合度大約為50%時開始進行轉染。采用Lipofectamine RNAi MAX分別轉染300 nmol/L miR-NC、miR-375抑制物至PCa細胞，或者共轉染300 nmol/L miR-375抑制物和10 μmol/L siRNA-KLF4或者si-NC至PCa細胞，轉染步驟參照Lipofectamine RNAi MAX說明書。

1.2.3 實時熒光定量PCR(qPCR)檢測miRNA及相應基因miRNA表達 收集細胞樣品，加入1 mL Trizol提取液提取細胞總RNA。逆轉錄采用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit；cDNA逆轉錄采用TaqMan Reverse Transcription Reagents、200 ng總RNA及Oligo dT；操作嚴格按照試劑操作說明書。采用SYBR Green法用于qPCR檢測。反應體系為：cDNA 5.0 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 4.0 μL,總反應體積為 20 μL。PCR 擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 30 s，進行40個循環(huán)。相對表達水平采用2-ΔΔCt進行計算。每份樣品重復測量3次。檢測引物見表1。

表1 qRT-PCR檢測引物序列

1.2.4 Western blot檢測 12 000 r/min離心10 min收集細胞，吸凈上清后留沉淀。沉淀中直接加入細胞裂解液，冰上充分裂解。BCA法測定總蛋白濃度，10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白，電泳結束后取出分離膠進行轉膜，加入轉膜緩沖液，恒定電流0.5 A轉膜2 h。室溫下，將聚偏氟乙烯(PVDF)膜放入5%脫脂奶粉中封閉1 h。然后將PVDF膜放入10 mL稀釋過的抗KLF4抗體(1∶2 000)中4 ℃過夜。去除抗KLF4抗體，30 mL 1×TBST洗膜3次，每次5 min。加入10 mL稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h。30 mL 1×TBST洗膜3次，每次5 min，暗室進行曝光。灰度采用Image J分析。

1.2.5 細胞遷移和侵襲檢測 PCa的遷移檢測：將Transwell侵襲小室置入24孔板中，在Transwell小室的下室加入含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，收集轉染后的PCa細胞重懸，加入200 μL重懸液(共5×104個細胞)到Transwell小室的上室；細胞培養(yǎng)24 h，取出小室，用棉簽將上室內(nèi)部擦干凈，小室的下表面用PBS浸泡清洗。首先以4%多聚甲醛溶液固定細胞，然后0.1%結晶紫染色液染色，自來水沖洗3次，顯微鏡下拍照，并隨機選取6個不同區(qū)域，計算每個視野內(nèi)穿過濾膜的細胞數(shù)，取平均數(shù)為遷移細胞數(shù)。PCa的侵襲檢測：首先在孔徑為8 μm的Transwell侵襲小室微孔膜表面均勾涂抹20 μL 0.5 g/L Matrigel人工基質膠，37 ℃放置30 min使其聚成凝膠狀。其余操作步驟同遷移檢測。

1.2.6 雙熒光素酶實驗檢測靶基因 miR-375使用預測軟件miRDB(http://www.mirdb.org/miRDB/)和Targetscan(http://www.targetscan.org)進行靶基因預測，發(fā)現(xiàn)KLF4 mRNA可能為miR-375的靶基因。為了確定KLF4 mRNA的3′-UTR是否為miR-375的直接靶蛋白，KLF4 mRNA的野生型全長3′-UTR 及突變型3′-UTR合成并連接到psi-CHECK-2載體，分別命名為KLF4-WT和KLF4-MUT。PCa細胞共轉染200 nmol/L miR-NC或miR-375抑制物和100 ng質粒(KLF4-WT或者KLF4-MUT)，24孔板培養(yǎng)48 h。收集細胞裂解，海腎(Renilla)和螢火蟲(firefly)熒光素酶熒光強度使用Dual-Luciferase雙熒光報告分析系統(tǒng)進行分析。

2 結 果

2.1 miR-375在PCa細胞中的表達 采用qPCR檢測miR-375在PCa細胞中的表達。miR-375在正常前列腺細胞RWPE-1及PCa細胞LNCaP、PC3和DU145中的相對表達量分別為1.000±0.000、2.580±0.376、3.760±0.428和6.210±0.573，單因素方差分析結果顯示差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。和RWPE-1相比，LNCaP、PC3和DU145中miR-375表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中以DU145中miR-375表達量最高，采用DU145作為實驗細胞進行后續(xù)實驗。見圖1。

a：P<0.05，與RWPE-1比較。

圖1 miR-375在RWPE-1、LNCaP、PC3和DU145中的表達

2.2 miR-375抑制物降低miR-375的表達 采用qPCR檢測miR-375抑制物對miR-375在DU145中表達的影響，結果圖2所示。miR-375在Si-NC組和miR-375抑制物組中的相對表達量分別為1.000±0.000和0.240±0.088，與Si-NC組比較，miR-375抑制物組中miR-375表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。miR-375抑制物能夠顯著降低miR-375在DU145中的表達。

2.3 miR-375抑制物抑制DU145細胞的遷移侵襲 Si-NC和miR-375抑制物轉染48 h后采用Transwell檢測DU145細胞的遷移和侵襲能力，圖3所示。Si-NC組和miR-375抑制物組的遷移細胞數(shù)分別(355±78)個和(168±43)個，與Si-NC組比較，miR-375抑制物組遷移細胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；表明抑制miR-375的表達能夠抑制DU145的遷移。進一步研究發(fā)現(xiàn)Si-NC組和miR-375抑制物組的侵襲細胞數(shù)分別(223±45)個和(110±26)個，與Si-NC組比較，miR-375抑制物組侵襲細胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明抑制miR-375的表達能夠抑制DU145的侵襲。

a:P<0.05

圖2 miR-375抑制物抑制miR-375的表達

a:P<0.05

圖3 miR-375抑制物抑制DU145細胞的遷移侵襲

A：生物信息學分析KLF4 mRNA 3′UTR存在的miR-375結合位點；B：Western blot檢測KLF4在PCa細胞中的表達，a表示P<0.05(與RWPE-I比較)；C：KLF4-WT組和KLF4-MUT組的熒光素酶相對活性檢測，a表示P<0.05；D：Western blot檢測KLF4-WT+miR-NC和KLF4-WT+miR-375組KLF4蛋白表達；E：qPCR檢測KLF4-WT+miR-NC和KLF4-WT+miR-375組KLF4 mRNA表達

圖4 在DU145細胞中驗證KLF4為miR-375的靶基因

2.4 miR-375的靶基因為KLF4 通過軟件預測發(fā)現(xiàn)KLF4可能是miR-375的潛在靶基因，結果如圖4A所示。采用Western blot檢測KLF4在PCa細胞中的表達，結果如圖4B所示。KLF4在正常前列腺細胞RWPE-1及PCa細胞LNCaP、PC3和DU145中的相對表達量分別為1.000±0.000、0.530±0.076、0.389±0.042和0.210±0.043，單因素方差分析結果顯示差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與RWPE-1比較，LNCaP、PC3和DU145中KLF4的表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。miR-375和KLF4的表達趨勢相反，說明KLF4可能被miR-375負調控。為了進一步證明KLF4是miR-375的靶基因，采用雙熒光素酶實驗檢測，結果如圖4C所示。KLF4-WT+miR-NC組和KLF4-WT+miR-375組的熒光活性變化倍數(shù)分別為1.000±0.000和0.240±0.085，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。KLF4-MUT+miR-NC及KLF4-MUT+miR-375組的熒光活性變化倍數(shù)分別為0.930±0.052 和0.890±0.095，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。同時采用qPCR檢測KLF4-WT+miR-NC組和KLF4-WT+miR-375組的KLF4 mRNA分別為1.000±0.000和0.940±0.054，兩者相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，結果如圖4E所示。同時采用Western blot 檢測KLF4-WT+miR-NC組和KLF4-WT+miR-375組的表達發(fā)現(xiàn)KLF4蛋白表達顯著降低，結果如圖4D所示。以上數(shù)據(jù)說明miR-375可與KLF4的3′-UTR區(qū)上的位點結合，miR-375與KLF4存在直接調控關系。

2.5 抑制KLF4表達能夠逆轉miR-375抑制物對DU145細胞的遷移侵襲的抑制作用 本研究發(fā)現(xiàn)miR-375抑制物能夠促進KLF4的表達，結果如圖5所示。為了進一步研究miR-375和KLF4的關系，本研究在轉染miR-375抑制物的同時轉染si-KLF4，抑制KLF4的表達，分析共轉染miR-375抑制物和si-KLF4對DU145細胞的遷移侵襲的影響。共轉染miR-375抑制物和si-KLF4能夠顯著降低KLF4的表達，結果如圖5B所示。共轉染48 h后采用Transwell檢測DU145細胞的遷移和侵襲能力。miR-375抑制物+si-NC組和miR-375抑制物+si-KLF4組的遷移細胞數(shù)分別(141±47)個和(325±78)個，結果如圖6A～C所示。miR-375抑制物+si-NC組和miR-375抑制物+si-KLF4組的侵襲細胞數(shù)分別(123±31)個和(256±48)個，結果如圖6D～F所示。和miR-375抑制物+si-NC組相比，miR-375抑制物+si-KLF4組遷移侵襲細胞數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。抑制KLF4的表達能夠逆轉miR-375抑制物對DU145細胞的遷移侵襲的抑制作用。

A：Western blot檢測miR-NC和miR-375抑制物組KLF4的表達；B：Western blot檢測共轉染miR-375抑制物和si-KLF4(或Si-NC)組KLF4的表達，a：P<0.05

圖5 不同組的KLF4表達

A～C:細胞遷移實驗；D～F:細胞侵襲實驗

圖6 抑制KLF4表達能夠逆轉miR-375抑制物對DU145細胞的遷移侵襲的抑制作用

3 討 論

本研究結果表明miR-375在PCa細胞中的表達顯著升高，和以往的研究相同[11]。同時本研究結果表明miR-375在DU145細胞中表達比其他PCa細胞PC3和LNCaP中的表達高，根據(jù)文獻報道，這3種細胞的轉移能力從小到大依次為LNCaP、PC3和DU145細胞，該結果說明miR-375的表達和PCa的遷移和侵襲存在關系，和Nguyen等[14]研究的結果類似，其結果表明miR-375在高轉移PCa組織中表達最高，其次為低轉移PCa和未轉移PCa。

miR-375在癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程中可能扮演癌基因或者抑癌基因的作用。Shi等[15]研究表明在骨肉瘤中miR-375能夠通過抑制PIK3CA從而抑制PI3K/AKT信號通路，抑制骨肉瘤細胞的增殖，扮演抑癌基因的角色。在結腸癌中，有研究表明miR-375能夠抑制KLF4的表達從而抑制結腸癌細胞的增殖[16]，而另有研究表明miR-375能夠抑制PHLPP1的表達從而促進結腸癌細胞的西妥昔單抗耐藥性[17]。miR-375在PCa中能夠抑制PCa細胞的增殖[13,18]，但是對遷移和侵襲的作用還不清楚。本研究結果表明miR-375抑制物能夠顯著抑制miR-375的表達，抑制miR-375的表達能夠顯著抑制PCa細胞的遷移和侵襲。從該結果來看，miR-375在PCa中發(fā)揮癌基因的作用。

為了進一步了解miR-375在PCa中發(fā)揮癌基因的作用機制，本研究通過生物信息學分析表明KLF4為miR-375的潛在的作用靶點。為了驗證該分析，本研究采用雙熒光素酶分析驗證，結果表明miR-375+KLF4-WT組的相對熒光素酶活性顯著抑制而miR-375+KLF4-MUT組的相對熒光素酶活性無顯著變化，這表明miR-375和KLF4 3′ UTR之間存在相互聯(lián)系；進一步分析發(fā)現(xiàn)miR-375+KLF4-WT組的KLF4 mRNA無顯著變化，而KLF4的蛋白表達顯著降低，說明miR-375不影響KLF4的mRNA水平，而是直接影響KLF4的翻譯。該結果表明在PCa細胞中KLF4是miR-375作用的靶基因。有研究表明在結腸癌中KLF4是miR-375作用的靶基因，影響結腸癌的增殖[16]。

KLF4在生物體中有著廣泛的功能，在腫瘤中發(fā)揮著癌基因或者抑癌基因的作用。在結腸癌、胃癌及肝癌等癌癥中發(fā)現(xiàn)KLF4表達降低，而在原發(fā)性乳腺導管癌、口腔鱗癌中KLF4的表達升高。Li等通過研究證實KLF4對皮膚癌細胞的增殖、遷移和黏附能力具有抑制作用，KLF4在皮膚癌中可能是一個抑癌基因[19]。在肝癌中，KLF4通過結合其他轉錄抑制因子共同抑制Slug的轉錄，調節(jié)細胞上表皮間質化(EMT)進程，抑制肝癌細胞的遷移和侵襲能力并發(fā)揮其抑癌作用[20]。在乳腺癌中，KLF4高表達進而調節(jié)靶基因的表達，最終影響細胞增殖及凋亡，并促發(fā)腫瘤的形成，發(fā)揮癌基因的作用[21]。本研究表明在PCa中miR-375能夠抑制KLF4的表達，尤其在高轉移的PCa細胞DU145中，KLF4表達顯著降低。抑制miR-375表達能夠促進KLF4的表達。抑制miR-375表達的同時抑制KLF4的表達能夠促進PCa的遷移和侵襲，表明抑制KLF4的表達能夠促進PCa的遷移和侵襲。Wang等[22]研究表明KLF4能夠抑制PCa的增殖、遷移和侵襲。另有研究表明，抑制KLF4的表達能夠促進PCa細胞的遷移和侵襲[23]，與本研究結果類似。

總之，本研究表明miR-375能夠抑制KLF4的表達促進PCa的遷移和侵襲，發(fā)揮癌基因的作用。本研究進一步表明miR-375可以作為PCa的治療靶點，為PCa轉移的治療提供新的方向。

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miR-375 promotes prostate cancer cell migration and invasion by targeting KLF4

PanEnshan,LiYugang,ZhuXiaoguang

(DepartmentofUrology,TCM-IntegratedCancerofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou，Guandong510315,China)

Objective To explore the expression,role and mechanism of miR-375 in prostate cancer (PCa) cells.Methods PCa cells were cultured and transfected with plasmid,the migration and invasion of PCa were detected by Transwell;the expression of miR-375 and KLF4 mRNA were detected by qPCR;the expression of KLF4 were detect by Western blot;the potential target genes of miR-375 were analyzed by bioinformatics and verified by dual luciferase report.Results The expression of miR-375 were significantly up-regulated in the PCa;Inhibited the expression of miR-375 could significantly inhibit the migration and invasion of PCa cells.KLF4 was the potential target genes of miR-375,which verified through bioinformatics analysis and dual luciferase report.The expression of KLF4 were significantly down-regulated in the PCa.Inhibited the expression of miR-375 could significantly up-regulated the expression of KLF4.Inhibited the KLF4 expression was able to reverse the suppressive effect miR-375 has on the migration and invasion of PCa cells.Conclusion miR-375 promotes the migration and invasion of PCa via inhibiting the expression of KLF4 and play the oncogene role.MiR-375 can be used as therapeutic targets for PCa,and provide a new direction for the treatment of PCa.

microRNA 375;KLF4;prostatic neoplasms;cell movement;neoplasm invasiveness

潘恩山(1979-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事中西醫(yī)結合治療泌尿男性疾病研究。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.23.005

R737.25

A

1671-8348(2017)23-3184-05

2017-03-28

2017-05-19)

論著·基礎研究